9 Proteins rolle i den Spliceosomale katalytiske kerne
sammenligning af størrelsen af snrna ‘ er med de meget større gruppe II-introner rejser muligheden for, at flere gruppe II-introndomæner kan være blevet erstattet af proteiner i spliceosomerne under udviklingen, hvilket giver anledning til det moderne ribonukleoprotein (RNP) eukaryote splejsemaskiner. Selvom der endnu ikke findes nogen en-til-en korrespondance, er det let muligt at identificere spliceosomale proteiner, der udfører en funktion medieret af RNA-elementer i gruppe II-introner. For eksempel fungerer et antal U2-associerede proteiner ved initiering og stabilisering af U2 snRNA–grenstedets interaktion (Fig. 6.3).5,85 i gruppe II-introner er U2-ækvivalenten (del af domæne VI) kovalent forbundet med grenstedet via en hyperstabil hårnålsløjfe i et arrangement, der sikrer dannelsen og stabiliteten af deres interaktion (Fig. 6.2). Fra dette evolutionært perspektiv er det ikke overraskende, at en stor del af spliceosomale proteiner direkte forbinder med et snRNA, der ofte hjælper det med dets funktion.5,85 imidlertid er mange spliceosomale proteiner involveret i udførelse af regulatoriske funktioner, der ikke kræves i forbindelse med en selvsplittende intron og vil sandsynligvis være nyere tilføjelser til det spliceosomale proteinkomplement.
som nævnt ovenfor menes det, at den sidste fælles forfader til eukaryoter havde et højt udviklet, fuldt funktionelt spliceosom, der lignede dem, der findes i moderne eukaryoter.1,2 selvom dette spliceosome sandsynligvis indeholdt betydeligt færre komponenter sammenlignet med selv det mindste af moderne spliceosomer, data indikerer, at de fleste af nøglekomponenterne var til stede i de tidligste versioner af spliceosomerne.1-4 faktisk viser en delmængde af det spliceosomale proteom, der inkluderer proteiner associeret med den katalytiske kerne, et signifikant bevaringsniveau blandt forskellige eukaryote arter, hvor et antal spliceosomale proteiner er blandt de mest konserverede cellulære proteiner.85,86
som nævnt ovenfor er mange velkarakteriserede ribosymer forbundet med proteiner in vivo, som forbedrer deres katalytiske aktivitet ved flere kendte mekanismer.83 disse inkluderer stabilisering af den funktionelle struktur af RNA ‘ erne, hjælp til binding og placering af substraterne og hjælp til binding af funktionelt vigtige metalioner. Imidlertid er der hidtil ikke observeret direkte deltagelse i katalyse for nogen af de undersøgte ribosymassocierede proteiner.83,87 hvis man antager, at spliceosomet er et RNA, er spliceosomale snrna ‘ er i mange henseender usædvanlige. Måske vigtigst af alt er de usædvanligt små til en ribosymkatalyserende phosphodiesterbindingsspaltning via aktivering af en ikke-tilstødende nukleofil. Andre naturlige ribosymmer, der katalyserer sådanne reaktioner, nemlig gruppe i-og II-introner og RNase P, er mindst dobbelt længere end den kombinerede længde af humane U6-og U2-snrna ‘ er. Disse ribosymer er også meget større end de nukleolytiske ribosymer, der aktiverer en tilstødende 2 ‘ – hydroksyl-nukleofil til spaltning af phosphodiesterbinding.24,88,89 den større størrelse menes at tillade disse ribosymes at folde sig ind i komplekse strukturer stabiliseret ved flere tertiære interaktioner, hvilket igen gør det muligt for dem at skabe sofistikerede aktive steder, der er i stand til nøjagtigt at placere spaltningsstedet, det aktive sted metalioner og den fjerne nukleofil til In-line nukleofilt angreb. Det er tænkeligt, at U6-og U2-snrna ‘ er på grund af deres korte længde i bedste fald danner et ineffektivt splejsningsribosym, der kræver andre spliceosomale faktorer for stabil positionering af de aktive stedelementer og de reagerende grupper.
