sulfatreducerende bakterier i menneskelig afføring og deres tilknytning til inflammatoriske tarmsygdomme

Abstract

Vi har søgt efter sulfatreducerende bakterier i fæces fra 41 raske individer og 110 patienter fra en Hepato-Gastro-Enterologienhed ved hjælp af et specifikt flydende medium (Test-kit Lab Larpge LARP, Compagnie Franripaise de G Pristotermie, ORL Larpans, Frankrig). De 110 patienter blev adskilt hos 22 patienter, der havde inflammatoriske tarmsygdomme, og 88 patienter blev indlagt på hospitalet for andre nedre (n=30) eller øvre (n=58) fordøjelsessygdomme. Sulfatreducerende bakterier blev isoleret fra 10 raske individer (24%), 15 patienter med inflammatoriske tarmsygdomme (68%) og 33 patienter med andre symptomer (37%). En multipleks PCR blev udtænkt til identifikation af Desulfovibrio piger (tidligere Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis og Desulfovibrio desulfuricans og anvendt på ovennævnte isolater. Stammerne af sulfatreducerende bakterier bestod af D. piger (39 isolater), D. fairfieldensis (19 isolater) og D. desulfuricans (et isolat). Prævalensen af D. piger var signifikant højere hos patienter med inflammatorisk tarmsygdom (55%) sammenlignet med raske individer (12%) eller patienter med andre symptomer (25%) (P<0,05).

1 Introduktion

Crohns sygdom (CD) og ulcerøs colitis (UC) er kroniske inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) af ukendt etiologi, men de er sandsynligvis afhængige af miljømæssige, genetiske og immunfaktorer . En infektiøs oprindelse er blevet foreslået, og mange mikroorganismer er blevet impliceret i mangel af overbevisende argumenter. I begge syndromer reagerer tarmbetændelsen imidlertid på antibiotikabehandling. I dyremodeller af kronisk colitis er luminal flora en væsentlig cofaktor for sygdommen at forekomme . Dette kan forklare den fornyede interesse for tarmfloraens rolle som årsag til disse lidelser .

sulfatreducerende bakterier (SRB) er anaerobe mikroorganismer, der udfører forskellig sulfatreduktion for at opnå energi, hvilket resulterer i frigivelse af en stor mængde sulfid. De er almindeligvis isoleret fra miljøkilder, men er også til stede i fordøjelseskanalen hos dyr og mennesker. Som Desulfomonas pigra er blevet omklassificeret som Desulfovibrio piger comb. nov. , humane isolater af SRB består næsten udelukkende af Desulfovibrio arter . Nylige fund tyder på, at SRB kan have en rolle i menneskelige sygdomme. De har været forbundet med den kliniske sværhedsgrad af human parodontitis og isoleret fra dybe abscesser (abdominal eller hjerne), blod eller urin . I disse indstillinger er de fleste stammer blevet identificeret som Desulfovibrio fairfieldensis, en nyligt foreslået ny art, ved 16S ribosomalt RNA-gen (16S rDNA) sekventering. Desulfovibrio desulfuricans, typen af slægten Desulfovibrio, er også blevet isoleret fra humane prøver . Implikationen af SRB i IBD er blevet foreslået, da deres metaboliske slutprodukt, hydrogensulfid, er en cytotoksisk forbindelse . Denne forbindelse kan virke gennem en inhibering af butyratoksidering, den vigtigste energikilde for kolonocytter. Forringelsen af tarmepitelets funktioner ville føre til celledød og kronisk betændelse. De arter af SRB, der er forbundet med IBD, er dog endnu ikke identificeret. Deres identifikation ville gøre det muligt at se efter virulensfaktorer såvel som deres modtagelighed for antimikrobielle stoffer.i medicinske laboratorier isoleres SRB sjældent fra humane prøver på grund af en langsom vækst. Kolonier vises efter mere end 3 dages inkubation og bemærkes ikke, idet de er vokset af den ledsagende flora, medmindre de er den dominerende eller eneste tilstedeværende Art. Således er deres søgning i afføring vanskelig, medmindre der anvendes et bestemt medium. Sådanne medier indeholder normalt en organisk forbindelse (elektrondonor og kulstofkilde), sulfat (elektronacceptor), jern og et reduktionsmiddel. Væksten af SRB i specifikke dyrkningsmedier detekteres let ved en sværtning af mediet på grund af hydrogensulfid (H2S) produktion, hvilket resulterer i dannelsen af et jernholdigt sulfidfældning. Når det er isoleret fra kliniske prøver, kan identifikation på artsniveau være vanskelig. For eksempel er det ikke muligt at differentiere D. fairfieldensis og D. desulfuricans ved fænotypiske tests. Genforstærkning er således et værdifuldt redskab til at opnå en sådan identifikation.

