Biotin og dets bindingspartner avidin bruges almindeligvis i dag i molekylærbiologi til en række forskellige teknikker og protokoller. I dette indlæg vil vi diskutere den naturlige rolle biotin, biotinylering, opdagelsen af biotin-avidin-interaktionen og anvendelserne af biotinylering i Molekylærbiologi!
Lær om in vivo biotinylering af bakterielle fusionsproteiner
Biotin er et essentielt vitamin for livet
selvom biotin er mest kendt for sin rolle i molekylærbiologi, er biotin (Vitamin H eller Vitamin B7) først et essentielt coensyme, der kræves af alle organismer for livet. Biotin syntetiseres kun af planter, de fleste bakterier og nogle svampe, og derfor skal pattedyr få vitaminet gennem eksterne kilder. Mennesker absorberer det meste af det biotin, de har brug for i tyndtarmen, fra mikrofloraen, der bor der.Biotin er en cofaktor, der i sin aktive form er kovalent bundet til det aktive sted for vigtige metaboliske stoffer, herunder biotincarboksylaser og decarboksylaser. Disse stoffer katalyserer overførslen af carboksyl-grupper til organiske syrer for at producere vigtige cellulære metabolitter. Biotin virker som en carboksyl bærer fra den ene forbindelse til den anden. Disse biotinafhængige stoffer er essentielle for processer som glukoneogenese, lipogenese, aminosyremetabolisme og energitransduktion.
Biotinylering er den generelle proces, hvormed biotin tilsættes til et protein eller makromolekyle. Biotin kan tilsættes kemisk eller kemisk. Biotinylering forekommer naturligt i celler og er den proces, hvorved biotin er kovalent bundet til en specifik lysin på det aktive sted for et nyligt syntetiseret lysin. Biotinproteinligase (BPL) er ansvarlig for denne meget specifikke post-translationelle proteinmodifikation. De fleste organismer har mindre end fem proteiner i hele proteomet, der er biotinylerede. I E. coli for eksempel er BPL, BirA, ansvarlig for biotinylering af kun en lysin i hele organismen på biotin carboksyl bærerproteinet (BCCP).
opdagelse af biotin-avidin-interaktionen
i slutningen af 1930 ‘ erne blev det observeret, at dyr fodret med en diæt med primært æggehvider ville udvikle hudlæsioner og andre forfærdelige sundhedsmæssige problemer. Denne sygdom blev betegnet” æggehvide skade ” og blev bestemt til at skyldes en mangel på Vitamin H senere omdøbt Vitamin B7/biotin. Æggehvide skader ville plage disse dyr, selvom deres kost blev suppleret med biotin. Således var noget i æggehviden sekvestrering af biotin fra at blive absorberet. I 1940 var Esmond E. Snell i stand til at rense proteinet ansvarlig for binding af biotin, avidin. Avidin blev passende opkaldt efter kyllingen,”Avian”, æg det blev renset fra. Snell bekræftede senere, at avidin faktisk var synderen i æggehvide skade ved at fodre rotter renset avidin (Kresege et al., 2004). Avidin er et glycoprotein, der består af fire identiske underenheder, der hver kan binde et molekyle biotin.
Biotin og avidin har en ekstremt stærk affinitet for hinanden. Faktisk er bindingen mellem dem en af de stærkeste ikke-kovalente protein-ligand-interaktioner, der findes i naturen. Når bindingen er dannet, påvirkes den ikke af ændringer i pH, temperatur eller organiske opløsningsmidler.
anvendelser af biotin i Molekylærbiologi
Biotin er et relativt lille, vandopløseligt molekyle, der ikke forstyrrer de makromolekyler, det tilsættes til. Biotin har også en eksponeret sidekæde, der let kan manipuleres til at fremstille reaktive arter uden at påvirke avidinbindingsstedet. Med alle disse funktioner er det ikke overraskende, at forskere begyndte at udnytte biotin og dets stærke interaktion med avidin til molekylærbiologi og bioteknologiske formål.
