α-Hämolysin aus Escherichia coli verwendet eine endogene Amplifikation durch P2X-Rezeptoraktivierung, um eine Hämolyse zu induzieren

Ergebnisse

Die HlyA-induzierte Hämolyse erfordert die Aktivierung von purinergen Rezeptoren.

Überstand aus dem α-Hämolysin (HlyA)–produzierenden E. coli–Stamm ARD6 lysiert equine, humane und murine Erythrozyten (Abb. 1). Abbildung 1 zeigt die HlyA-induzierte Hämolyse als Funktion der Zeit. Zeitrafferexperimente mit murinen und humanen Erythrozyten, die an Deckgläsern befestigt waren, zeigten, dass die HlyA-induzierte Hämolyse ein sequentieller Prozess ist. Innerhalb der ersten 20 Minuten induzierte HlyA eine Zinnenbildung der roten Blutkörperchen infolge Zellschrumpfung, gefolgt von einer allmählichen Volumenzunahme und schließlich Lyse der Zellen (Abb. 1A und 1B, Film S1). Diese sequentielle Schrumpfung und Quellung gilt auch auf Einzelzellebene. Es sind also nicht unterschiedliche Populationen roter Blutkörperchen, die entweder schrumpfen oder anschwellen, sondern vielmehr, dass ein einzelner Erythrozyt als Folge der HlyA-Anwendung zuerst schrumpft und dann anschwillt. Die Erythrozytensuspension (1,25%) wurde mit verdünntem E. coli−Überstand (50 µl·ml-1) inkubiert. Erythrozyten aus den drei getesteten Spezies zeigten einen deutlichen Unterschied in der Reaktionsfähigkeit auf HlyA (Abb. 1C) mit der geringsten Empfindlichkeit gegenüber HlyA in menschlichen Erythrozyten. In allen folgenden Experimenten wurde die Menge an zugesetztem E. coli-Überstand so eingestellt, dass nach 60-minütiger Inkubation ≈50% Hämolyse resultierten.

Wir verwenden im Allgemeinen gefilterten E. coli (ARD6) -Überstand, um Hämolyse zu induzieren, sofern nicht anders angegeben. Dieser Ansatz wurde gewählt, um sicherzustellen, dass unsere Ergebnisse auch in vivo anwendbar sind, wo HlyA zusammen mit verschiedenen anderen Komponenten aus E. coli freigesetzt wird. Bei der Wahl dieses Ansatzes mussten wir jedoch nachweisen, dass die durch HlyA-produzierende E. coli induzierte Hämolyse tatsächlich auf HlyA zurückzuführen ist. Deshalb haben wir HlyA aus unserer ARD6-Kultur gereinigt. Nach der Reinigung wurde eine Suspension des gereinigten HlyA an einem 5-15%igen Natriumdodecylsulfat (SDS)-Gel abgetrennt. Nach der Coomassie R-Färbung erschien eine einzelne 100-kDa-Bande, und die Massenspektroskopie identifizierte die Bande als HlyA (Abb. S1 A und B). Als zusätzliche Kontrolle verwendeten wir den Überstand aus dem E. coli-Stamm D2103, einem nicht pathologischen Laborstamm von E. coli, der kein HlyA produziert. Der Überstand dieser Bakterien induzierte keine Hämolyse in humanen, murinen oder equinen Erythrozyten (Abb. S1D). Darüber hinaus verglichen wir unsere Ergebnisse mit HlyA freundlicherweise von Prof. Sucharit Bhakdi, Universität Mainz, Deutschland (mit der Aktivität von 10 ng *ml-1 für ≈50% Hämolyse, Abb. S2). Wenn im Folgenden gereinigtes HlyA erwähnt wird, bezieht es sich auf diese Zubereitung. Während unserer ersten Tests der biologischen Aktivität von HlyA entdeckten wir, dass die ATP-Scavenger-Apyrase die HlyA-induzierte Hämolyse von equinen Erythrozyten vollständig hemmte. Dieser Befund war wirklich überraschend, da er extrazelluläres ATP implizierte, das für die Hämolyse durch HlyA-produzierende E. coli notwendig ist. Da extrazelluläres ATP ein Signalmolekül ist, das P2-Rezeptoren aktiviert, könnten unsere Ergebnisse darauf hindeuten, dass das vorherrschende Porenmodell für HlyA-induzierte Hämolyse eine Vereinfachung sein könnte. Daher haben wir die Wirkung von ATP-Scavenging gründlicher getestet. Wir fanden heraus, dass Apyrase die Hämolyse nicht nur von Pferde-, sondern auch von Maus- und menschlichen Erythrozyten vollständig hemmte (Abb. 2A). Darüber hinaus reduzierte Hexokinase, die Adenosintriphosphat (ATP) schnell zu Adenosindiphosphat (ADP) abbaut, in ähnlicher Weise die HlyA-induzierte Hämolyse in roten Blutkörperchen murinen und menschlichen Ursprungs konzentrationsabhängig (Abb. 2B). Dieser Befund wurde durch gereinigtes HlyA (Abb. 2B, Einsatz). Es ist erwähnenswert, dass in menschlichen Erythrozyten sowohl Apyrase als auch Hexokinase die HlyA-induzierte Hämolyse in niedrigeren Konzentrationen potenzierten. Die Unterscheidung könnte auf einen Unterschied im Expressionsmuster des P2-Rezeptors auf den roten Blutkörperchen zwischen den Spezies hindeuten.