hovedformålet med denne undersøgelse var at bestemme, hvilke arter af Desulfovibrio der kan være forbundet med IBD, hvis nogen. Til dette formål blev der anvendt et specifikt flydende medium (Test-kit Lab Kurtge Kurt, Compagnie Fran Kurtaise de G Kurtothermie, ORL Kurtans, Frankrig) til vækst af SRB fra afføring fra raske individer og af patienter indlagt i Hepato-Gastro-Enterologienheden i Center Hospitalier et Universitaire de Nancy, Frankrig. En multipleks PCR blev udtænkt til identifikation af isolaterne på artsniveau.

2 Materialer og metoder

2.1 patienter

afføring af 41 raske individer (17 mænd og 24 kvinder; gennemsnitsalder 38 år, interval 1-101 år) og 110 patienter (67 mænd og 43 kvinder; gennemsnitsalder 57 år, interval 14-100 år) fra Hepato-Gastro-Enterologienheden i Center Hospitalier et Universitaire de Nancy, Frankrig, blev indsamlet. Sunde individer konsulteres fortløbende for en kontrol. Ingen patogen mikroorganisme blev fundet i deres afføring. Raske individer og patienter har ikke haft nogen antibiotisk administration i måneden før prøven blev opnået. Patienterne blev opdelt i tre grupper: IBD (n=22) omfattede 17 CD og fem UC; andre nedre tarmsygdomme (n=30) omfattede 23 patienter, der havde milde eller moderate symptomer, såsom mavesmerter, tarmtransitproblemer og rektorrhagi, og syv patienter med tyktarmskræft; sygdomme i øvre fordøjelseskanal (n=58) omfattede galdesten, skrumpelever, hepato-cellulært karcinom, gastriske og bugspytkirteltumorer. IBD blev diagnosticeret på kliniske, endoskopiske og histologiske fund. De fleste af IBD-patienterne havde en aktiv sygdom (tabel 1).

2.2 SRB detektion og optælling

et gram afføring blev blandet med 4 ml fosfatbufret saltvandsbuffer og centrifugeret (3000 o / min, 5 min). En milliliter supernatant blev inokuleret straks i et flydende medium (Testkitlaboratorium L. A., Compagnie Fran L. A. G. L. A., ORL L. A., Frankrig) i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt består Testkitlaboratoriet Karrusol af hætteglas indeholdende 9 ml af et specifikt medium (organiske forbindelser: lactat og acetat, reduktionsmiddel: titaniumcitrat) anaerobt konditioneret til SRB-detektion. Den inokuleres med en sprøjte gennem en gummihætte. Dette limpide og farveløse medium er oprindeligt udtænkt til påvisning af SRB fra miljøprøver. Det blev sammenlignet med det almindeligt anvendte Postgates faste medium E (organisk forbindelse: lactat, reduktionsmidler: ascorbinsyre og thioglycolsyre) , inokuleret parallelt under anaerob atmosfære. SRB blev opregnet ved hjælp af lange og smalle rør fyldt op med sidstnævnte medium og inokuleret med decimalfortyndinger af fæces. Alle inokulerede medier blev inkuberet ved 37 kr. C i 2 måneder. Tilstedeværelsen af SRB blev konstateret ved dannelsen af et sort bundfald (jernholdigt sulfid) i flydende medier og ved udseendet af sorte kolonier i faste medier.

2.3 Design af PCR-primere

16S rDNA-sekvenserne af desulfomonas og Desulfovibrio-stammer, der er tilgængelige i GenBank-databasen, blev sammenlignet ved hjælp af Sekvensnavigatorprogrammet, version 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Det tillod at designe seks primere til identifikation ved PCR af SRB , der tidligere var isoleret fra mennesker, relateret henholdsvis til D. piger (tidligere Desulfomonas pigra) ATCC 29098t, D. desulfuricans 6 ATCC 29577t, D. desulfuricans MB ATCC 27774 og D. fairfieldensis ATCC 700045. 6 og D. desulfuricans MB blev differentieret, da 16S rDNA-sekvenserne af disse stammer udviser en forskel på 3%. Primerne var 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC Gett a-3′), Pig-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT Cat Cat CCT AC-3′) og P687-R (5′-Gat ATC Tac GGA TTT CAC TCC Tac ACC-3′) (Tabel 2). Specificiteten af disse primere blev kontrolleret på alle bakteriesekvenser, der var tilgængelige fra GenBank-databasen ved hjælp af Blast-programmet, version 2.0 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. 6, to stammer relateret til D. desulfuricans MB og otte stammer identificeret som D. fairfieldensis) blev anvendt som positive kontroller. Følsomheden af PCR blev evalueret med fortyndinger af kvantificerede bakteriestammesuspensioner. Specificiteten af PCR blev kontrolleret med negative kontroller inklusive typestammer (Bilophila ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) og almindelige intestinale kliniske stammer tilhørende følgende arter: Bacteroides brittle, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniform, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, bakterier uskadelige, Enterobacter Romerriget, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium small, Eubacterium sticky, Fusobacterium nucleatum, København af kanalen, Klebsiella nucleatum, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus stor, Proteus vidunderlig, Proteus almindelig, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis og Streptococcus bovis.

