diskussion
vores resultater viser, at et tværnationalt laboratorienetværk ved omhyggelig planlægning, træning og standardisering af reagenser og protokoller har kapacitet til at producere konsistente og sammenlignelige Hai-analyseresultater. De fem folkesundheds-og akademiske laboratorier, der deltog i denne undersøgelse, var en del af PCIRN, som blev udviklet for at øge Canadas nationale kapacitet til at støtte vaccine og anden influensa-forskning i tilfælde af en pandemi. I en pandemisk situation, med højvolumen, højtryk, og geografisk spredt influenstestning, standardisering af HAI-analysen vil være af største vigtighed for at sikre sammenlignelighed af resultater mellem laboratorier. Pcirn-laboratorierne viste en høj standard for Reproducerbarhed inden for laboratoriet med 99,8% præcision af duplikater (99.2% til 100% pr.laboratorium), 97,8% af titrene inden for et 2 gange interval i løbet af gentagne analysedage (93,3% til 100% pr. laboratorium) og 91,1% af testsera, der viser titer Reproducerbarhed over hver enkelt gentagelse af seksanalyseprotokollen (60% til 100% pr. laboratorium). Interlaboratorisk Reproducerbarhed var også høj med mediantitere på tværs af alle replikater fra de fire ikke-referencelaboratorier inden for 2 gange fra referencelaboratoriet for 100% af den testede sera. På laboratoriebasis er titrene på 94,3% og 98.9% af prøverne kvantificeret inden for en enkelt fortynding af henholdsvis referencelaboratoriet og konsensustitrene (intervaller mellem 85% og 100% og 95% og 100%). Disse procentsatser opfylder typiske acceptgrænser for variabilitet i HAI-assay (dvs.mindst 80% af prøverne ligger inden for 1 fortynding af nominelle værdier og/eller GMT ‘ er i hele analysen). Hai-analysespecificitet (100%) og følsomhed (87,5% til 100%) på tværs af pcirn-laboratorier var ligeledes godt inden for acceptkriterierne i tidligere undersøgelser (dvs. Skal 100% af de negative prøver kvantificeres som under kvantificeringsniveauerne, og mindst 80% af de positive prøver skal kvantificeres som positive ).
for den intralaboratoriske komponent af Hai-analysevariabilitet forekommer repeterbarhed inden for pcirn-laboratorier svarende til den, der er vist i andre undersøgelser (5, 22). En advarsel fra disse tidligere undersøgelser var, at der ikke blev undersøgt mere end tre gentagelser på trods af almindelig valideringspraksis for immunanalyse ved undersøgelse af seks eller flere gentagne analyser (24-27). Som sådan er det ikke klart, om deres data er direkte sammenlignelige med resultaterne bestemt over seks analyser i denne undersøgelse. Ikke desto mindre synes vores fund på 0% til 6,7% (median, 0%) af assays med resultater, der adskiller sig mere end 2 gange fra resultaterne af andre assay-gentagelser, at være sammenlignelige med de 4,8% til 7,1%, der tidligere er noteret i et laboratorium (22) og 0% til 15% (median, 2%) i ni laboratorier (5).
