humane T-celler udtrykker CD25 og Rævp3 ved aktivering og udviser effektor/hukommelsesfænotyper uden nogen regulerende/suppressorfunktion

aktivering af T-celler inducerer ekspression af CD25 og Rævp3 forbundet med effektor-og hukommelsesfænotypedifferentiering

PBMC blev stimuleret med bryostatin-1 (5 nM), og Ionomycin (1 liter) (B/I) i nærvær af 80 U/ml IL-2 (peprotech) i 16 timer. B / i-aktivering efterligner intracellulære signaler, der resulterer i T-celleaktivering ved henholdsvis at øge proteinkinase C-aktivitet og intracellulært calcium . Celler blev vasket tre gange og dyrket ved 106 celler/mL i komplet medium med 40 U/mL IL-2 (Peprotech) i 3 dage, og ekspression af Rævp3 blev bestemt ved anvendelse af strømningscytometrianalyse. Ekspression af Rævp3 blev også bestemt på frisk isolerede T-celler på dag 0. Som vist i Fig. 1A (Toppanel) øgede tilstedeværelsen af IL-2 alene i 3 dage ikke markant ekspressionen af Rævp3 eller CD25 over baseline-niveauerne på dag 0 (Fig. 1C). B / i-aktiveringen inducerede imidlertid Rævp3-og CD25-ekspression i CD4+ – og CD8+ T-celler (Fig. 1A, midterste panel). Ved aktivering af B/I blev CD4+CD25+Rævp3+ T-celler forøget fra 1% til 23% (P = 0,016), og CD8+CD25+Rævp3+ T-celler blev forøget fra 0,6% til 9% (P = 0,013). Udvidelse af kultur i nærvær af IL – 2 i 6 dage uden yderligere stimulering beholdt CD4+CD25+Rævp3+ T-celler over baseline-niveauerne i ikke-aktiverede T-celler (1% mod 7%; P = 0,031), mens CD8+CD25+Rævp3+ T-celler faldt til baseline-niveauer (0,6%). Disse resultater antyder, at aktiveringsinduceret ekspression af Rævp3 i CD4+CD25+ T-celler er mere stabil end i CD8+CD25+ T-celler. Det absolutte antal T-celler steg 3 og 6 dage efter b/I-stimuleringen og ekspansionen i nærvær af IL-2 (Fig. 1B). Aktivering af T-celler ved hjælp af anti-CD3 / CD28 Abs i 3 dage gav lignende resultater som for B/i-aktivering ved at øge CD4+CD25+Rævp3+ T-celler fra 0,4% til 8,7% (Fig. 1C). Fænotypeanalyser af T-celler afslørede CD44 + effektor og CD44+CD62L+ hukommelsesfænotyper før og 6 dage efter b/i-aktiveringen (Fig. 1D, øverste panel). Mens effektor CD4+ og CD8 + T-celler blev reduceret efter aktivering (henholdsvis 18% til 9% og 21% til 13%), blev hukommelsen CD4+ og CD8+ T-celler forøget (henholdsvis 82% til 91% og 79% til 87%). Ved B / i-aktivering viste CD4+ T-celler en 6 gange forøgelse af Rævp3-ekspression i CD44+, CD62L+ fænotyper (CD44+: 2,6% til 15%; CD62L+: 2% til 12%). Derudover viste både CD4+ og CD8+ T-celler Rævp3høj ekspression efter aktivering sammenlignet med Rævp3lavt ekspression på dag 0 (Fig. 1D, midterste og nederste paneler). Alle CD4+ Rævp3 + T-celler udtrykte CD44, hvoraf 80% også udtrykte CD62L (Fig. 1D, midterste panel, yderst til højre). Disse data viser, at 20% af CD4+Rævp3+ T-celler er effektor og 80% er hukommelsesfænotyper. En lignende fænotypisk tendens blev påvist for CD8 + Rævp3 + T-celler, der viste 100% CD44+, hvoraf 67% var CD62L+ T-celler (Fig. 1D, Bundpanel, yderst til højre). Disse resultater viser, at 33% af CD8+Rævp3+ T-celler er effektor og 67% er hukommelsesfænotyper. Data præsenteret i fig. 1A-d antyder, at øget ekspression af Rævp3høj i effektor T – celler skyldtes celledifferentiering snarere end celleproliferation, fordi relativ procent af CD44+CD62L-effektor T-celler faldt efter b/i-aktivering. Lignende mekanisme kan eksistere i hukommelse T-celler på grund af ekspressionen af Ræv3høj efter aktivering sammenlignet med Ræv3lav på dag 0.

