Actomyosin-Kontraktilität skaliert mit Myoblast-Elongation und verbessert die Differenzierung durch YAP-Kernexport

Myoblasten nehmen eine längliche Form an, um ihr Aktin-Netzwerk zu differenzieren und auf den Ausbreitungsbereich zu regulieren

Um die Beziehung zwischen Zellform, Aktin-Netzwerk und fokalen Adhäsionen zu beurteilen, kultivierten wir C2C12-Myoblasten auf einer homogenen Schicht aus Fibronektin (FN). Nach 24 Stunden in Kultur wurden Myoblasten fixiert und zur Bestimmung ihrer morphologischen Parameter auf Aktin angefärbt (Abb. 1A). FN-beschichtete Substrate ermöglichten die Etablierung spezifischer Zell-Substrat-Wechselwirkungen durch Rekrutierung spezifischer Transmembranintegrine. In der Tat werden mehrere α-Integrin-Untereinheiten, die sich mit der β1-Untereinheit verbinden, während der Skelettmyogenese exprimiert, was für die myogene Zellmigration, die Myoblastfusion, die Muskelfaserreifung oder die Aufrechterhaltung der Muskelintegrität32,33 wichtig ist. Zusätzliche Experimente an Laminin(LAM)-beschichteten Substraten zeigten, dass sowohl morphologische Parameter (Zellformindex, Zellumfang und Zellfläche, Ergänzende Abb. 1A) und Zell-Substrat-Wechselwirkungen (Anzahl und Fläche fokaler Adhäsionen, Ergänzende Fig. 1B) waren auf FN und LAM statistisch ähnlich, was die FN-Beschichtung für die Untersuchung der Morphologien von C2C12-Myoblasten während des Fusions- / Differenzierungsprozesses in vitro validierte.

Abbildung 1

Myoblasten nehmen eine längliche Form an, um ihr Aktinnetzwerk zu differenzieren und auf den Ausbreitungsbereich zu regulieren. (A) Farbcodierte Epifluoreszenzbilder typischer C2C12-Einzelmyoblasten, die in vitro verschiedene Zellformindizes (CSI) aufweisen. Die Zellen wurden mit Phalloidin für Aktin gefärbt. Skalenstäbe sind 20 µm. Die morphologische Analyse von (B) dem CSI (R2 = 0,80), (C) dem Zellumfang (R2 = 0,97) und (D) der Zellfläche (R2 = 0.82) zeigen, dass in vitro kultivierte C2C12-Zellen eine mittlere Fläche von 2057 ± 618 µm2 und einen mittleren CSI von 0,37 ± 0,15 (n = 101 für B, C und D) aufwiesen. Rote Kurven sind Gaußsche Passungen. (E) Lineare Entwicklung der Fluoreszenzintensität von Aktin als Funktion der Zellfläche (R2 = 0,748, n = 28). Entwicklung der gesamten Vinculinfläche als Funktion von (F) der Zellfläche (R2 = 0,783, n = 28) und (G) und der Intensität von F-Aktin (n = 28). (H) Zeitleiste der Proliferation (in gelb) und Differenzierung (in rot) von C2C12-Myoblasten in vitro. Der schwarze Pfeil zeigt den Ersatz von Proliferationsmedien durch Differenzierungsmedien an. (I, J) Aspektverhältnis von Myoblasten bei P0, P2 (Proliferationsstadien, Mittelwert = 0,40 ± 0,16 bei P0, n = 150 für beide) und D2 (Differenzierungsstadium, Mittelwert = 0,24 ± 0,07, n = 100).

