- Zusammenfassung
- 1. Einleitung
- 2. Materialien und Methoden
- 2.1. Tiere
- 2.2. Zellkulturen
- 2.3. Immunfluoreszenzfärbungstest
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Quantitative (Echtzeit-) Polymerase-Kettenreaktion (Echtzeit-PCR)
- 2.6. Statistische Analyse
- 3. Ergebnisse
- 3.1. Die Verteilung der mit NDRG2, GFAP und S100ß markierten Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen
- 3.2. Die Morphologien von Astrozyten, die durch NDRG2, GFAP und S100ß in verschiedenen Hirnregionen markiert sind
- 3.3. Die Kolokalisierung von NDRG2, GFAP und S100ß innerhalb von Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen
- 3.4. Die Expression von NDRG2-, GFAP- und S100ß-Proteinen in verschiedenen Hirnregionen
- 4. Diskussion
- Datenverfügbarkeit
- Offenlegung
- Interessenkonflikte
- Beiträge der Autoren
- Danksagung
- Ergänzende Materialien
Zusammenfassung
Astrozyten besitzen unterschiedliche morphologische Eigenschaften, abhängig von der zerebralen Region, in der sie gefunden werden. Keiner der aktuellen Astrozytenmarker kann jedoch alle Subpopulationen erfolgreich markieren. Daher ist die Identifizierung des geeigneten Markers für eine bestimmte wissenschaftliche Untersuchung von entscheidender Bedeutung. Hier, Wir verglichen die Verteilung und Proteinexpression von drei Astrozytenmarkern: NDRG2, GFAP und S100ß im Kortex, Hippocampus und Thalamus. NDRG2- und S100ß-positive Astrozyten waren im gesamten Großhirn gleichmäßiger verteilt als GFAP-positive Astrozyten. NDRG2- und S100ß-Immunoreaktivitäten waren im dorsalen Cortex und Thalamus am stärksten, während die GFAP-Immunoreaktivität im Hippocampus am stärksten war. Darüber hinaus waren die Proteinexpressionsspiegel von NDRG2, GFAP und S100ß bei erwachsenen Mäusen im Kortex, Hippocampus und Thalamus am höchsten. Wir haben auch die Astrozytenmorphologie nachgewiesen und festgestellt, dass im Corpus callosum und im Hirnstamm GFAP-positive Astrozyten mit zahlreicheren und längeren Prozessen gefunden wurden als NDRG2- und S100ß-positive Astrozyten. Diese Ergebnisse zeigen, dass NDRG2 und S100ß besser geeignet sind, um die Gesamtverteilung und Veränderungen in der Anzahl der Astrozyten sowie die Markierung von Astrozyten im Kortex und Thalamus zu visualisieren. GFAP wird jedoch geeigneter verwendet, um Astrozyten im Corpus callosum, im Hirnstamm und im Hippocampus zu kennzeichnen. Diese Ergebnisse helfen den Forschern bei der Auswahl geeigneter Astrozytenmarker und schlagen Unterschiede in den immunologischen Eigenschaften von Astrozyten vor, die auf dem Gewebe basieren, in dem sie gefunden werden.
1. Einleitung
Astrozyten gelten seit langem als Hilfszellen, die Neuronen nur trophisch, metabolisch und strukturell unterstützen . In den letzten Jahren haben umfangreiche Forschungen jedoch gezeigt, dass sie eine entscheidende Rolle bei den physiologischen und pathologischen Funktionen des Gehirns spielen. Astrozyten helfen bei der Aufrechterhaltung der Ionenhomöostase und der Blut-Hirn-Schranken, der Synapsenbildung und -entfernung sowie bei der Kontrolle des zerebralen Blutflusses und der Regulierung des Neurotransmitter-Recyclings, der Glutamat-Excitotoxizität und des antioxidativen Stresses . Wichtig ist, dass Astrozyten morphologische, Populations- und funktionelle Unterschiede in verschiedenen Hirnregionen besitzen . Daher ist die Identifizierung des am besten geeigneten Markers für die polymorphen und multiplen Untergruppen von Astrozyten entscheidend für die Erforschung der astrozytischen Aktivität.Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) ist der am häufigsten verwendete astrozytäre Marker, aber als das wichtigste Zwischenprodukt, das das Zytoskelett zusammensetzt, GFAP immunmarkiert nur etwa 15% des gesamten Astrozytenvolumens , und mehr als 40% der Astrozyten wurden im Hippocampus der erwachsenen Ratte als GFAP-negativ befunden . Zusätzlich markierte GFAP protoplasmatische menschliche Astrozyten schlecht und wurde spät in der Entwicklung von fibrösen Astrozyten exprimiert .Ein weiterer häufig verwendeter Astrozytenmarker ist S100ß, ein Ca2 + -Bindungspeptid, das im Zytoplasma und im Kern von Astrozyten reichlich vorhanden ist und an der Regulation des Zellzyklus und der Modifikation des Zytoskeletts beteiligt ist . S100ß wird jedoch auch in einer Subpopulation reifer Oligodendrozyten, in den Plexus choroideus-Epithelzellen und in einigen Neuronen exprimiert . Die Mängel von GFAP und S100ß bei der Markierung von Astrozyten können zu Ungenauigkeiten oder sogar Fehlern bei der Erforschung der Funktionen von Astrozyten führen.