vores resultater af høj Hai-titer Reproducerbarhed mellem geografisk spredte pcirn-laboratorier står i kontrast til tidligere rapporter, der viser betydelig variation mellem internationale laboratorier, der udfører denne analyse (5, 6, 9-12). For eksempel fandt data fra en stor samarbejdsundersøgelse (11 laboratorier) GCV ‘ er pr.prøve fra 84% til 803% (median GCV pr. virus på 138%, 155% og 261%). Andre undersøgelser rapporterede GCV ‘er for H1N1-og H5N1-prøver, der strakte sig over 95% til 345% (11) og 22% til 582% (6), og GMT’ er varierede mellem laboratorier med op til 80 gange (11) eller 128 gange (9). Mens tidligere rapporter ofte omfattede et højere antal deltagende laboratorier end den nuværende undersøgelse, selv når kun seks laboratorier bidrog med data, var median interlaboratorisk GCV 83% for fem H1N1-prøver, hvoraf 80% oversteg en 4 gange forskel mellem laboratorier (11). I modsætning hertil viste den nuværende undersøgelse median GCV ‘ er pr.virus på kun 39% og 17%, med 95% af prøverne inden for en 4 gange forskel mellem laboratorier. En prøve oversteg 4 gange forskellen; titeren var ikke kvantificerbar for denne prøve på et laboratorium, og derfor blev den laveste værdi tildelt snarere end målt. Hvis denne prøve blev udeladt fra analyser, ville den maksimale GCV være 75,5%, hvilket ville repræsentere en værdi lavere end minimum GCV i andre undersøgelser. Selvom denne prøve viste højere variabilitet end andre, syntes dette lave måleområde generelt mindre præcist end højere intervaller. For eksempel varierede GCV fra 43,4% til 156,4% ved titere mellem 10 og 80 sammenlignet med 11,1% til 53,1% ved højere titere (Fig. 3). Større variabilitet med lavere titerprøver er også tidligere beskrevet (23) og sandsynligvis bidraget til inkongruente seroprotektionsklassifikationer i den aktuelle undersøgelse for de tre H1N1-prøver med titere tættest på tærsklen på 40 (konsensustitere på 22, 24 og 43). På trods af dette forblev diagnostisk nøjagtighed af seroprotektion på tværs af pcirn-laboratorier generelt høj (93,6%, når konsensustitere blev brugt til at definere seroprotektion og 89,5% sammenlignet med referencelaboratorieværdier).
høj enighed mellem interlaboratoriske HAI-titere i pcirn-laboratorier kan vedrøre omhyggelig harmonisering af HAI-analyseprocedurer og reagenser på tværs af PCIRN. Deltagere i tidligere undersøgelser, der viste høj interlaboratorisk variabilitet, brugte generelt HAI-analysemetoder, der varierede mellem laboratorier. Assayvariabler, der menes at bidrage til variabilitet i resultater, omfattede mængden af tilsat virus, det virale kultursystem (f. eks., varigheden af RDE-behandling, den indledende serumfortynding, typen og alderen på de anvendte RBC ‘ er og den tid, der er tilladt for RBC-bundfældning (5, 11, 12). Overraskende, imidlertid, når træ et al. forudsat at kommercielle og offentlige laboratoriedeltagere, der er involveret i sæsonbestemt vaccinetest i Europa, har en detaljeret standardprocedure, der skal følges, og almindelige reagenser/materialer, rapporterede de, at variationen mellem laboratorier ikke var signifikant forbedret (10). Forfatterne spekulerede i, at vedvarende” lokale tekniske variationer ” såvel som forskellige RBC-leverandører kunne have påvirket reproducerbarheden mellem laboratorier, men bemærkede, at yderligere standardisering var uden for grænserne for gennemførligheden for deres undersøgelse. Senere publikationer fortolkede disse resultater som tegn på, at HAI-analysestandardisering mellem laboratorier generelt ikke er en gennemførlig tilgang til harmonisering af HAI-resultater på tværs af forskellige laboratorier (8, 12), og mindst en gruppe har forsøgt at udvikle et modificeret og mere robust HAI-assay for at generere mere pålidelige og reproducerbare data (22).
i den aktuelle undersøgelse overholdt pcirn-laboratorierne strengt den standard, offentligt tilgængelige Verdenssundhedsorganisation HAI-analyseprotokol, hvor punkter, der var underlagt tekniske eller fortolkende variationer, blev harmoniseret mellem laboratorier inden studiestart. Vigtige reagenser (f.eks. RDE, RBC, viruslagre) blev opnået fra de samme leverandører så meget som muligt. Derudover tillod begrænsning af testen til en enkelt teknolog på hvert teststed øget standardisering. Den mulige effekt af at bruge flere medarbejdere på hvert laboratorium blev ikke testet i denne undersøgelse. Mens brugen af flere operatører potentielt kunne øge variabiliteten, viste den eneste undersøgelse, der undersøgte denne mulighed for HAI-test, ingen signifikant forskel mellem resultaterne fra to operatører i samme laboratorium (22).