Ved slutningen af inkubationstiden blev alle de 151 inokulerede testkits Lab RRK kontrolleret ved hjælp af multipleks PCR. DNA-ekstrakter blev opnået fra 500 liter dyrkningsmedier efter centrifugering og resuspension i TE–buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Kort sagt blev cellerne lyseret ved hjælp af successivt lysosym (3 mg ml−1), SDS (1%, vægt/v) og proteinase K (0,25 mg ml−1). Efter en inkubation natten over ved 37 liter C blev DNA ekstraheret ved standard phenol/chloroform/isoamylalkoholmetoden. Hver PCR-blanding med 50 liter indeholdt 5 liter DNA-ekstrakt (ca.50 ng DNA) og endelige mængder på 0,4 liter af hver primer, 0,8 mM af hver af deoksynukleosid–trifosfat (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Tyskland), 0,4 mM Tris-HCl-buffer, 1,5 mM MgCl2 og 1,5 U Tak DNA-polymerase (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, UK). Alle reaktioner blev udført under anvendelse af GENEAMP PCR-systemet 2400 (Perkin-Elmer, Norvald, CT, USA). Et indledende denatureringstrin på 94 liter C i 4 minutter blev efterfulgt af 30 cyklusser med denaturering (94 liter C, 1 minut), udglødning (55 liter C, 1 minut) og forlængelse (72 liter C, 2 minutter) og med en endelig forlængelse (72 liter C, 5 minutter). Negativ (vand i stedet for DNA-ekstrakt) og positiv (D. fairfieldensis DNA-ekstrakt) kontrol blev inkluderet i hver kørsel. Amplificerede produkter blev løst ved elektroforese i 1,5% (vægt/v) agarosegeler indeholdende ethidiumbromid (1,6 mg ml−1). En 100-bp DNA-stige blev brugt som en størrelsesmarkør (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, USA). D. piger, D. desulfuricans Esseks 6, D. desulfuricans MB og D. fairfieldensis blev identificeret ved henholdsvis et 255-, 255-, 396 – og 534-BP-bånd. D. piger og D. desulfuricans Esseks 6 blev yderligere differentieret ved separate PCR-analyser under anvendelse af deres respektive specifikke primere. For negative prøver blev 16S rDNA-amplifikation ved anvendelse af konsensusprimerne 27F og 1525r udført for at kontrollere fraværet af inhibering af PCR ‘ erne af forurenende stoffer.

3 resultater

3.1 SRB-detektion og optælling

hos raske individer og i henhold til ovenstående kriterier blev SRB fundet i 10 afføring (24%) med både testkit-Lab-Karrus og Postgates medium. Hos patienter fra Hepato-Gastro-Enterologienheden blev SRB dyrket fra 42 afføring ved hjælp af Postgates medium. Tre yderligere prøver blev fundet positive med Testkitlaboratoriet LARP. Blandt de 110 undersøgte patienter blev SRB således påvist ved kultur hos 45 patienter (41%). Tre yderligere prøver gav tvetydige resultater med Testkitlaboratoriet Karrus (tilstedeværelse af et mørkebrunt bundfald). De gennemsnitlige tider for detektion af væksten af SRB var henholdsvis 2 og 6 dage ved hjælp af Testkitlaboratoriet Pristip (interval 1-11 dage) og Postgates medium (interval 3-39 dage). Det gennemsnitlige antal SRB i fæces hos raske individer og patienter var 105 g−1 (interval 102-109 g−1). SRB-tællingen var således ikke relateret til patienternes kliniske status.

