hovedforsker: suben E. Sauna, PhD
Kontor / Division / Lab: OTAT / Dppt / HB
generel oversigt
et stort problem med proteinbaserede terapier er deres immunogenicitet, det vil sige deres tendens til at udløse et uønsket immunrespons mod sig selv. En form for immunrespons er aktivering af B-celler, der producerer antistoffer, der binder til proteinerne og reducerer eller eliminerer deres terapeutiske virkninger. Sådanne antistoffer kan også forårsage komplikationer, der kan være livstruende. Derfor er en kritisk del af bestemmelsen af den kliniske sikkerhed og effekt af proteinbaserede terapeutiske produkter måling af deres tendens til at udløse antistofdannelse.
immunresponset på proteinbaserede terapier involverer også T-celler, som hjælper med at aktivere B-celler, så de producerer antistoffer, herunder dem, der blokerer for proteinterapeutika. Dette sker, hvis det naturlige protein fremstillet af kroppen er defekt på en eller anden måde. I så fald reagerer T-cellerne på et normalt kunstigt protein terapeutisk som om det var fremmed, da det adskiller sig fra det defekte, naturlige protein. Et misforhold mellem T-celle-respons som dette forekommer undertiden i tilfælde af proteinet FVIII, et protein, der er kritisk for kroppens evne til at danne blodpropper for at stoppe blødningen. Mennesker, der ikke har tilstrækkelige mængder FVIII, eller hvis FVIII er defekt på en eller anden måde, lider af hæmofili A, en sygdom, hvor blodkoagulation er defekt og fører til overdreven blødning. Problemet med defekt FVIII er genetisk baseret. Selvom der ikke er nogen kur mod hæmofili A, har infusion af det terapeutiske protein FVIII været et af de mest succesrige eksempler på håndtering af en kronisk sygdom. Desværre er udviklingen af anti-lægemiddelantistoffer mod den infunderede FVIII en betydelig hindring for denne strategi. Behandlingen af patienter, der udvikler et immunrespons, er mere kompleks, mindre effektiv og meget dyr. Det ser nu ud til, at individuelle variationer i tendensen til at udvikle anti-lægemiddelantistoffer også kan være baseret på genetiske forskelle. Dette afspejles i den kliniske observation, at personer med hæmofili A af sort afrikansk afstamning er dobbelt så sandsynlige som patienter med europæisk kaukasisk afstamning til at producere antistoffer mod faktor VIII-proteiner givet som erstatningsterapi.
En strategi til forebyggelse af uoverensstemmelser mellem naturlig FVIII og erstatning FVIII er at designe genetisk manipulerede FVIII-proteiner, så de ikke udløser immunreaktioner. Men der er så mange forskelle mellem menneskers immunsystem, at det ikke er sandsynligt, at forskere vil være i stand til at designe et FVIII-protein, der er sikkert for dem alle. Derfor foreslår vi at tage en personlig tilgang til at forudsige-og undgå-immunresponser på FVIII-proteiner. Vores langsigtede mål er at udvikle en genbaseret tilgang til at identificere personer, hvis immunsystem sandsynligvis reagerer på specifikke versioner af genetisk konstruerede terapeutiske proteiner, så disse patienter kan behandles med versioner af disse proteiner, der er mindre tilbøjelige til at forårsage immunrespons.
vi behandler også problemet med forskelle i de tredimensionelle strukturer af proteinlægemidler og naturlige proteiner, der udløser B-celler til at producere antistoffer mod terapeutiske proteiner. Den nuværende metode til at forudsige, om visse dele af sådanne proteiner vil udløse antistofdannelse, er udfordrende og dyr. Derfor bruger vi små stykker DNA-lignende molekyler kaldet aptamere til at undersøge proteinerne og bestemme deres nøjagtige former. Aptamerer er lavet af strenge af molekyler kaldet nukleinsyrer, der foldes op i specifikke former, der afhænger af, hvilke nukleinsyrer der er til stede, og i hvilken rækkefølge de forekommer i aptameren. Derfor kan vi ved at identificere, hvilken aptamer der binder tæt til en bestemt del af et molekyle, forudsige formen på den del af molekylet, lidt som at forudsige formen på en lås ved at kende formen på den nøgle, der passer ind i den.