Um die Relevanz dieses Befundes zu validieren, war es wichtig zu erfahren, ob P2-Rezeptorantagonisten die HlyA-induzierte Hämolyse beeinflussen. Der nichtselektive P2-Rezeptorantagonist PPADS verringerte konzentrationsabhängig die Hämolyse, die durch HlyA-produzierende E. coli in equinen, murinen und humanen Erythrozyten induziert wurde (Abb. 2C). Der EC50-Wert für PPADS betrug 520 µM, 400 µM bzw. 180 µM für humane, murine und equine Erythrozyten. Dieser Befund wurde für den gesamten Bereich der HlyA-Konzentrationen belegt (Abb. 2D) getestet an humanen Erythrozyten, die gereinigtem HlyA ausgesetzt waren. Die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung war mit dem kompetitiven Antagonismus kompatibel, und es sollte beachtet werden, dass die Wirkung selbst maximaler Toxinkonzentrationen durch den P2-Rezeptorblocker verringert wurde. Somit scheint die Aktivierung des P2-Rezeptors an der HlyA-induzierten Hämolyse beteiligt zu sein. Der nichtselektive P2-Rezeptorantagonist Suramin verringerte auch konzentrationsabhängig die HlyA-induzierte Hämolyse bei allen drei Spezies (Daten nicht gezeigt). In höheren Konzentrationen verursacht Suramin jedoch eine dramatische Erythrozytenschrumpfung und ist daher möglicherweise nicht zur Bewertung der P2-Rezeptor-Implikation in Erythrozyten geeignet.

Um zu beurteilen, ob die Wirkung des purinergen Antagonisten auf die Hämolyse lediglich ein Ergebnis einer erhöhten Osmolalität war, testeten wir die Wirkung von extrazellulärer Saccharose auf die HlyA-induzierte Hämolyse (Daten nicht gezeigt). Saccharose (1 mM) verringerte die Hämolyse nur geringfügig (5,1% ± 1,7%), während 10 mM und 75 mM Saccharose die Hämolyse deutlich verringerten (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Da die Konzentrationen der in dieser Studie verwendeten Antagonisten und ATPasen niemals 1 mM überschritten haben, kann der Effekt nicht auf eine erhöhte Osmolarität zurückzuführen sein. Unsere Ergebnisse spiegelten auch keine unselektive Bindung zwischen den Antagonisten und dem Toxin wider. Dies wurde an equinen Erythrozyten getestet, die mit HlyA für 10-15 Minuten bei 37 °C oder für 30 Minuten bei 4°C vorinkubiert, gründlich gewaschen und mit oder ohne Antagonisten resuspendiert wurden. Da HlyA während der Präinkubation in die Membran eingebaut wird, gingen die Erythrozyten in Abwesenheit von freiem HlyA zur Lyse über. Abb. S2 zeigt, dass verschiedene pharmakologische Interventionen die Hämolyse reduzierten, nachdem HlyA an die Erythrozyten gebunden war. Die Antagonisten waren jedoch weniger wirksam, wenn sie gewaschenen Erythrozyten zugesetzt wurden, in denen der lytische Prozess bereits eingeleitet war.