potentielle variationer mellem laboratorier i de virale stammer dyrket til brug i analysen blev minimeret mellem pcirn-laboratorier ved anvendelse af virale frøbestande fra en enkelt kilde, der blev dyrket i samme cellelinje under lignende forhold på alle laboratorier. Vi spekulerer i, at interlaboratorisk Reproducerbarhed kan være berettiget til yderligere forbedringer, hvis virale arbejdslagre skal produceres centralt og distribueres til deltagende laboratorier. Betydningen af virale stammevariationer for hai-endepunktstitere illustreres godt af de 2-til-3 gange lavere titere, der blev demonstreret i en undersøgelse, da HAI-analysen anvendte en A/Cal pH1N1-stamme sammenlignet med H179A-genvigtigheden, der stadig havde ækvivalente hæmagglutininer og neuraminidaser (11). Desværre blev lagre ikke sekventeret som en del af denne undersøgelse, og vi kan derfor ikke verificere, at alle laboratorier brugte vira med identiske hæmagglutininsekvenser. Selv hvis mindre sekvensvariationer var blevet introduceret ved lokal formering af viruslagre, var variabiliteten mellem laboratorier i denne undersøgelse lille, og det er derfor svært at forestille sig, hvordan brugen af lagre med identiske HA-sekvenser yderligere kan reducere variabiliteten. Selvom forskellene ikke oversteg 2 gange i dette lille stikprøvesæt, kunne mindre variationer i HA-sekvens indført ved lokal formering af virale bestande være en mulig forklaring på tendensen til undervurdering af H1N1-titere og overvurdering af H3N2-titere.
forskellige undersøgelser har rapporteret reduceret interlaboratorisk variation i HAI-titere ved at kalibrere resultater mod internationale standarder (6, 11-13); sådanne standarder findes imidlertid ikke for de nuværende sæsonbestemte virusstammer B og A H3N2, og den konstante antigene drift af sæsonbestemte stammer, der driver årlig omformulering af vaccinerne, kan meget vel kræve kontinuerlig udvikling og validering af nye standarder. I denne undersøgelse synes den interlaboratoriske sammenlignelighed bedre end den, der opnås ved brug af selv de mest effektive kalibreringsstandarder. For eksempel efter kalibrering med er 09/194, træ et al. (11) rapporterede, at de maksimale forskelle mellem GMT ‘ er på forskellige laboratorier faldt fra 80 gange til 64 gange (dvs.en værdi, der stadig var mærkbart højere end den maksimale 11 gange i den aktuelle undersøgelse), og at GCV-intervallet mellem laboratorier faldt fra 95% til 345% (median, 105%) til 34% til 231% (median, 109%)-dvs. et godt stykke over området fra 0% til 156% (median, 27%) set i denne undersøgelse. Tilsvarende er brugen af udskiftning 10/202 formindsket GCV mellem laboratorier fra et interval på 108% til 157% til et interval på 24% til 144% på tværs af fem prøver og maksimale forskelle mellem laboratorier fra 43 gange til 21 gange (13), og ved hjælp af 07/150-standarden Stephenson et al. (6) reducerede median GCV på 15 NIBRG-14 H5N1 clade 1-prøver fra 125% (interval, 31% til 582%) til 61% (34% til 535%).
mens den nøjagtige årsag til det høje niveau af enighed mellem pcirn-laboratorierne sammenlignet med tidligere undersøgelser ikke kan konstateres, blev vores succes lettet af det incitament, vi havde som et nationalt netværk til at arbejde hen imod det fælles mål om at etablere reproducerbare processer. Detaljeret og streng proces-og reagensharmonisering mellem steder er måske det eneste “nye” aspekt, vi bragte til denne undersøgelse, sammenlignet med den mangeårige litteratur, der viser dårlig Hai-Reproducerbarhed mellem laboratorier. Imidlertid, vores data antyder, at med omhyggelig standardisering, interlaboratoriske variationer i HAI-titere kan reduceres til niveauer svarende til dem, der observeres inden for enkeltlaboratorier. Potentielle næste skridt til at minimere variationer i HAI-titere i laboratorier over hele verden ville være mobilisering af netværk/konsortier, implementering af retningslinjer og/eller lovgivningsmæssige krav til brug af standardprocedurer og reagenser, standardiseret træning for at sikre reproducerbarhed og levering af støtte og/eller incitamenter til laboratorierne til at omfavne “standardiseringskonceptet”.