vi bruger nu denne teknik til at bestemme formerne for både FVIII og den del af miltbrandtoksinet, der kaldes beskyttende antigen. Hvis en aptamer for eksempel mister sin evne til at binde til FVIII, ville det indikere, at en del af dette blodkoagulationsprotein har ændret sig formet, hvilket øger sandsynligheden for, at det vil udløse en immunreaktion, der reducerer dens terapeutiske aktivitet. Vi bruger denne tilgang til at afgøre, om terapeutiske proteiner har former, der vil udløse antistofproduktion. Og vi samarbejder med Center for Drug Evaluation and Research for at tilpasse denne teknologi til at analysere nye proteinprodukter udviklet som kopier af eksisterende, godkendte proteinlægemidler (biosimilære lægemidler) for at sikre, at de vil være sikre og effektive.
videnskabelig oversigt
1) forudsigelse af interaktion mellem T-celleepitoper med specifikke MHC klasse II antigener.
faktor VIII (FVIII) er en væsentlig komponent i koagulationskaskaden, og personer, der mangler koagulationsfaktorer, udviser livslange blødningsforstyrrelser. Udviklingen af immunogenicitet mod terapeutiske (infunderede) versioner af FVIII er en signifikant hindring for den vellykkede behandling af hæmofilier.50% af tilfældene med hæmofili A er forårsaget af en inversion af f-genets eksoner 1-22, hvilket resulterer i produktion af et polypeptid, der repræsenterer disse eksoner, men ikke 23-26. Der er imidlertid et indlejret gen i F8-promotoren, der oversætter eksoner 23-26. Ikke desto mindre betyder 1-22-inversionen, at de overlappende peptider, der genereres fra dette protein, ikke inkluderer krydset mellem 1-22 og 23-26. Mens peptiderne fra det infunderede lægemiddelprotein FVIII, der dækker dette kryds, således ville være fremmed for patientens immunsystem, er de generelt ikke immunogene. Snarere skyldes immunogenicitet på grund af forskellene mellem endogen og infunderet FVIII sandsynligvis en række fakta, især enkelt nukleotidpolymorfier (SNP ‘ er), men også missense-mutationer og sletninger og nonsensmutationer samt inversioner
derfor ville den ideelle (men ikke sandsynlige) løsning på immunogenicitetsproblemet med infunderet FVIII være at designe FVIII-udskiftninger, der matcher hver patients haplotype og HLA-type for at undgå at udløse et immunrespons. Selvom det ikke er praktisk at designe sådanne biologiske stoffer, der passer til enhver patient, kan det være muligt i tilfælde, hvor der er klare og signifikante forskelle mellem specifikke populationer (f.eks. mellem dem af europæisk kaukasisk og sort afrikansk afstamning). I sådanne tilfælde ville det være ønskeligt at tilpasse designene af endogen FVIII til hver gruppe for at sikre, at en population ikke får en uforholdsmæssig stor andel af fordelene ved en enkelt version af FVIII, mens den anden population bærer en uforholdsmæssig stor del af risiciene fra den samme infunderede FVIII.
Den nuværende teknologi muliggør identifikation af haplotype-baggrunde for FVIII samt udvikling af mindst et begrænset udvalg af personaliserede faktor VIII-lægemidler. Derfor er vores kortsigtede mål at bestemme 1) kvantitativ fordeling af forskellige haplotyper (SNP ‘ er) hos individer af europæisk-kaukasisk og Sortafrikansk afstamning; 2) fordeling af MHC klasse II antigener i disse populationer; 3) Sammensætning af FVIII anvendt som lægemidler; og 4) sygdomsfremkaldende mutation, deletion eller inversion i F8-genet (FVIII) hos individuelle patienter. Vi vil bruge disse data til at forudsige immunogeniciteten af individuelle FVIII-produkter i forskellige populationer og/eller individuelle patienter.
2) udvikling af aptamerer som et redskab til undersøgelse af protein-lægemiddelkonformationelle epitoper.Aptamerer, nukleinsyrer, der er i stand til at danne komplekse konformationer, er potentielle værktøjer til kortlægning af proteinkonformation, identifikation og forudsigelse af immunogene steder og til omgåelse af immunogenicitet. Vores laboratorium udvikler enkeltstrengede DNA-aptamere til rekombinant human faktor VIII.
vi har designet et naivt DNA-bibliotek til at generere aptamere ved hjælp af definerede 5-og 3-regioner til PCR, der flankerer en randomiseret 60-baseregion. Na-larves DNA-biblioteket blev denatureret, og ssdna-segmenterne fik lov til at folde sig ind i unikke 3-dimensionelle former. (De 60 tilfældige baser ville teoretisk resultere i 460 unikke konformere.) Vi inkuberede puljen af foldet ssDNA med FVIII og gennem iterativ SELEKS (systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse) cyklusser var vi i stand til at vælge proteinbindende aptamerer.
vores laboratorium valgte en prøveudtagning af individuelle aptamere i cyklus 3, 5 og 8 og klonede og sekventerede dem. Vi bruger disse kloner til at karakterisere aptamerne gennem analyse af den forudsagte 3D-struktur, bindingsegenskaber og effekten på FVIII-aktivitet. Derudover gør vi i silico sammenligninger af disse kloner for at følge udviklingen af aptamerne.