Wir quantifizierten den Cell Shape Index (CSI), der die Morphologie von Myoblasten charakterisierte, indem wir Informationen über die zelluläre Dehnung gaben. Abgerundete Zellen haben einen CSI nahe 1, während längliche Zellen einen CSI nahe 0 haben. Wir fanden CSI im Bereich von 0,1 bis 0,8 mit einem Mittelwert von 0.37 ± 0,15 (n = 101), was auf eine große Variabilität der Zellmorphologien hindeutet (Abb. 1B). Myoblasten zeigten einen mittleren Perimeter von 259 ± 82 µm (Abb. 1C, n = 101) und eine breite Palette von Ausbreitungsbereichen (von ~ 1000 bis ~ 4000 µm2) mit einem Mittelwert von 2057 ± 618 µm2 (Abb. 1D, n = 101). Diese an C2C12-Myoblasten gewonnenen Befunde wurden durch zusätzliche morphologische Messungen (CSI, Zellumfang und Zellfläche) an primären humanen Myoblasten verstärkt (16UBic, Ergänzende Abb. 2A), die aus dem Bizeps eines Patienten stammen, der von der FSHD nicht betroffen ist (d. h. denen bestätigt wurde, dass eine 4qA-Löschung fehlt). Wie in der ergänzenden Fig. 2B-D zeigen unsere Ergebnisse, dass der CSI von 16ubischen Myoblasten im Bereich von 0,14 bis 0,86 mit einem Mittelwert von 0,44 ± 0,17 (n = 90) lag, was auf eine große Variabilität der Zellmorphologien für menschliche Myoblasten hindeutet, wie sie für C2C12-Zellen beobachtet wurde. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass die Variabilität der Zellmorphologien nicht vom Zelltyp oder einem Artefakt der Zellkultur abhängt.

Als nächstes untersuchten wir die Verteilung von Aktinfilamenten in einer Population von C2C12-Myoblasten, um zu verstehen, ob die sich ausbreitenden Variabilitätsbereiche das Aktin-Zytoskelett modulieren können. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Gesamtfluoreszenzintensität des F-Aktin-Netzwerks linear mit dem zellulären Bereich zusammenhängt (Abb. 1E, n = 31, R2 = 0,748), was darauf hindeutet, dass je größer die Ausbreitung der Myoblasten ist, desto mehr Aktinfilamente gebildet werden. Wie in der ergänzenden Fig. 3 charakterisierten wir als nächstes die Verteilung von Vinculin-enthaltenen Adhäsionen, um zu bestimmen, wie Variationen der Zellform die Zell-Substrat-Wechselwirkungen in C2C12-Myoblasten beeinflussen. Wir fanden heraus, dass die Gesamtfläche der Zell-Substrat-Adhäsionen pro Zelle mit der Zellfläche zunahm (Abb. 1F, n = 31, R2 = 0,783) und mit der Fluoreszenzintensität von F-Aktin (Fig. 1G). Unsere Ergebnisse zeigen, dass C2C12-Myoblasten eine Vielzahl von Zellformen und Ausbreitungsbereichen annehmen, aber wiederum sowohl die Menge an Aktinfilamenten als auch Vinculinadhäsionen an ihre Ausbreitung anpassen. Um mehr Einblick in die Rolle der Zellform für die Differenzierung von Myoblasten zu erhalten, betrachten wir als nächstes die Entwicklung des Zellaspektverhältnisses während der Proliferations- (P0 nach 6 Stunden und P2 nach 48 Stunden) und Differenzierungsstadien (D2 nach 96 Stunden) (Abb. 1 STUNDE). Wie in Fig. 1I, J, unsere Ergebnisse zeigen, dass Myoblasten ihr Seitenverhältnis von 0,40 ± 0,16 (P0) auf 0,36 ± 0,09 (P2) und 0,24 ± 0,07 (D2) erhöht haben, was darauf hindeutet, dass sich Myoblasten signifikant verlängern und ein Seitenverhältnis von 1: 4 annehmen, um zu differenzieren. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die Aktin-Spannungsfasern bei D2 stark orientiert waren (Ergänzende Abb. 4A, B), entsprechend auch signifikanten Kerndehnungen (Ergänzende Fig. 4C). Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass das F-Aktin-Netzwerk durch Modifikationen der Myoblasten-Morphologie moduliert wird und zeigen, dass die Myoblasten-Differenzierung eine zelluläre Dehnung bis zu einem Aspektverhältnis von 1: 4 erfordert.