3, 2 SRB-identifikation ved multipleks PCR

følsomheden af multipleks PCR-analysen var 100 bakterier pr. Dens specificitet blev konstateret ved fraværet af krydsreaktioner mellem de fire differentierede genospecier. Hver positiv kontrol blev fundet positiv udelukkende med det tilsvarende sæt primere. Alle stammer, der blev brugt som negative kontroller til at kontrollere specificiteten, inklusive typestammerne af D. gigas og D. vulgaris, gav negative resultater med de fire primersæt. Specificiteten af reaktionerne blev yderligere bekræftet ved sekventering af de amplificerede produkter. De opnåede sekvenser svarede altid til de forventede. For SRB-negative prøver ved PCR tillod 16S rDNA-amplifikation at kassere muligheden for en inhibering af PCR ‘ erne af forurenende stoffer.

hos patienter fra Hepato-Gastro-Enterologienheden gav de 45 positive og de tre tvetydige afføring positive resultater ved PCR. De svarede til D. piger (n=33), D. fairfieldensis (n=14) eller begge dele (n=1). Der blev ikke påvist D. desulfuricans (tabel 3). De kulturnegative Kolber var også negative ved PCR.

3.3 forholdet mellem desulfovibrio-arter og IBD

fordelingen af arten adskiller sig ikke signifikant ved sammenligning af raske individer og patienter med ikke-inflammatoriske tarmsygdomme. D. piger var næppe mere udbredt end D. fairfieldensis. Omvendt var D. piger hos patienter med IBD 4 gange hyppigere end D. fairfieldensis. Denne forskel var især mærkbar for CD, DA IBD-patienter hovedsageligt bestod af CD-patienter. Desuden er forekomsten af D. piger var signifikant højere hos patienter indlagt for IBD sammenlignet med raske individer eller patienter indlagt på grund af andre patologier (P<0,05). Der var ingen sammenhæng mellem sygdomsstadiet og tilstedeværelsen af SRB. Terapi ændrede ikke isolationshastigheden for disse bakterier.

4 Diskussion

tilstedeværelsen af SRB i tarmkanalen hos dyr og mennesker er blevet anerkendt i lang tid, selvom identifikationer på artsniveau sjældent er blevet udført. Vores resultater bekræfter, at disse bakterier er almindelige indbyggere i tarmkanalen hos mennesker. De fleste undersøgelser af intestinal SRB fra IBD-patienter har været afhængige af dyrkningsbaseret mikrobiologisk analyse af fækale prøver og har derfor identificeret SRB på slægtsniveau . Nylige undersøgelser har imidlertid antydet, at SRB ‘ s mulige rolle i patogenesen af IBD kan være relateret til fysiologiske og/eller fylogenetiske forskelle mellem stammer af SRB . Således udtænkte vi en multipleks PCR for at identificere disse bakterier på artsniveau. I betragtning af vanskeligheden ved isolering og sjældenheden ved specifikke søgninger er forekomsten af SRB i humane kliniske prøver bestemt undervurderet. Testkitlaboratoriet, der er udviklet til påvisning af SRB fra miljøprøver, viste sig at være et egnet medium til påvisning af SRB fra afføring såvel som fra kropsvæsker (Loubinouks, upubliceret resultat). Det har vist sig af producenten at dyrke miljømæssige stammer af SRB såsom D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574t, Desulfobacter postgatei DSM 2034t og Desulfobulbus propionicus DSM 2032t. I vores hænder viste det sig at være mere følsomt end det almindeligt anvendte Postgates medium, da seks yderligere isolater af Desulfovibrio blev påvist hos patienter. På trods af den rigelige ledsagende flora tillod Testkitlaboratoriet Kurtge, at SRB hurtigt voksede fra afføringsprøver, da den gennemsnitlige detektionstid var 2 dage (mod 6 dage i Postgates medium). Dette kan være relateret til mediumets kvalitet, men også til podningsmåden for prøver, der sikrer opretholdelse af streng anaerobiose. Sammenlignet med Postgates medium udvider tilsætningen af acetat til lactat detektionsspektret til at omfatte langsomt voksende acetatmetaboliserende SRB, såsom Desulfobacter spp. Desuden tillader tilstedeværelsen af titaniumcitrat, som er et meget effektivt reduktionsmiddel (Redokspotentialet for testkit Lab-Kurt-kr.-600 mV), En hurtigere påvisning af de fleste stammer af SRB.