Prp8, som er det mest konserverede spliceosomale protein, menes at spille en sådan rolle på det spliceosomale aktive sted. Prp8 er uden tvivl det mest interessante af spliceosomale proteiner, da det er usædvanligt konserveret med 61% identitet mellem gær og menneske.86 Det har imidlertid få klart skelnelige funktionelle motiver i sin ~ 2300 aminosyrelængde, og de funktionelle domæner, der hidtil er blevet skelnet, er degenererede og udfører sandsynligvis funktioner, der ikke er relateret til den cellulære rolle i det oprindelige grundlæggende motiv.86 På den anden side spiller Prp8 klart en meget kritisk rolle i det spliceosomale aktive sted. Det er blevet tværbundet til 5′ og 3 ‘splejsningsstederne og grenstedet for premessenger RNA’ er ud over U5 og U6 snrna ‘ er, hvilket indikerer, at det er til stede i den spliceosomale katalytiske kerne og direkte kontakter de kritiske spillere i splejsningsreaktionen.86,90 Endvidere er det vist, at Prp8 interagerer med flere centrale spliceosomale proteiner, herunder Snu114 og Brr2 (se nedenfor).86,91,92
mutationer i Prp8 er forbundet med et bredt spektrum af spliceosomale defekter, herunder ændringer i spliceosomers evne til at afvise suboptimale splejsningssteder og undertrykkelse af defekter forårsaget af mutationer i andre spliceosomale faktorer, såsom Prp28, Brr2, U4 og U6 snrna ‘ er.86,93,94 en delmængde af prp8-mutanter modulerer selektivt effektiviteten af enten det første eller det andet trin af splejsning, især i suboptimale substrater.58,86,95 – 97 disse observationer forklares bedst ved en hypotese om, at Prp8 er involveret i stabilisering af alternative, gensidigt eksklusive aktive stedkonformationer, der enten er klar til katalyse af det første eller det andet trin i splejsning, og at visse Prp8-mutanter kan føre til selektiv hyperstabilisering af en af disse tilstande.58,96,98 mens signifikant evidens tyder på, at Prp8 sandsynligvis er involveret i positionering af substraterne og stabilisering af det aktive sted, findes der i øjeblikket ingen direkte evidens, der antyder eller tilbageviser dets yderligere involvering i metalionkoordinering eller direkte deltagelse i spliceosomal katalyse.
denne usikkerhed stammer fra det faktum, at meget lidt er kendt om, hvordan Prp8 udfører sin funktion. En innovativ transposonmedieret screeningsanalyse viste, at store regioner af Prp8 er meget følsomme over for indsættelse af transposoner og sandsynligvis fungerer som en enkelt strukturel enhed, skønt det var muligt at indsætte transposoner eller endda opdele Prp8 i to fragmenter i en række andre positioner uden tab af levedygtighed.90,92 bortset fra et degenereret nukleart lokaliseringssignal tæt på dets N-terminal og et degenereret RRM-motiv (RNA-genkendelsesmotiv) midt i proteinet er der kun identificeret to andre funktionelle domæner i dette ~ 2300 aminosyrelange protein.86
en degenereret variant af MPN / Jab1-domænet, der er forbundet med deubikvitinering, findes nær C-terminalen i Prp8.86 analyse af højopløsningsstrukturen af et fragment af Prp8 indeholdende dette domæne har vist, at isopeptidasecentrets metalionbindingssted er nedsat, og det fungerer derfor sandsynligvis ikke som et deubikitinerende middel.99.100 In vitro kunne et fragment af Prp8 indeholdende dette domæne direkte binde til allestedsnærværende med en affinitet, der var sammenlignelig med andre kendte allestedsnærværende bindende proteiner.101 flere kendte prp8-mutationer, der forstyrrede splejsning, forstyrrede også in vitro allestedsnærværende binding, hvilket øger muligheden for en funktionel rolle for allestedsnærværende i splejsningsregulering. Det er vigtigt, at proteomiske analyser har indikeret, at flere spliceosomale faktorer, herunder