Die räumliche Organisation des Aktinnetzwerks und des Zellkerns wird durch die Myoblastmorphologie gesteuert

Wir kontrollierten die intrinsische Variabilität in Myoblastmorphologien, indem wir adhäsive Mikromuster verwendeten, um ihre Ausbreitungsbereiche zu standardisieren und ihre Formen zu kontrollieren. Mit Hilfe einer Mikrokontaktdrucktechnik20 haben wir klebende Mikromuster aus Fibronektin (FN) mit einer konstanten Fläche von 1600 µm2 und unterschiedlichen Geometrien erzeugt. Wir verwendeten abgerundete (CSI = 1), quadratische (CSI = 0,79), dreieckige (CSI = 0,60) und verschiedene Seitenverhältnisse von rechteckigen (CSI = 0,50 und 0,34 für 1: 4 und 1:7 Aspektverhältnisse) FN-Mikrostrukturen zur Kultivierung einzelner Myoblasten (Abb. 2A). Diese unterschiedlichen Geometrien von Mikrostrukturen ermöglichten es, die Myoblastenform in vitro über einen weiten Bereich zu standardisieren und ihre Ausbreitungsfläche zu kontrollieren.

Abbildung 2

Die räumliche Organisation des Aktinnetzwerks und des Zellkerns wird durch die Morphologie der Myoblasten bestimmt. (A) Epifluoreszenzbilder von C2C12-Zellen, die auf Fibronektin (FN) -Mikrostrukturen von 1600 µm2 gezüchtet und auf F-Aktin (grün), Kerne (blau) und Vinculin (rot) immunisiert wurden. Kreisförmige, quadratische, dreieckige und rechteckige (Seitenverhältnisse 1: 4 und 1:7) Mikromuster entsprechen CSI = 1, 0,79, 0,60, 0,50 bzw. 0,34. Skalenstäbe sind 20 µm. (B) Typische Beispiele für die räumliche Organisation von Aktinfilamenten in mikrostrukturierten C2C12-Zellen, die entsprechend ihrer Orientierung farbcodiert sind. Skalenstäbe sind 20 µm. (C) Orientierung des Aktinnetzwerks in abgerundeten (n = 12 in schwarz), quadratischen (n = 11 in rot), dreieckigen (n = 19 in Blau) und 1: 4 (n = 18 in grün) oder 1: 7 (n = 11 in rosa) rechteckigen mikrostrukturierten Myoblasten. Entwicklung von (D) dem nuklearen Aspektverhältnis und (E) der nuklearen Orientierung für verschiedene Geometrien von Myoblasten (10 ≤ n ≤ 15 für jeden CSI).

Um die Rolle der Zellgeometrie für die räumliche Organisation des Aktin-Zytoskeletts quantitativ zu bestimmen, haben wir die Orientierung der Aktinfilamente für jede Zellform bestimmt34,35. Mit Phalloidin gefärbte Aktinfilamente wurden in Abhängigkeit von ihrer Orientierung mit einem Farbverlauf von hellblau bei parallel (0°) zur horizontalen Achse angeordneten Aktinfilamenten und rot (+90°) oder orange (-90°) bei senkrecht zur horizontalen Achse angeordneten Aktinfilamenten farbcodiert (Fig. 2B). Wir beobachteten, dass Aktinfilamente in abgerundeten Zellen zufällig verteilt waren, mit Orientierungen im Bereich von -90 ° bis +90 °. Quadratische Zellen zeigten Aktinfilamente, die in drei Hauptwinkeldomänen organisiert waren: 0 ° bis 25 °, 50 ° bis 90 ° und -50 ° bis -90 °, während dreieckige Zellen Aktinfilamente zeigten, die hauptsächlich nach den drei Seiten des Musters bei 0 °, 60 ° und -60 ° organisiert waren. Interessanterweise fanden wir heraus, dass Aktinfilamente für rechteckige Zellen mit den Seitenverhältnissen 1: 4 (CSI = 0,50) und 1: 7 (CSI = 0,34) stark parallel zur langen Zellachse (0 °) ausgerichtet waren. Die Quantifizierung von vinculinhaltigen Adhäsionen zeigte keine statistischen Unterschiede der Adhäsionsbereiche zwischen den Zellmorphologien (Ergänzende Abb. 5A-C), während die Orientierung fokaler Adhäsionen durch die Zellform moduliert wurde (Ergänzende Fig. 5D,E), wie für Aktinfilamente beobachtet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl 1:4 als auch 1:7 rechteckige Myoblasten eine stärkere Organisation des Aktin-Zytoskeletts ermöglichen (Abb. 2C) und fokale Adhäsionen, was darauf hindeutet, dass die Verlängerung der Myoblasten zur Bildung kontraktiler Dipole führt.

