I. Einführung
II. CAP-cAMP-Struktur
III. CAP-DNA-Interaktion
Iv. CAP-DNA-Alpha-CTD-Komplex
V. Referenzen
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I. Einleitung
Das links gezeigte Protein ist das Catabolite Activator Protein (CAP), auch bekannt als Cyclic AMP (cAMP) Receptor Protein (CRP), ein transkriptioneller Aktivator in E. coli. CAP aktiviert die Transkription einer Vielzahl von Genen, darunter viele, die am Metabolismus von Zuckern beteiligt sind (z. B. Gene, die Proteine kodieren, die am Metabolismus von Lactose, Galactose und auch Arabinose beteiligt sind). CAP bindet als Homodimer an spezifische DNA-Sequenzen stromaufwärts dieser Gene, jedoch nur, wenn das Protein mit cAMP komplex ist. CAP aktiviert die Transkription durch Kontakt mit RNA-Polymerase. So rekrutiert es beispielsweise am lac-Operon RNA-Polymerase für den Promotor, indem es mit der carboxyterminalen Domäne der Alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase (alphaCTD) interagiert. Dies erhöht die Häufigkeit der Transkriptionsinitiierung.
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Jedes Monomer besteht aus einer aminoterminalen Domäne, die für die Dimerisierung sowie die cAMP-Bindung verantwortlich ist, und einer carboxyterminalen Domäne, die an DNA bindet und auch mit Alpha-CTD interagiert (siehe unten). Diese Domänen sind durch eine kurze Scharniersequenz verbunden.
Die Dimerisierung ist weitgehend auf hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Aminosäureseitenketten der langen, zentralen Alpha-Helix in der N-terminalen Domäne jedes Monomers, der C-Helix, zurückzuführen.
cAMP ist in einer Tasche der N-terminalen Domäne jedes CAP-Monomers gebunden. Diese Tasche wird zwischen der C-Helix und einem Beta-Rollmotiv gebildet, das Beta-Stränge 1-8 enthält.
Zahlreiche elektrostatische Wechselwirkungen sind an der cAMP-Bindung beteiligt, darunter:
- eine Salzbrücke zwischen der Seitenkette von Arginin82 und einem Phosphatsauerstoff von cAMP
- Wasserstoffbrücken zwischen cAMP-Atomen und Seitenkettenatomen von Glutamat72, Serin83 und Threonin127
- Wasserstoffbrücken zwischen Hauptkettenatomen (Serin83) und cAMP
- eine Wasserstoffbrückenverbindung zwischen cAMP und einem Serin128 an der C-Helix des gegenüberliegenden Monomers.
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III. CAP-DNA-Interaktion
Das CAP-Homodimer (mit gebundenem cAMP) bindet eine 22-Basepaar-DNA-Konsensussequenz mit einer zweifachen Symmetrieachse:
CAP kann gesehen werden, um eine scharfe Biegung von ~ 90o in der Ziel-DNA zu induzieren .
Die C-terminale Domäne jedes CAP-Monomers enthält ein Helix-Turn-Helix (H-T-H) -DNA-Bindungsmotiv, das in den meisten bakteriellen Transkriptionsfaktoren gefunden wird. Dieses Motiv findet sich in modifizierter Form (der Homöodomäne) auch in einigen eukaryotischen Transkriptionsfaktoren. Das H-T-H-Motiv verleiht DNA-Bindungsspezifität. Die Erkennungshelix des Motivs wird in die DNA-Hauptnut eingefügt, wo basenfolgenspezifische Kontakte zur Verfügung stehen.
Bei der Untersuchung eines Monomers und seiner DNA-Halbstelle können zahlreiche Protein-DNA-Kontakte identifiziert werden, darunter:
- Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Erkennungshelixresten (arg180, glu181 und arg185) und Basen, die die DNA-Hauptrille auskleiden
- Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Erkennungshelixresten (ser179, thr182) und Phosphatoxygenen auf dem Rückgrat der DNA
- Wechselwirkung von Resten, die sich nicht in der Erkennungshelix befinden (z. val139, lys26) mit dem DNA-Rückgrat
Viele der CAP-DNA-Wechselwirkungen werden durch die Biegung der DNA als Reaktion auf die CAP-Bindung erleichtert.
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IV. CAP-DNA-Alpha-CTD-Komplex
Links ist ein CAP-Monomer (mit gebundenem cAMP) dargestellt, das mit einer DNA-Sequenz komplexiert ist, die eine Hälfte der Konsensus-CAP-Bindungssequenz plus die carboxyterminale Domäne der Alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase (alphaCTD) darstellt. Die C-terminalen und N-terminalen Domänen von CAP sind angegeben.
Die Aktivierung der Transkription durch CAP erfordert eine aktivierende Region (AR1) in der C-terminalen Domäne. AR1 ist eine Schleife von neun Resten (156-164). CAP-transkriptionelle Aktivierung erfordert auch den C-terminalen Rest von CAP (arg209). Sowohl AR1 als auch arg209 spielen eine Schlüsselrolle bei der CAP-Interaktion mit der Polymerase (alphaCTD). Zum Beispiel:
- Die Seitenkette des AR1-Restes thr158 bildet zwei Wasserstoffbrückenbindungen mit alphaCTD-Resten, eine mit thr285, die zweite mit glu286. Das Rückgrat Carbonyl von thr158 macht auch zwei Wasserstoffbrückenbindungen, eine mit thr285 und eine mit val287.
- van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen AR1 und alphaCTD tragen zur CAP-alphaCTD-Bindung bei.
- Das Rückgratcarboxylat des C-terminalen arg209 von CAP bildet mit arg317 von alphaCTD eine Salzbrücke. Die Seitenkette von arg209 ist an einer Wasserstoffbindung mit gly315 von alphaCTD beteiligt.
alphaCTD bindet an eine DNA-Sequenz, die 19 Basenpaare vom Zentrum der CAP-Bindungsstelle entfernt ist: 5′- A A A A A G – 3′. Die Bindung wird durch ausgedehnten Kontakt des DNA-Rückgrats durch alphaCTD-Reste und durch wasservermittelte H-Bindungen zwischen Protein und DNA-Basen erreicht. Zum Beispiel:
- Asn268, gly296, lys298 und ser299 bilden H-Bindungen mit mehreren DNA-Phosphatoxygenen.
- Obwohl kein direkter Kontakt zwischen alphaCTD und DNA-Basen hergestellt wird, verbinden wasservermittelte H-Bindungen arg265 mit mehreren Basen in der DNA-Nebennut, in die dieser Rest eindringt (Wasserwasserstoffe nicht gezeigt).
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IV. Referenzen
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