Welcher P2-Rezeptor(e) ist an der HlyA-induzierten Hämolyse beteiligt?

Erythrozyten exprimieren verschiedene Arten von P2-Rezeptoren. Zu den P2-Rezeptoren, von denen berichtet wurde, dass sie in reifen humanen Erythrozyten exprimiert werden, gehören P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) und P2X7 (16), während P2Y1, P2X1, P2X4 und P2X7 in erythroiden Vorläuferzellen vorhanden zu sein scheinen (17). Um zu testen, welcher dieser purinergen Rezeptoren an der HlyA-induzierten Hämolyse beteiligt ist, haben wir die betreffenden Rezeptoren einzeln angesprochen. Da der P2Y1-Rezeptor an der Sorbit-induzierten Hämolyse von Plasmodium-infizierten humanen und murinen Erythrozyten beteiligt ist (14), testeten wir, ob dieser Rezeptor für die HlyA-induzierte Hämolyse verantwortlich ist. Der P2Y1-Rezeptorantagonist MRS2179 beeinflusste die HlyA-induzierte Hämolyse nicht (Abb. S3A) in Konzentrationen (bis zu 500 µM), die über das hinausgehen, was zur Hemmung der Hämolyse in mit Plasmodium berghei infizierten Erythrozyten erforderlich war (14). Da es keine spezifischen Antagonisten für P2Y2-Rezeptoren gibt, untersuchten wir die Wirkung von HlyA in transgenen Mäusen. Die HlyA-induzierte Hämolyse war in Erythrozyten von P2Y2−/− und P2Y2+/+ Mäusen ähnlich (Abb. S3B). Im Falle des P2Y13 testeten wir den Antagonisten MRS2211, von dem berichtet wurde, dass er eine gewisse Selektivität gegenüber dem P2Y13-Rezeptor aufweist (18). MRS2211 verringerte die HlyA-induzierte Hämolyse signifikant in humanen und murinen Erythrozyten (Abb. S3C). Dieser Befund widerspricht unseren Ergebnissen mit Hexokinase (Abbau von ATP zu ADP), die den ADP-sensitiven P2Y13-Rezeptor eher stimulieren als hemmen sollte. Daher sollten Hexokinase und MRS2211 entgegengesetzte Ergebnisse liefern, wenn der P2Y13-Rezeptor beteiligt ist. Da dies nicht der Fall ist, ist der P2Y13-Rezeptor ein unwahrscheinlicher Kandidat für den P2-Rezeptor, der an der HlyA-induzierten Hämolyse beteiligt ist. Wir können nicht ausschließen, dass die von MRS2211 erzeugte Hemmung durch einen anderen P2-Rezeptor vermittelt wird.