3) Anvendelse af forskellige analyseteknikker til evaluering af proteinegenskaber, der kan korrelere med immunogenicitet.
I samarbejde med Drs. Mansoor Khan og Rakhi Shah (opdeling af produktkvalitet, CDER) vi vil analysere lægemiddel hjælpestoffer interaktioner ved hjælp af termiske metoder (differentiel scanning kalorimetri, mikrokalorimetri, termogravimetrisk analyse), spektroskopiske teknikker (Fourier transform infrarød, nær infrarød, Raman), krystallografi (røntgendiffraktion) og nuklear magnetisk resonans.
4) karakterisering af konformationsfølsomme antistoffer.
En alternativ metode til at studere konformationelle epitoper af terapeutisk vigtige proteiner er at udvikle og karakterisere antistoffer, der er følsomme over for konformationsændringer. I samarbejde med Dr. Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) karakteriserede vi flere antistoffer, der er følsomme over for konformationen af metalloprotease ADAMTS13, et multidomæneprotein, der spalter von Vilbrand-faktor og er impliceret i trombotisk trombocytopenisk purpura. Vores resultater antyder, at disse antistoffer kan være nyttige reagenser til at skelne mellem funktionelle og ikke-funktionelle ADAMTS13, og til analyse af konformationsovergange under den katalytiske cyklus.
publikationer
Int J Mol Sci 2020 20.maj;21(10):E3598
mikroRNA ‘ ers rolle i hæmofili og trombose hos mennesker.Transfusion 2020 Feb;60 (2): 401-13
klinisk manifestation af hæmofili A i fravær af mutationer i F8-genet, der koder for FVIII: mikrornas rolle.B, Oldenburg J, Atreya CD, Sauna de
j Thromb Haemost 2020 Jan;18(1):201-16
kvantitativ HLA-klasse-II/faktor VIII (FVIII) peptidomisk variation i dendritiske celler korrelerer med det immunogene potentiale af terapeutiske FVIII-proteiner i hæmofili A.
Diego VP, Luu BV, Hofmann M, Dinh LV, Almeida m, Rajalingam r, Peralta Jm, Kumar s, Curran je, sauna de, Kellerman R, Park y, nøgle ns, Escobar ma, huynh h, Verhagen am, Vilhelm-blangero s, Lehmann PV, maraskovsky e, blangero J, hvordan man
front Immunol 2019 Dec 20;10:2894
SampPick: udvælgelse af en kohorte af emner, der matcher en population HLA fordeling.
McGill JR, Yogurtcu ON, Verthelyi D, Yang H, Sauna de
Sci Rep 2019 okt 29;9(1):15449
effekter af kodonoptimering på koagulationsfaktor-translation og struktur: implikationer for protein-og genterapier.
Aleksaki A, Hettiarachchi GK, Athey JC, Katneni UK, Simhadri V, Hamasaki-Katagiri N, Nanavaty P, Lin B, Takeda K, Freedberg D, Monroe D, McGill JR, Peters R, Kames JM, Holcomb DD, Hunt RC, Sauna hun, Gelinas a, Janjic N, DiCuccio M, Bar H, Komar AA, Kimchi-Sarfaty C
blod Adv 2019 Sep 10;3(17):2668-78
afbødning af T-Celleafhængig immunogenicitet ved reengineering faktor VIIa Analog.s, Bembridge G, Bunce C, Cloake E, Fogg MH, Jankoska KI, Khan a, Marcotrigiano J, Ovanesov MV, Sauna de
AAPS J 2019 Aug 2;21(5):96
TCPro: et in silico – risikovurderingsværktøj til bioterapeutisk proteinimmunogenicitet.
Yogurtcu ON, Sauna de, McGill JR, Tegenge MA, Yang H
Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2019 Jun 1;316(6):G720-34
translationelle og transkriptionelle reaktioner i humane primære hepatocytter under hypoksi.
Hettiarachchi GK, Katneni UK, Hunt RC, Kames JM, Athey JC, Bar H, Sauna, McGill JR, Ibla JC, Kimchi-Sarfaty C
blod Adv 2019 14.maj;3(9):1429-40
peptider identificeret på monocytafledte dendritiske celler: en markør for Klinisk immunogenicitet over for FVIII-produkter.aaps J 2019 maj 6;21(4):62
Fc-Fusionsmedicin har fcgammar/C1K bindings-og signalegenskaber, der kan påvirke deres immunogenicitet.