In Anbetracht der Rolle des Zellkerns bei der Differenzierung von Myoblasten in Myotuben untersuchten wir als nächstes, ob Veränderungen der Zellform und der Zytoskelettarchitektur die Form und Orientierung des Kerns modulieren können36. Wir fanden heraus, dass das nukleare Aspektverhältnis mit der Senkung des CSI signifikant zunahm (Abb. 2D). In der Tat zeigten abgerundete Zellen (CSI = 1) auf kreisförmigen Mikrostrukturen einen abgerundeten Kern, der durch ein durchschnittliches Seitenverhältnis von 1,11 ± 0,06 gekennzeichnet war, während rechteckige Zellen mit einem Seitenverhältnis von 1: 4 (CSI = 0,50) und 1: 7 (CSI = 0,34) zeigten große Kerndeformationen mit Seitenverhältnissen von 1,39 ± 0,21 bzw. 2,19 ± 0,23. Wir bemerkten auch, dass die Orientierung des Zellkerns durch die Zellmorphologie moduliert wurde (Abb. 2E). Wir fanden heraus, dass die Ausrichtung des Kerns in abgerundeten, quadratischen und dreieckigen Zellen einen weiten Winkelbereich (von ~ 15 ° bis ~ 60 °) mit einer durchschnittlichen Ausrichtung von ~ 40 ° (kreisförmig, n = 11), ~ 33 ° (Quadrat, n = 14) und ~ 43 ° (Dreieck, n = 10) relativ zur horizontalen Achse. Für rechteckige Zellen zeigten unsere Ergebnisse, dass der Kern parallel zur Zellachse mit einem durchschnittlichen Winkel von ~ 14 ° (1: 4, n = 15) und ~ 2 ° (1: 7, n = 10) ausgerichtet war.