Damit bleiben im Prinzip nur die P2X-Rezeptoren zu berücksichtigen. Abb. 3A zeigt, dass der nichtselektive Blocker von P2X-Rezeptoren Evans blue die HlyA-induzierte Hämolyse stark reduziert, was darauf hindeutet, dass ein P2X-Rezeptor an dieser Hämolyse beteiligt ist. Von den in Erythrozyten exprimierten P2X-Rezeptoren betrachteten wir den P2X7 aus folgenden Gründen als den wahrscheinlichsten Mediator der HlyA-induzierten Hämolyse. Es ist bekannt, dass die P2X7-Rezeptoren einen Übergang in einen höheren Permeabilitätszustand durchlaufen, der schließlich in bestimmten Zellen zur Lyse führt (12). Es wurde berichtet, dass der P2X7-Rezeptor mit dem Kanalprotein Pannexin1 interagiert (12), und der Komplex erzeugt eine beträchtliche Pore, die für größere Moleküle wie Ethidiumbromid durchlässig ist (13). Pannexin1 wird in menschlichen roten Blutkörperchen exprimiert (19) und wurde kürzlich als ATP-Freisetzungskanal in Erythrozyten vorgeschlagen (20). Um zu testen, ob P2X7-Rezeptoren an der HlyA-induzierten Hämolyse beteiligt sind, verwendeten wir Antagonisten mit relativer Selektivität für P2X7: Brilliant Blue G (BBG), ATP-2′,3′-Dialdehyd (OxATP) und KN-62 (21). Alle Antagonisten verringerten konzentrationsabhängig die Hämolyse in equinen, murinen und humanen Erythrozyten (Abb. 3). Pferdeartige und humane Erythrozyten waren gegenüber allen getesteten Substanzen empfindlicher als murine Erythrozyten. In diesem Zusammenhang ist zu erwähnen, dass der murine P2X7-Rezeptor bekanntermaßen weniger empfindlich gegenüber KN-62 ist als der humane Rezeptor (22). Der Schutz gegen Hämolyse durch P2X-Rezeptorantagonismus wurde erneut für den gesamten Konzentrationsbereich von gereinigtem HlyA in humanen Erythrozyten am Beispiel von BBG als P2X7-Antagonisten belegt (Abb. DREIDIMENSIONAL). Auch hier zeigt der Antagonist eine wesentliche Wirkung auf die HlyA-induzierte Hämolyse selbst unter HlyA-Konzentrationen, die eine maximale Hämolyse hervorriefen. Die Hemmung der Hämolyse durch OxATP wurde mit gereinigtem HlyA in murinen und humanen Erythrozyten nachgewiesen (Abb. 3E, Einsatz). Der neue selektive, kompetitive P2X7-Rezeptorantagonist A438079 reduzierte die Hämolyse in humanen Erythrozyten, war aber in murinen Erythrozyten weniger effizient (Abb. 3F). Immunblots von Plasmamembranfraktionen für den P2X7-Rezeptor bestätigen, dass humane und murine Erythrozyten ein Protein relevanter Größe exprimieren (66 kDa, Abb. 3G und vollständig in Fig. S4B). Es bedarf weiterer Untersuchungen, um den relativen Beitrag von P2X-Rezeptoren zur HlyA-induzierten Hämolyse vollständig festzustellen. Mit unseren derzeitigen Instrumenten können wir die Möglichkeit von Beiträgen anderer P2X-Rezeptoren an der HlyA-induzierten Hämolyse bei keiner der untersuchten Spezies ausschließen.

Abb. S4A zeigt die HlyA-induzierte Hämolyse in murinen (P2X7+/+ und P2X7−/−) Erythrozyten. Die murinen Erythrozyten zeigen unabhängig von ihrem Genotyp einen ähnlichen Hämolysegrad als Reaktion auf HlyA. Die P2X7-/- Mäuse und P2X7 +/+ Mäuse wurden ursprünglich von Pfizer erzeugt und in BALB / c-Hintergrund rückgekreuzt. Wir konnten keine Diskrepanzen zwischen der Empfindlichkeit gegenüber HlyA-induzierter Hämolyse in aus BALB / c- und C57BL / 6-Mäusen isolierten Erythrozyten feststellen (Daten nicht gezeigt), obwohl bekannt ist, dass der C57BL / 6-Stamm eine genetische Variation im C-Terminus des P2X7-Rezeptors aufweist (23). Diese Daten stimmen mit der winzigen Wirkung von A438079 auf murine Erythrozyten und der geringen Proteinexpression des P2X7-Rezeptors in murinen Erythrozyten überein (Abb. 3F und 3G).