Lagasse havde Hengel H, Golding B, Sauna de
tendenser Biotechnol 2018 okt;36(10):1068-84
evaluering og afbødning af immunogeniciteten af terapeutiske proteiner.
Sauna, Lagasse D, Pedras-Vasconcelos J, Golding B, Rosenberg AS
Hum Immunol 2018 okt;79 (Suppl.):103-4
analyse af hlacii peptidomer præsenteret af dendritiske celler (DCs) fra raske donorer og hæmofili-A (HA) patienter med eller uden faktor VIII (FVIII) hæmmere efter tidligere vivo administration af forskellige terapeutiske FVIII proteiner (tFVIIIs).LV, Rajalingam R, Escobar M, Curran J, vil-Blangero S, Poul J, Blangero J, Maraskovsky E, nøgle NS, Sauna de
Mol ther metoder Clin Dev 2018 Jun 15;10:105-12
prævalens af allerede eksisterende antistoffer mod CRISPR-associeret nuklease Cas9 i USA befolkning.
Simhadri VL, McGill J, McMahon S, Vang J, Jiang H, Sauna de
j Pharm Pharmacol 2018 maj;70(5):584-94
Immunogenicitetsvurdering under udviklingen af proteinterapeutika.Blodtransfus 2017 okt; 15 (6): 568-76
sammenfattende rapport fra den første internationale konference om hæmmere i hæmofili A.
H. C. S., Scott D., Goudemand J, Van Den Berg M, Makris M, Van den Berg M, Santagostino E, Lillicrap D, Rosendaal FR, Hilger a, Sauna, Oldenburg J, Mantovani L, Mancuso ME, Kessler C, Hay CR, Knoebl P, di Minno G, Hoots K, Bok A, Brooker M, Buoso E, Mannucci PM, Peyvandi F
J med genet 2017 maj;54(5):338-45
enkelt synonym mutation ændrer proteinegenskaber og ligger til grund for hæmofili B.
Simhadri VL, Hamasaki-Katagiri N, Lin BC, Hunt R, Ria S, Tseng SC, Vi A, Bentley AA, Vi R, Vi Lu, vi L, Freedberg DI, Monroe DM, Sauna vi, Peters R, Komar AA, Kimchi-Sarfaty C
J Thromb Haemost 2017 Apr;15(4):721-34
modulerende immunogenicitet af faktor vi ved fusion til et immunoglobulin FC-Domæne: en undersøgelse ved hjælp af hæmofili B-musemodel.
Levin D, Lagasse HA, Burch E, Strome s, Tan s, Jiang H, Sauna de, Golding B
F1000Res 2017 Feb 7;6:113
nylige fremskridt inden for (terapeutisk protein) lægemiddeludvikling.
Sci Transl med 2017 Jan 11;9(372):Aag1286
Post hoc vurdering af immunogeniciteten af bioingenieret faktor VIIa demonstrerer brugen af prækliniske værktøjer.
Lamberth K, Reedts-Runge SL, Simon J, Klementyeva K, Pandey GS, Padkj Lusr SB, Pascal V, Le Lusn IR, Gudme CN, Buus S, Sauna de
Biomed Res Int 2015;2015:456348
muskeldystrofi: sygdomsmekanismer og terapier.
Pandey SN, Kesari A, Yokota T, Pandey GS
Per Med 2015;12 (4):403-15
personlige tilgange til behandling af hæmofili A og B.
Simhadri VL, Banerjee AS, Simon J, Kimchi-Sarfaty C, Sauna de
PLoS One 2015 Jul 15;10(7):e0132433
Lille ncRNA ekspression-profilering af blod fra hæmofili A patienter identificerer mir-1246 som en potentiel regulator af ffctor 8 gen.
Sarachana T, Dahiya N, Simhadri VL, Pandey GS, Saini s, Guelcher C, Guerrera MF, Kimchi-Sarfaty C, Sauna de, Atreya CD
nukleinsyrer Res 2015 Jul 13;43(12):5699-707
storskala analyse af mutationslandskabet i HT-SELEKS forbedrer aptamer-opdagelsen.blod 2015 Jan 8;125(2):223-8
intron-22-inverteret F8 locus tillader intracellulær faktor VIII syntese, forklarer dens lave inhibitorrisiko og antyder en rolle for farmakogenomik.tendenser Biotechnol 2015 Jan;33(1):27-34
Fc fusion som platformsteknologi: potentiale for modulering af immunogenicitet.
Levin D, Golding B, Strome SE, Sauna de