Die Zellverlängerung verbessert die Kontraktilität der Myoblasten

Die nächste Frage, die wir uns stellten, war, wie sich Veränderungen der Zellform auf die Kontraktilität der Myoblasten auswirken. Um diese Frage zu beantworten, verwendeten wir die Zugkraftmikroskopie (TFM), um die Zugspannungen zu bestimmen, die von mikrostrukturierten Myoblasten ausgeübt werden. Wie in Fig. 3A Wir beobachteten, dass die maximalen Spannungen an den Extremitäten der mikrostrukturierten Myoblasten ausgeübt wurden, unabhängig von der Zellform. Wie bereits bei anderen Zelltypen37 beobachtet, akkumulierte sich der kontraktile Stress bevorzugt in den Ecken (Quadrate und Dreiecke) oder an beiden Extremitäten (1: 4 und 1: 7 Rechtecke) von mikrostrukturierten Myoblasten. Wir quantifizierten den Gesamtstress einzelner mikrostrukturierter Myoblasten, um festzustellen, ob die Zellmorphologie die Zellkontraktilität moduliert. Wie in Fig. 3B zeigten gerundete Zellen (CSI = 1) eine Gesamtspannung von 170,7 ± 46,4 N/m2, während rechteckige Zellen (CSI = 0,34, Seitenverhältnis 1:7) eine größere Gesamtspannung (295,9 ± 156.8 N/m2), was darauf hindeutet, dass längliche Zellformen zu erhöhten Zugspannungen führen. Darüber hinaus fanden wir, dass rechteckig geformte Zellen (CSI = 0,34, Seitenverhältnis 1: 7) den größeren maximalen Spannungswert aufwiesen (684,3 ± 257,8 Pa, Abb. 3C), während gerundete Myoblasten den niedrigsten maximalen Spannungswert aufwiesen (351,5 ± 123,6 Pa). In Anbetracht dessen, dass die kontraktilen Spannungen an der Zellperipherie ausgeübt wurden und dass das Absenken des CSI zu erhöhten Zugspannungen führt, haben wir den maximalen Spannungswert als Funktion des Abstands vom Massenschwerpunkt zum Ende der Zelle aufgetragen (Abb. 3D), die 22,6 µm (CSI = 1), 28,28 µm (CSI = 0,79), 33,98 µm (CSI = 0,60), 41,23 µm (CSI = 0,50) und 53,45 µm (CSI = 0,34) darstellt. Wie in Fig. 3D, wir fanden heraus, dass die maximale kontraktile Spannung linear mit dem Abstand vom Schwerpunkt zum Ende der Zelle zunahm (R2 = 0.958, n = 65), Dies deutet darauf hin, dass längliche Morphologien von Myoblasten mehr Zugkräfte ausüben.

Um den Beitrag des Actomyosin-Netzwerks zum Aufbau kontraktiler Kräfte in Myoblasten zu bestimmen, wurden C2C12-Zellen mit dem G-Aktin-sequestrierenden Medikament Latrunculin B (LatB) und mit dem Myosin-II-Inhibitor Blebbistatin (Bleb) behandelt. Immunsupprimierte Myoblasten mit Phalloidin zeigten, dass LatB- und Bleb-behandelte Zellen ein diffuses Aktinnetzwerk aufwiesen (Abb. 3E), was zeigt, dass beide Medikamente die Organisation von F-Aktin signifikant beeinflussten. Wir verwendeten TFM auf mikrostrukturierten Myoblasten, die mit beiden Medikamenten behandelt wurden, um die Rolle des Actomyosin-Netzwerks bei der Etablierung kontraktiler Kräfte in Myoblasten unterschiedlicher Geometrien zu bestimmen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die LatB-Behandlung einen signifikanten Verlust der Kontraktilität induzierte, der mit der Zelldehnung zunahm. In der Tat zeigten abgerundete Zellen einen Verlust an kontraktiler Spannung von ~ 62%, während 1: 4 und 1:7 rechteckige Zellen, die mit LatB behandelt wurden, durch einen Verlust an kontraktiler Spannung von ~ 88% bzw. ~ 86% gekennzeichnet waren (Abb. 3F). Zusätzlich, Wir fanden heraus, dass die kontraktile Spannung von 1:4 rechteckige Zellen, die mit Bleb behandelt wurden, waren durch einen Verlust von ~ 80% der Kontraktionskraft gekennzeichnet, was zeigt, dass die molekularen Motoren von Myosin II Schlüsselfiguren der Kontraktionskräfte von Myoblasten sind.

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Kontraktilität des Actomyosin-Netzwerks in länglichen Myoblasten durch den Aufbau eines dichten Netzwerks paralleler Actomyosin-Fasern verbessert wird.