Når et polypeptid er biotinyleret (mere om dette nedenfor), kan det inkuberes eller co-udtrykkes med avidin eller et strukturelt lignende protein, der blev opdaget i 1960 ‘ erne, strepavidin. Biotin-avidin-komplekset kan derefter bruges og / eller manipuleres til en videnskabsmands tilsigtede formål. To af de mest almindelige anvendelser af biotinylering i laboratoriet er proteinrensning og immunudfældning eksperimenter. Biotinylerede proteiner eller komplekser kan let renses ved hjælp af søjler eller perler, der er belagt med avidin.
biotin-avidin-interaktionen er også tilpasset til anvendelse i immunhistokemi og antistofmærkning. I disse eksperimenter tilsættes biotin til et primært eller sekundært antistof, der er målrettet mod henholdsvis dit protein af interesse eller det primære antistof. Avidin bundet til en reporter føjes derefter til reaktionen for nem detektion. De mange biotinbindingssteder, der findes på avidin, er også ideelle til signalforstærkning under disse eksperimenter. Under detektion kan en biotinyleret reporter, der er præinkuberet med gratis avidin, føjes til din prøve. Eventuelle frie biotinbindingssteder på dette kompleks kan binde til dit biotinylerede antistof. Dette skaber et stort netværk af biotin-avidin-komplekser bundet til dit protein af interesse, hvilket fører til amplifikation af reportersignalet og lettere detektion. Denne strategi kaldes avidin-Biotin kompleks (ABC) immunhistokemi (IHC). For mere information om ABC og IHC tjek Thermo Fisher Scientific vejledning.
der er en række andre molekylærbiologiske applikationer til biotin og avidin. En kort liste over nogle andre almindelige applikationer og links til relevante papirer og hjemmesider er angivet nedenfor.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotin og avidin, makromolekyler af interesse skal først biotinyleres. Forskere har udviklet flere metoder til kemisk biotinylering af makromolekyler af interesse både in vitro og in vivo.
Biotinyleringsreagenser:
biotins eksponerede sidekæde kan tværbindes til aminosyrefunktionelle grupper in vivo via specialiserede kemikalier (biotinyleringsreagenser). Der findes en række biotinyleringsreagenser, der adskiller sig i de funktionelle grupper eller rester, de målretter mod, såvel som deres opløselighed, og således er forskellige reagenser nyttige til biotinylering i forskellige mikromiljøer. Der er også reversible og spaltelige biotinyleringsreagenser til at hjælpe med den specifikke eluering af biotinylerede proteiner. For hjælp til at bestemme, hvilket biotinyleringsreagens der skal bruges, tjek Thermo Fisher Scientifics værktøj til valg af Biotinyleringsreagens.
AviTag og BirA:
proteiner kan også biotinyleres ved at udnytte e ‘ s specificitet.coli BPL, BirA. Hvis du husker, Bira biotinylerer kun en lysin i hele E. coli proteom. Ved hjælp af denne viden identificerede forskere den 13 aminosyresekvens, der kræves til BirA-genkendelse og biotinylering. Denne 13 aminosyresekvens kaldes AviTag. Ved hjælp af AviTag kan man mærke et protein af interesse med biotin ved blot at skabe en fusion, hvor AviTag tilsættes til enten n-eller C-terminalen af proteinet. BirA har vist sig effektivt at biotinylere AviTag, der udtrykker proteiner i bakterier, gær, insekt-og pattedyrceller. Tjek Kay et al., 2009 for metoder til biotinylering af proteiner med BirA.
du kan finde plasmider, der indeholder både AviTag og BirA på Addgene!
Oligonukleotidmærkning:
Biotin kan tilsættes til begge terminus af en DNA-sekvens under en polymerasekædereaktion (PCR) ved anvendelse af en biotinyleret primer. Biotin kan også inkorporeres under PCR ved hjælp af et biotin mærket dUTP. Der er flere typer biotinetiketter, der kan føjes til et oligonukleotid afhængigt af din nedstrøms applikation. Biotinmærkede oligonukleotider kan anvendes i en lang række applikationer, herunder men ikke begrænset til in situ hybridisering, blotting (nordlige og sydlige) og affinitetsbinding.