det er muligt, at nogle stammer af SRB ikke blev detekteret af Testkitslaboratoriet, der blev tilgroet af den ledsagende flora eller på grund af et lavt antal i prøver. Imidlertid er Testkitlaboratoriet Karrusol tilpasset væksten af det meste af SRB, og alle de positive kolber blev identificeret ved PCR som D. piger, D. fairfieldensis eller D. desulfuricans. På trods af inkubationstiden på 2 måneder blev der ikke påvist yderligere arter. Det er således muligt, at vores fund svarer til den virkelige menneskelige flora, der næsten udelukkende består af D. piger og D. fairfieldensis. D. desulfuricans blev isoleret en gang og er også blevet beskrevet hos mennesker i en tidligere undersøgelse , men det er sandsynligvis ualmindeligt i tarmkanalen. I de fleste tilfælde er D. piger og D. fairfieldensis var gensidigt udelukkende. En forening af begge arter blev kun observeret en gang i tilfælde af tyktarmskræft. For at bekræfte den næsten ikke-overlappende forekomst af D. piger og D. fairfieldensis, fem kolonier af SRB dyrket i fast Postgate ‘ s medium er blevet identificeret ved PCR for hvert positivt Testkitlaboratorium LARP. I hvert tilfælde blev det samme resultat opnået, og de fem kolonier tilhørte den samme art (data ikke vist). Vi har også foretaget en opfølgning på 10 patienter (fem SRB-positive og fem SRB-negative) i 2 måneder, og afføring blev dyrket hver uge. For hver patient blev det samme resultat (SRB-positivt eller SRB-negativt) opnået med alle prøver (data ikke vist). Det ville imidlertid være interessant at følge patienterne med IBD over en længere periode for at afgøre, om sygdommens aktivitet har en konsekvens for populationen af SRB.

D. desulfuricans er almindeligvis isoleret fra miljøet og er også blevet betragtet som den mest udbredte art af Desulfovibrio hos mennesker indtil den nylige beskrivelse af D. fairfieldensis. Således kan man blive overrasket over den meget lave forekomst af D. desulfuricans i vores befolkning. Indtil nu er D. piger og D. fairfieldensis udelukkende blevet isoleret fra humane prøver. Således viser vores resultater, at begge arter kan være specifikke for den menneskelige tarmkanal. Dette skal dog stadig bestemmes af den specifikke søgning efter disse bakterier i andre økologiske nicher. D. piger er kun blevet beskrevet en gang og blev betragtet som et usædvanligt fund hos mennesker. Vores resultater indikerer, at det kan være den mest almindelige SRB i tarmkanalen. Imidlertid er denne art aldrig blevet beskrevet i infektiøse processer. Tværtimod, D. fairfieldensis, tilsyneladende mindre almindelig i menneskelig afføring, er blevet isoleret uden for kolonlumen fra blod og septiske samlinger . Således kan D. fairfieldensis have yderligere invasive egenskaber sammenlignet med andre arter af Desulfovibrio, hvilket ville forklare dets genopretning fra kliniske prøver. Interessant nok er forekomsten af D. piger i fæces i vores serie af patienter signifikant højere hos patienter indlagt på IBD (for det meste CD) end hos raske individer eller hos patienter indlagt på andre patologier. Dette kan have to forklaringer: enten D. piger har fysiologiske egenskaber, der forårsager udbrud af læsioner og/eller deltager i opretholdelsen af kroniske inflammatoriske processer, eller kolonisering af denne art er begunstiget af lokale forhold hos IBD-patienter. Foreningen af SRB med IBD er allerede beskrevet . D. piger er ikke blevet overvejet yderligere siden sin første beskrivelse i 1976 . Således er konstateringen af, at denne bakterie, der betragtes som en ‘ikke-patogen’ art, en almindelig indbygger i den menneskelige tarmkanal og den mest udbredte art af SRB hos IBD-patienter, overraskende. Yderligere undersøgelser bør udføres for at belyse den måde, hvorpå D. piger kan være impliceret i disse kroniske inflammatoriske processer.

anerkendelser

dette arbejde blev delvist støttet af Compagnie Franrius de G. Vi er i gæld til den afdøde Dr. lille Tee (University of Melbourne, Australien) for venligt at levere fire stammer af D. fairfieldensis (inklusive stamme ATCC 700045) og også til Prof. D. Raoult (University of Marseille, Frankrig) for at levere en stamme af D. fairfieldensis. Vi takker D. Meng og A. M. Carpentier (Laboratoire de Bact Pristriologie-Virologie UMR CNRS 7565) for deres fremragende tekniske assistance, Dr. A. DAO og Prof. B. Fortier for at give afføring fra raske individer såvel som sygeplejerskerne i Hepato-Gastro-Enterologienheden for deres venlighed.