Die Kontraktilität von Zellpaaren nahm nach ihrer Fusion zu und basierte auf länglichen Mikrostrukturen

Um zu verstehen, wie die Myoblastenmorphologie die kontraktilen Eigenschaften von Myotuben beeinflussen kann, betrachten wir ein Minimalmodell von zwei Myoblasten. Wir haben zunächst die Zugkräfte bestimmt, die von Zelldubletten bei P1 (24 h in Proliferationsmedien) auf Mikrostrukturen unterschiedlicher Form ausgeübt werden (Ergänzende Abb. 6A). Es gab keine statistischen Unterschiede der kontraktilen Belastung zwischen dem breiten CSI-Bereich (Ergänzende Abb. 6B), trotz einer gut definierten Orientierung des Aktinnetzwerks (Ergänzende Fig. 6C) und die Kerne (Ergänzende Fig. 6D,E) auf 1:4 und 1:7 rechteckigen Mikromustern. Basierend auf dieser Beobachtung quantifizierten wir dann den kontraktilen Stress, der von Zelldubletten ausgeübt wurde, die auf kreisförmigen (CSI = 1) und rechteckigen (CSI = 0,50, 1: 7-Seitenverhältnis) FN-Mikrostrukturen während fünf zusätzlicher Tage kultiviert wurden (D5, Abb. 1H) in einem Medium. Wir verwendeten MitoTracker Red CMXRos (ThermoFisher Scientific), eine lebende Mitochondrienfärbung, um sicherzustellen, dass Myoblast-Dubletten fusioniert wurden (Abb. 4A)38. Wie in Fig. 4B, C, fanden wir, dass die gesamte kontraktile Spannung in fusionierten Zelldubletten, die auf kreisförmigen Mikrostrukturen gezüchtet wurden, leicht erhöht war (267 ± 64 Pa) im Vergleich zu kreisförmigen unfusionierten Zelldubletten (157 ± 37 Pa), während fusionierte längliche Dubletten mehr als doppelt so kontraktil waren (543 ± 193 Pa) als unfusionierte längliche Dubletten (211 ± 73 Pa). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die zelluläre Kontraktilität nach der Zellfusion zunahm und für längliche Morphologien signifikant erhöht war.

Abbildung 4

Die Kontraktilität von Zellpaaren nahm nach ihrer Fusion zu und erhöhte sich auf länglichen Mikrostrukturen. (A) Epifluoreszenzbilder von C2C12-Zellpaaren unfusioniert (D) und fusioniert (FD) auf kreisförmigen und rechteckigen (1: 7-Seitenverhältnis) FN-Mikrostrukturen und gefärbt für Mitochondrien mit Mito Tracker. Skalenstäbe sind 20 µm. (B) Repräsentative Karten des kontraktilen Stresses, der von C2C12-Zellpaaren ausgeübt wird, die auf kreisförmigen und rechteckigen FN-Mikrostrukturen fusioniert sind. (C) Entwicklung der Gesamtspannung für unfusionierte (D), (einfache Balken) und fusionierte (FD, Hash-Balken) C2C12-Zellpaare auf kreisförmigen (in grau) und rechteckigen (in lila) FN-Mikromustern. Kreis D: n = 8; Kreis FD: n = 5; Rechteck D: n = 6 und Rechteck FD: n = 8. **p < 0.01.