Aktiveringsinduceret Rævp3-ekspression i CD4+ T-celler overfører ikke regulerende funktion in vitro

T-celler blev mærket med CFSE og stimuleret med anti-CD3 (1 ug/ml) og anti-CD28 (1 ug/ml) Abs i nærvær eller fravær af den B/I-aktiverede CD4+CD25+rævp3+ T-celler (2:1 og 20:1 responder:suppressor ratio) i 3 dage. Strømningscytometrianalyse viste lignende proliferationshastigheder for gated CD8 + T-celler i fravær eller tilstedeværelse af inducerbare Rævp3+ T-celler (Fig. 2A, 60% mod 61% og 65%). CD3 / CD28-aktiveringen inducerede også Rævp3-ekspression i responder CD4+ T-celler. Gated CD4+ Fpsp3 + T-celler viste også 70-75% proliferation ved aktivering (Fig. 2A). Analyse af T-celle apoptose afslørede lignende satser for apoptose i responder T-celler i fravær eller tilstedeværelse af CD4+Rævp3+ T-celler (Fig. 2B, 57% vs. 57 og 59%). Størstedelen af de B/i-aktiverede CD4+Rævp3+ T-celler (74-76%) viste sig at være apoptotiske under anti-CD3 / CD28-aktivering i co-kultur med responder T-celler.

allogen aktivering af T-celler under MLR inducerer Rævp3-ekspression i CD4+CD25+ T-celler associeret med effektor/hukommelsesfænotype

Vi udførte en 8-dages allogen MLR for at bestemme, om induktion af Rævp3-ekspression i T-celler var stabil under MLR, og om en sådan induceret Rævp3+ ekspression kan hæmme t-celleproliferation. Responder-og stimulatorceller blev opnået fra forskellige raske donorer. Stimulatorceller blev bestrålet (5000 rad) og dyrket med responderceller i 8 dage i nærvær af 10 liter brdu (Bd Pharmingen). Celler blev derefter farvet med relevant Abs og udsat for strømningscytometrianalyse. Som vist i Fig. 3A (Toppanel) 86% af CD4+CD25+ T-celler og 93% af CD8+CD25+ T-celler viste brdu-inkorporering som et resultat af celleproliferation. Der blev ikke påvist nogen proliferation i responder-eller stimulatorcellerne alene (data ikke vist). En sådan allogen proliferation fandt sted i nærvær af en aktiveringsinduceret Rævp3-ekspression i CD4+ T-celler, således at 8% af CD4+ T-celler var CD25+Rævp3+ (Fig. 3A, Bundpanel). CD8 + CD25 + T-celler viste på den anden side ikke stabilt udtryk for Rævp3. Disse resultater er i overensstemmelse med vores observation i Fig. 1 viser, at ekspressionen af Rævp3 i CD4+ T-celler er mere stabil end i CD8+ T-celler 6-8 dage efter T-celleaktivering. I tidligere rapporter blev suppressive assays in vitro udført i nærvær af høje forhold mellem CD4+CD25+ T-celler (Tregs) til responder-celler for at bestemme den undertrykkende funktion ved T-celleaktivering og proliferation. Sådanne kunstige stigninger i forholdet mellem CD4+CD25+ T-celler og responderceller ville reducere in vivo-gyldigheden af observationen. Hyppigheden af CD4 + CD25+ Rævp3 + T-celler induceret under MLR var 8%, hvilket anses for at ligge inden for det fysiologisk relevante interval som rapporteret af andre grupper . Hyppigheden af naturligt forekommende Treg ‘ er i mus er også omkring dette interval, men har regulatoriske virkninger for inhiberingen af autoimmunitet. Hvis Rævp3, der udtrykker CD4 + T-celler, havde nogen regulerende funktion, skulle det have hæmmet celleproliferation under kulturen in vitro. Svarende til B / i-induceret t-celleaktivering inkluderede t-cellefænotyper i en MLR CD44+ effektor (16%) og CD44+CD62L+ hukommelses-T-celler (84%) (Fig. 3B). Igen udtrykte alle CD4+ Rævp3 + T-celler CD44, hvoraf 90% også udtrykte CD62L (Fig. 2B). Disse data viser, at 10% af CD4+Rævp3+ T-celler er effektor og 90% er hukommelsesfænotyper. En lignende fænotypisk tendens blev påvist for CD8 + Rævp3 + T-celler, der viste 100% CD44+, hvoraf 76% var CD62L+ T-celler. Disse resultater viser, at 24% af CD8+Rævp3+ T-celler er effektor og 76% er hukommelsesfænotyper. Manglende regulerende funktion i disse Rævp3 + T-celler kan skyldes deres effektor / hukommelsesfænotype, da det er rapporteret, at ekspression af Rævp3 i humane hukommelses-T-celler resulterede i nedsat suppressoraktivitet . Derudover giver treg type 1 (Tr1) celler suppressorfunktion i fravær af Rævp3-ekspression . I betragtning af Rævp3 ‘ s rolle som master regulator for treg lineage engagement og vedligeholdelse i mus ser det ikke ud til at have en sådan bona fide regulerende funktion for Treg lineage engagement i humane T-celler.