4.3 BBB-krydsende bsAbs konstrueret med enkeltdomæne antistoffer
sdAbs er små (15 kDa), monomere antigenbindende fragmenter af antistoffer, der giver forskellige fordele i forhold til andre antistoffragmenter som “byggesten” for bsAbs. De forekommer i naturen som den antigenbindende del af tunge kædeantistoffer i kamelidarter (kaldet VHH) og bruskfisk (kaldet VNAR) eller kan genereres fra konventionelle IgG ‘ er ved at opnå eller konstruere monomere, stabile VH-eller VL-domæner (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; afdeling, g Krissov, Griffiths, Jones, & vinter, 1989). sdab ‘ er er meget stabile og kompakte, og de kan få adgang til forsænkede epitoper i proteiner, såsom receptorhulrum eller de aktive steder, som ofte er “skjult” fra konventionelle IgG ‘ er og kan opnå målbindingsaffiniteter, der kan sammenlignes med konventionelle antistoffer., 1998; Staus et al., 2014). Disse monomere antigenbindende enheder parres ikke med lette kæder, hvilket gør dem til fremragende byggesten til heterodimeriserede bsab ‘ er, da de undgår vanskeligheder med forkert lyskædeparring (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimeriske bsab ‘ er kan oprettes med en eller begge “arme” som sdAb, hvor sidstnævnte er ens i struktur til kamelide tungkædede antistoffer (Fig. 3E). sdab ‘ er kan også anvendes i forskellige mono-, bi-eller tetravalente fusioner med konventionelle terapeutiske antistoffer eller Fabs (Fig. 3e), hvilket generelt resulterer i mindre, mindre komplekse molekyler sammenlignet med dem, der genereres med scfv ‘ er eller Fabs som byggesten, som har tendens til at være biofysisk velopdragen og let at producere (Holliger & Hudson, 2005). Humanisering af VHH ‘er såvel som konstruktion af sdab’ er er godt beskrevet, hvilket gør det muligt let at generere menneskelige(iserede) sdab ‘ er med optimal målaffinitet og ekstraordinære biofysiske egenskaber (Vincke et al., 2009).
for at evaluere den potentielle anvendelse af camelid VHH FC5 som en BBB-bærer inden for bispecifikke CNS – målrettende antistoffer blev monovalente og bivalente fusioner (N-og C-terminal) af FC5 med human Fc designet og evalueret in vitro og in vivo (Farrington et al., 2014). Tilsyneladende bindingsaffinitet (Kdapp) til rotte BEC af den bivalente fc5fc-fusion var 75 nM, hvorimod monovalent FC5Fc-binding var i det mikromolære område. Analyserne af tilsyneladende transmigrationshastigheder (Papp) på tværs af en in vitro BBB-model, tilsyneladende CNS – eksponering afledt af serum/CSF-farmakokinetik af systemisk administrerede antistofkonstruktioner og farmakologiske reaktioner fremkaldt af kemisk konjugerede BBB-uigennemtrængelige neuroaktive peptider i Hargreaves smertemodel, forudsat bevis for forbedret BBB-transport af disse store (75 kDa) antistofmolekyler medieret af FC5: (1) in vitro Papp-værdier var ~ 200 cm/min for både mono-og bivalente N-terminale Fc-fusionsmolekyler (FC5Fc) sammenlignet med 4-8 cm/min for kontrol VHH A20.1FC-eller EG2Fc-fusioner; (2) den tilsyneladende CNS-eksponering af FC5Fc–fusionen var 30 gange højere sammenlignet med kontroldomæne-antistof–Fc-fusioner; (3) systemisk farmakologisk styrke af FC5Fc-konjugater med neuropeptider dalargin eller galanin i Hargreaves inflammatorisk smertemodel var op til 60 gange højere sammenlignet med monomere FC5-neuropeptidkonjugater. Dette resultat blev tilskrevet den lange cirkulationshalveringstid (~ 96 timer) for FC5Fc-sammenlignet med FC5-neuropeptidkonjugater; (4) forskellige kontrol-VHH-Fc neuropeptidkonjugater viste ingen systemisk effekt; (5) fusion af FC5 til Fc ‘ s C-terminal resulterede i svækket BBB-krydskapacitet. I modsætning til TFR-målretning mod BBB – bærerantistoffer viste både mono-og bivalente fc5fc-fusionsproteiner en lignende hastighed af transcytose in vitro, lignende plasma/CSF-farmakokinetiske profiler og lignende systemisk styrke i farmakodynamikmodellen in vivo på trods af forskelle i tilsyneladende bindingsaffinitet og Valens (Farrington et al., 2014). Disse undersøgelser viste, at BBB-krydsende enkeltdomæne antistof FC5 kan anvendes som en platform BBB-bærer i begge heterodimeriserede “halvantistoffer” og som den lettere skalerbare bi-eller tetravalente fusion til konventionelle IgG ‘ er (Farrington et al., 2014).
en anden potentiel fordel ved VHHs som BBB-bærere er deres naturlige modstand mod ekstreme biofysiske udfordringer, såsom temperatur og pH, samt til protease nedbrydning (Kim et al., 2014), ofte stødt på i forskellige endocytiske rum under transcytose. Både FC5 og FC5Fc fusioner internaliseres i BEC via clathrin-coatede vesikler og sorteres til tidlige endosomer. Interessant nok blev FC5 også fundet at stimulere udgydelse af ekstracellulære mikrovesikler (eksosomer) fra BEC (Hakkani, Caram-Salas, et al., 2013; Delaney, et al., 2013), hvor både FC5 og øgede niveauer af dens formodede receptor Cdc50A blev påvist ved vestlig blot og målrettet massespektrometri. Denne undersøgelse antydede, at kaste eksosomer kan være den endelige vesikel af RMT-vejen frigivet fra den abluminale overflade, der bærer receptor-antistofkomplekset (skematisk vist i Fig. 4). RMT-stien og eksosomdannelsen deler nogle bemærkelsesværdige ligheder. Som skitseret i den første opdagelse af eksosomer blev et anti-TfR-antistof sporet ved elektronmikroskopi i reticulocytter (TH-Larry, 2011) fra overfladen af cellerne, ind i clathrin-belagte gruber, inde i tidlige endosomer, på overfladen af indre vesikler af multivesikulære endosomer og endelig på de frigivne eksosomer efter fusion af de multivesikulære endosomer med plasmamembranen (Fig. 4). RMT ser ud til at udfolde sig på en lignende måde, og BEC-ekstracellulære mikrovesikler har vist sig at indeholde flere receptorer, der vides at bære makromolekyler over BBB via RMT, herunder TFR, LRPs, LDLR og IR., 2013).
fra de beskrevne undersøgelser skal det være tydeligt, at BBB-bærerarmen af CNS-målretning bsAb kræver omhyggelig optimering for hver RMT-receptor. Vigtige overvejelser ved design af CNS-målretning bsAbs diskuteres nedenfor i lyset af” erfaringer ” fra TFR-BACE1 bsab udvikling og fra vores eget arbejde med FC5 som et BBB-bærerantistof.