Actomyosin-Kontraktilität fördert Myotube Differenzierung

Wir fragten dann, ob die Actomyosin-Kontraktilität von Myoblasten Myotube Differenzierung beeinflussen könnte. C2C12-Myoblasten wurden auf FN-beschichteten Substraten in Proliferationsmedien für 2 Tage kultiviert (P2, Abb. 1H), um den zellulären Zusammenfluss zu erreichen. Dann wurden entweder LatB oder Bleb für 30 Minuten zugegeben und das Proliferationsmedium durch ein Differenzierungskulturmedium ersetzt. Nach 4 Tagen in Differenzierungsmedium (D4, Fig. 1H) wurden C2C12-Zellen fixiert und für DNA und TroponinT, einen Differenzierungsmarker, gefärbt (Abb. 5). Wir untersuchten die Wirkung von LatB- und Bleb-Behandlungen durch Färbung von Alpha-Aktinin auf Kontrollmyotuben (CTRL) und Myotuben, die mit Latrunculin B (+LatB) und Blebbistatin (+ Bleb) behandelt wurden. Wie in der ergänzenden Fig. 7 zeigen Kontroll-Myotubes typische gestreifte Z-Band-Muster, während LatB- und Bleb-Behandlungen Streifenmuster in Myotubes stören. Kontroll-Myotubes (CTRL) wurden durch ein mittleres Aspektverhältnis von 7,99 ± 3,38 charakterisiert (Abb. 5A) und einer positiven Troponin T-Fläche von 51,7 ± 5,6% (Fig. 5B). Unsere Ergebnisse zeigen, dass LatB- und Bleb-Behandlungen den Anteil der Troponin-T-Fläche auf 44,9 ± 5,2% bzw. 44,4 ± 5,1% verringerten. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass der Fusionsindex für LatB- (27 ± 3%) und Blebb-behandelte (29 ± 3%) Zellen statistisch niedriger war als für Kontrollzellen (38 ± 5%), was die Rolle der Actomyosin-Kontraktilität bei der Differenzierung von Myoblasten verstärkt (Abb. 5C). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Actomyosin-Kontraktilität von Myoblasten die Myotube-Differenzierung fördert.

Abbildung 5

Die Kontraktilität von Actomyosin fördert die Differenzierung der Myotuben. (A) Verteilung des Myotube-Aspektverhältnisses nach 4 Tagen in Differenzierungsmedien (n = 114, R2 = 0,915). Entwicklung von (B) dem Prozentsatz der positiven Fläche für Troponin T und (C) dem Fusionsindex in Kontrollzellen (CTRL), LatB- und Bleb-behandelten Zellen (jeweils n = 20). (D) Typische Epifluoreszenzbilder von Kontroll-Myotubes (Ctrl), LatB und Bleb-behandelten Myotubes, die nach 4 Tagen in Differenzierungsmedien gebildet wurden. Myotubes wurden immunostained für DNA (blau) und Troponin T (rot). Skalenstäbe sind 100 µm. *p < 0.05, **p < 0.01 und n.s. nicht signifikant.

Die Verlängerung der Myoblasten löst den YAP-Kernexport aus, der für die Differenzierung von Myoblasten in Myotuben unerlässlich ist

Um mehr Einblick in die intrazellulären Mechanismen zu erhalten, die die Differenzierung der Myotuben steuern, betrachten wir die Rolle von YAP, indem wir seine Lokalisation entweder im Zytoplasma oder im Kern von Myoblasten bestimmen, wo es an die TEAD-Transkription bindet und diese aktiviert faktoren39. Zu diesem Zweck quantifizierten wir das zytoplasmatische / nukleare YAP-Verhältnis in mikrostrukturierten Myoblasten (Abb. 6A und ergänzend Fig. 8). Zellverlängerung auf 1:4 und 1:7 rechteckige Mikrostrukturen erhöhten das zytosolische / nukleare YAP-Verhältnis (Abb. 6B), was darauf hindeutet, dass die Zellverlängerung den YAP-Kernexport durch nukleare Druckkräfte auslöst, die vom Actomyosin-Netzwerk ausgeübt40. Um zu überprüfen, ob die Lokalisation von YAP entweder im Zytoplasma oder im Zellkern mit bestimmten Stadien des Differenzierungsprozesses zusammenhängt, färbten wir YAP in C2C12-Zellen nach 24 h (P1) und 48 h (P2) des Proliferationsschritts und nach 96 h (D2) und 264 h (D9) des Differenzierungsschritts (Abb. 6C und ergänzend Fig. 9). Interessanterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass das zytoplasmatische / nukleare YAP-Verhältnis von 0,37 ± 0,07 bei P1 auf 0,68 ± 0,06 bei P2 und 0,67 ± 0,06 bei D2 anstieg und dann auf 0,42 ± 0,10 bei D9 abnahm (Abb. 6D). Interessanterweise wurde festgestellt, dass sich das zytoplasmatische / nukleare YAP-Verhältnis bei D9 statistisch nicht von den P1-Werten unterscheidet, was darauf hindeutet, dass das zytoplasmatische / nukleare YAP-Verhältnis in differenzierten Myotuben dem von Myoblasten ähnlich ist. Um diese Ergebnisse zu verifizieren, ernteten wir Myoblasten im Proliferationsstadium P1 (24 h) und im Differenzierungsstadium D2 (96 h) und isolierten ihr zytoplasmatisches und nukleares Material. Wir führten einen Bicinchoninsäure (BCA) -Proteintest durch und die in zytoplasmatischen und nuklearen Extraktionen enthaltenen Proteine wurden elektrophoretisch analysiert (Abb. 6E). Unsere Western-Blot-Befunde zeigten, dass das zytoplasmatische / nukleare YAP-Verhältnis von 0,62 ± 0,08 bei P1 auf 0,87 ± 0,24 bei D2 anstieg (Abb. 6F). Diese biochemische Quantifizierung von YAP zeigte einen signifikanten YAP-Kernexport bei der Differenzierung von C2C12-Zellen und stärkt unsere Ergebnisse.