Fotobiotinylering:
Fotobiotin kan bruges til ikke-selektivt at mærke DNA og RNA. Fotobiotinacetat består af et biotinmolekyle bundet til en fotoreaktiv arylaseidgruppe. Under stærkt synligt lys bliver arylasidgruppen reaktiv og danner en forbindelse med nærliggende nukleinsyrer (McInnes et al., 1990). Fotobiotinylering er undertiden lettere og billigere end andre metoder. Forskere har ofte brugt denne metode til at binde proteiner eller polypeptider til et fast substrat (Holden og Cremer, 2003).
1. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E.” Molekylærbiologi af Biotin vedhæftning til proteiner; Symposium: ernæring, biokemi og molekylærbiologi af Biotin ” J. Nutr, 129 (2009A): 477-484. PubMed PMID: 10064313.
2. Chapman-Smith, A., & Cronan, J. E. ” Den ensymatiske biotinylering af proteiner: en post-translationel modifikation af ekstraordinær specificitet.”Tendenser inden for biokemiske videnskaber, 24.9 (1999b): 359–363. PubMed PMID: 10470036.
3. Sagde H. M. ” Biotin: det glemte vitamin.”American Journal of Clinical Nutrition 75.2 (2002): 179-180. PubMed PMID: 11815306.
4. Nicole Kresge, R. D. S. og R. L. H. ” opdagelsen af Avidin af Esmond E. Snell.”J Biol Chem 279.e5 (2004). PubMed PMID: 20353954.
5. Kay, B., Thai, S., & Volgina, V. “Biotinylering af proteiner med høj kapacitet.”Metoder Mol Biol, 498 (2009): 185-196. PubMed PMID: 18988027. PubMed Central PMCID: PMC3223083.
6. McInnes, J. L., Forster, A. C., Skingle, D. C., & Symons, R. H. ” forberedelse og anvendelse af photobiotin.”Metoder i Ensymologi 184 (1990): 588-600. PubMed PMID: 2388593
7. Holden, M. A., & Cremer, P. S. “lysaktiveret mønster af farvestofmærkede molekyler på overflader.”Tidsskrift for American Chemical Society 125.27 (2003): 8074-8075. PubMed PMID:12837056.
8. Pan, J. feng, Liu, N. hua, Shu, L. yuan, & Sun, H. “anvendelse af avidin-biotin-teknologi til forbedring af celleadhæsion på nanofibrous matricer.”Tidsskrift for Nanobioteknologi 13.1 (2015): 1–14. PubMed PMID: 25980573. PubMed Central PMCID: PMC4461904.
9. Hu, J., & Ju, Y. ” en ikke-radioaktiv metode til lille RNA-detektion ved nordlig blotting.”Ris 7.1 (2014): 1-7. PubMed PMID: 26224555. PubMed Central PMCID: PMC4884002.
10. “Effektiv biotinylering og enkelttrinsrensning af mærkede transkriptionsfaktorer i pattedyrceller og transgene mus.”PNAS 100.13 (2003):7480-5. PubMed PMID:12802011. PubMed Central PMCID: PMC164612.
11. Liou, Y.-R., Vang, Y.-H., Lee, C.-Y., & Li, P.-C. ” opdrift-aktiveret Cellesortering ved hjælp af målrettede Biotinylerede Albuminmikrobobler.”PLoS ONE 10.5 (2015). PubMed PMID: 25993512. PubMed Central PMCID: PMC4439073.
12. L. B., Hughes, B. J., &
13. M., & Ting, A. Y. ” billeddannende proteiner i levende pattedyrceller med biotinligase og monovalent streptavidin.”Naturprotokoller 3.3 (2008): 534-545. PubMed PMID:18323822. PubMed Central PMCID: PMC2671200.
14. Bloch, B. ” Biotinylerede prober til in situ hybridiseringshistokemi: brug til mRNA-detektion.”The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Den Europæiske Unions Tidende Histochemistry Society, 41.12 (1993): 1751-1754.PubMed PMID: 8245422.
yderligere ressourcer på Addgene blog
- in vivo biotinylering af bakterielle fusionsproteiner
- Lær hvordan biotin bruges i Split-BioID: en forbedret metode til at studere protein-protein interaktioner
- Lær hvordan biotin kan bruges med CRISPR