Diese Ergebnisse implizieren, dass mindestens ein zusätzlicher P2-Rezeptor an der HlyA-induzierten Hämolyse in murinen Erythrozyten beteiligt ist. Da P2X1 und P2X7 ähnliche Inhibitorprofile für BBG, KN-62 und OxATP (24) aufweisen, haben wir die P2X1-Antagonisten MRS2159 und NF449 getestet. MRS2159 hemmte konzentrationsabhängig die Hämolyse in Erythrozyten von Pferd (EC50:150 µM) und Maus (EC50: ≈250 µM). Menschliche Erythrozyten waren relativ unempfindlich gegenüber dem Antagonisten, aber bei einer Konzentration über 250 µM sahen wir eine kleine und statistisch signifikante Reduktion (Abb. 4A). Dieser Effekt war viel ausgeprägter, wenn gereinigtes HlyA verwendet wurde (Abb. 4C). Dies impliziert, dass es Unterschiede in der zellulären Reaktion in Bezug darauf geben kann, ob sie HlyA in reiner Form oder in Kombination mit anderen E. coli-Bestandteilen ausgesetzt sind. NF449 hemmt konzentrationsabhängig die HlyA-induzierte Hämolyse beim Menschen (Abb. 4B). NF449 war in murinen Erythrozyten viel weniger effizient, da der murine P2X1-Rezeptor relativ resistent gegen diesen Inhibitor war (25). Es sollte betont werden, dass NF449, obwohl es ein Suraminderivat ist, nicht die gleichen Volumenänderungen in den Erythrozyten hervorruft wie Suramin. Es ist bekannt, dass Immunblots des P2X1-Rezeptors bis zu 4 Banden in verschiedenen Geweben aufweisen; eine 45 kDa nicht glykosylierte, eine 60 kDa glykosylierte und eine 95/120 kDa-Bande, die die polymerisierte Form des Rezeptors sein könnte (26, 27). In unseren Händen erkannte der P2X1-Rezeptor-Antikörper konsistent eine 45 KD-Bande und eine sehr schwache 60 kDa-Bande in Blots von Plasmamembranen aus murinen und humanen Erythrozyten (Abb. 4D). Interessanterweise fanden wir, dass das Expressionsniveau 60 kDa−Band in den P2X7− / – Mäusen im Vergleich zu Kontrollen (ähnlich in drei Präparaten, Abb. 4D). In diesem Immunoblot werden die Proteinspiegel angepasst, um eine Überlastung der Banden der P2X7− / − Mäuse zu vermeiden, wodurch die 60-kDa-Bande in den P2X7 + /+ -Mäusen fast nicht nachweisbar bleibt. Diese scheinbare Hochregulation des P2X1–Rezeptors könnte möglicherweise einen hämolytischen Phänotyp in den P2X7-Rezeptor-defizienten Mäusen verbergen. Zusammengenommen stützen diese Daten die Hypothese, dass sowohl der P2X1- als auch der P2X7-Rezeptor für die HlyA-induzierte Hämolyse relevant sind. Unsere Ergebnisse weisen auf signifikante Interspezies-Variationen hin, bei denen der P2X7-Rezeptor für die Hämolyse in menschlichen Erythrozyten wichtiger ist.

Die HlyA-induzierte Hämolyse wird durch Pannexin1-Antagonisten verhindert.

Carbenoxolon (28), Mefloquin und Probenecid (30) wurden als Antagonisten mit relativer Selektivität für Pannexin1 verwendet. Carbenoxolon verringerte den Hämolysegrad bei allen drei Spezies mit ähnlicher Empfindlichkeit signifikant (Abb. 5A). Die Wirkung von Carbenoxolon wurde erneut für den gesamten Bereich der HlyA-Konzentrationen getestet (gereinigtes Toxin, Abb. 5B), die auch bei maximalen HlyA-Konzentrationen deutliche Effekte zeigen. Mefloquin und Probenecid wurden nur an murinen und humanen Erythrozyten getestet. Die EC50 für Mefloquin betrug 25 µM in humanen und 18 µM in murinen Erythrozyten. Probenecid hemmte die Hämolyse in humanen Erythrozyten mit einer EC50 von 2 mm, war jedoch in murinen Erythrozyten weniger wirksam. Kürzlich wurde gezeigt, dass die bekannten Cl – Kanal-Antagonisten NPPB und Niflumsäure auch Pannexin-Kanäle hemmen (31). Beide Substanzen reduzierten die HlyA-induzierte Hämolyse, mit einer wesentlich stärkeren Wirkung auf humane Erythrozyten (Abb. S5).