Abbildung 6

Die Verlängerung der Myoblasten löst den YAP-Kernexport aus, der für die Differenzierung von Myoblasten in Myotubes wesentlich ist. (A) Epifluoreszenzbilder von C2C12-Zellen, die auf FN-Mikrostrukturen von 1600 µm2 gezüchtet und für YAP immunbestimmt wurden. Skalenstäbe sind 20 µm. (B) Verhältnis von Zytoplasma zu Kern-YAP für die verschiedenen Myoblasten-Morphologien (jeweils n = 10). (C) Epifluoreszenzbilder von konfluenten C2C12-Zellen, die für YAP an Tag 1 (P1, 24 h) des Proliferationsstadiums und an Tag 2 (D2, 96 h) und Tag 9 (D9, 264 h) des Differenzierungsstadiums immunisiert wurden. Skalenstäbe sind 100 µm. (D) Verhältnis von Zytoplasma zu Kern-YAP bei P1 (n = 50), P2 (n = 30), D2 (n = 30) und D9 (n = 30). (E) Western-Blot-Analyse der YAP (65 kDa) -Expression bei C2C12-Proliferation und -differenzierung. (F) Zytoplasmatische zu nukleare YAP-Ration (Mittelwert ± S.D.) während der Proliferation und Differenzierung (3 Replikate für jede Bedingung mit 20.106 Zellen / Replikat). (G) Verhältnis von Zytoplasma zu Kern-YAP bei D2 und (H) Fusionsindex für Kontroll- (CTRL) und Leptomycin (LMB) -behandelte Zellen bei D4. **p < 0.01, ****p < 0.0001 und n.s nicht signifikant.

Basierend auf diesen Ergebnissen bewerteten wir die Rolle von YAP, indem wir Leptomycin B verwendeten, um den aktiven Export aus dem Kern durch direkte Bindung an exportin141 zu blockieren. In der Tat haben Alberto Elosegui-Artola und Mitarbeiter kürzlich gezeigt, dass Leptomycin B (LMB) effizient eingesetzt werden kann, um zu untersuchen, wie kontraktile Kräfte, die vom Zytoskelett ausgeübt werden, die Kerntranslokation von YAP antreiben39. Durch die Behandlung von C2C12-Myoblasten bei P2 (48 h) mit LMB fanden wir, dass das zytoplasmatische zu nukleärem YAP-Verhältnis in LMB-behandelten Zellen bei D2 signifikant niedriger war (96 h, Abb. 6G), was darauf hindeutet, dass YAP hauptsächlich im Kern konzentriert ist, wenn der Kernexport gehemmt wird. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass der Fusionsindex bei D4 von LMB-behandelten Zellen (Abb. 6H) war sehr niedrig (3,8 ± 1.5%) im Vergleich zu Kontrollzellen (42,4 ± 9,1%), was zeigt, dass ein aktiver Kernexport für die C2C12-Differenzierung erforderlich ist.

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