Sad1, Snu114, Rse1 og Prp8 selv, er allestedsnærværende in vivo, og desuden udviser det spliceosomale kerneprotein Prp19 E3 allestedsnærværende ligaseaktivitet in vitro.101-105 endvidere spiller allestedsnærværende en rolle i dannelsen og vedligeholdelsen af tri-snRNP, muligvis ved at modulere Prp8-medieret regulering af funktionen af Brr2.102 alternativt er det også muligt, at MPN/Jab1–domænet fungerer som en protein-protein-interaktionsplatform. Et antal mutationer i Prp8,der falder inden for dette domæne, resulterer i arvelig blindhed retinitis pigmentosa, 86 og disse mutationer svækkede interaktionen mellem Prp8 og Brr2 og Snu114.99
højopløsningsstrukturen af et andet fragment af Prp8 er blevet bestemt, der omfatter en stærkt konserveret region (69% aminosyreidentitet mellem gær og menneske) placeret tæt på dets C-terminale domæne. Analyse af strukturen afslørede tilstedeværelsen af en LARP-hårnålefinger, der lignede dem, der findes i ribosomale proteiner og et degenereret RNase H-lignende domæne.106-108 mens den samlede geometri af det RNase H-lignende motiv på niveau med sekundær og tertiær struktur var godt bevaret, viste den primære sekvens et meget lavere bevaringsniveau, og kun en af de tre katalytiske rester er til stede på det aktive sted. Den konserverede rest, et aspartat, er involveret i koordinering af to katalytiske metalioner på det aktive sted for kanoniske RNase H-domæner. I en undersøgelse resulterede mutation af denne Rest i Prp8 i gær ikke i nogen påviselig vækstdefekt, hvilket kunne indikere redundans eller mangel på en kritisk funktion.108 i en anden undersøgelse kunne dens virkning ikke undersøges, da mutationen inducerede misfoldning af proteinfragmentet.107 der blev ikke observeret nogen metalionbinding af regionen svarende til det aktive sted for RNase H-domænet, når krystallerne blev dyrket i så meget som 200 mM MgCl2, hvilket indikerer, at det degenererede aktive sted mangler metalionbindingsevne. Yderligere viste fragmentet af Prp8 indeholdende dette domæne en meget svag RNA-bindingsevne med en Kd på 20 liter til over 200 liter afhængigt af den testede RNA-Art.106-108 skønt fragmentet viste en meget lav affinitet for bindende RNA ‘er, viste det en præference for bindende dupleks RNA’ er indeholdende firevejskryds.108 i aktiverede humane spliceosomer forudsiges U2 og U6 snrna ‘ er at danne en sådan struktur.53,69 hvad der gjorde dette RNase H-lignende domæne særligt interessant var, at aminosyrerne svarende til dets aktive sted er placeret ved siden af rester i Prp8, der tidligere blev vist at tværbinde til 5’ splejsningsstedet i prækatalytiske spliceosomer.109 effektiviteten af dannelsen af dette tværbind blev imidlertid reduceret, efterhånden som de prækatalytiske spliceosomer skred frem til at blive katalytisk aktive spliceosomale komplekser.109 det observerede fald i tværbindingseffektivitet kunne fortolkes for at indikere, at denne interaktion forstyrres i aktiverede spliceosomer. Alternativt kan interaktionen fortsætte, men dannelsen af selve tværbundet afskaffes på grund af en mindre ændring i miljøet af de tværbundne rester. Hvis dette degenererede RNase H-lignende domæne faktisk er placeret i nærheden af 5 ‘splejsningsstedet i katalytisk aktive spliceosomer, er det muligt, at det kan deltage i stabilisering af snrna’ ernes aktive konformation, placering af substraterne på det aktive sted og/eller koordinering af katalytiske metalioner. Mens domænet i sig selv ikke kan binde RNA eller metalioner, er det muligt, at det i nærvær af andre aktive stedelementer kan udgøre en del af substratet eller metalionbindende lommer. På trods af disse spændende muligheder forbliver Prp8 ‘ s rolle i spliceosomal katalyse usikker.