N-Myc Downstream-reguliertes Gen 2 (NDRG2) wurde zuerst in einer normalen menschlichen zerebralen cDNA-Bibliothek durch eine PCR-basierte subtraktive Hybridisierungsmethode entdeckt . Es ist ein Tumorsuppressor und ein zellstressbezogenes Gen, das mit der Zellproliferation und -differenzierung assoziiert ist . NDRG2 ist in der Großhirnrinde, im Riechkolben, im Mittelhirn, im Hippocampus und im Thalamus weit verbreitet . Am wichtigsten ist, dass NDRG2 spezifisch in Astrozyten des Gehirns exprimiert wird . Daher wird NDRG2 als neuartiger Astrozytenmarker angesehen, insbesondere für reife, nicht reaktive und nicht proliferierende Astrozyten . Ob NDRG2 jedoch zuverlässiger ist als GFAP und S100ß als astrozytischer Marker sowie die Unterschiede ihrer Verteilung und Expression in verschiedenen Hirnregionen, wurde nicht berichtet.
In der aktuellen Studie verglichen wir die Verteilung, Proteinexpression und gegenseitige Kolokalisierung der astrozytischen Marker NDRG2, GFAP und S100ß im gesamten Großhirn von Mäusen. Wir wollten den am besten geeigneten Marker für Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen identifizieren.
2. Materialien und Methoden
2.1. Tiere
Junge, erwachsene und alte männliche C57BL/ 6-Mäuse im Alter von 1 Monat, 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten und 12 Monaten wurden vom Experimental Animal Center der Central South University erhalten. Die Tiere konnten frei essen und trinken, bei einer Temperatur von 25 ± 1 ° C gehalten und mit einem 12: 12-h-Hell-Dunkel-Kreis untergebracht werden, um den zirkadianen Rhythmus des Tieres zu simulieren. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der eingesetzten Tiere zu reduzieren. Alle tierexperimentellen Verfahren folgten einem Protokoll, das von der Ethikkommission für Tierversuche des Central South University Animal Care and Use Committee, China, genehmigt wurde.
2.2. Zellkulturen
Die HT22-Zellen (eine neuronale Zelllinie) und MA1800-57-Zellen (eine Astrozytenzelllinie) wurden in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, HyClone) kultiviert, das 10% fetales Rinderserum (FBS, Gibco), 50 U/ ml Penicillin und 50 µg/ml Streptomycin enthielt. Die OLN-93-Zellen (eine Oligodendrogliazelllinie) wurden in DMEM gehalten, ergänzt mit 10% FBS, 2 mM Glutamin, 50 U / ml Penicillin und 50 µg / ml Streptomycin. Die Zellen wurden alle bei 37 °C in einer Mischung aus 95% atmosphärischer Luft und 5% CO2 gehalten. Die HT22-Zellen, OLN-93-Zellen und MA1800-57-Zellen wurden auf Objektträgern ausgesät und mit Antikörpern gegen Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2), α-Tubulin bzw.
2.3. Immunfluoreszenzfärbungstest
Nachdem die Mäuse mit Natriumpentobarbital (50 mg / kg) anästhesiert worden waren, wurden ihre Großhirne extrahiert und mit 0,9% kalter heparinisierter Kochsalzlösung und 4% Paraformaldehyd fixiert. Nach der Postfixation wurden die Großhirne nacheinander in 20% igen Saccharose- und 30% igen Saccharoselösungen dehydratisiert. Schnitte von 10 µm Dicke wurden mit einem Leica CM1900 Frozen Slicer hergestellt. Die zerebralen Abschnitte wurden inkubiert 1% H2O2 für 15 min und 0.3% Triton X-100 für 15 min, mit 3× Wäschen in PBS Postinkubation zwischen jeder Behandlung. Die Schnitte wurden dann in 5% normalem Ziegenserum für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und über Nacht bei 4°C in einer Befeuchtungsbox mit Primärantikörpern wie folgt inkubiert: Maus-Anti-GFAP-Antikörper (#3670, 1:500, Cell Signaling Technology); Kaninchen-Anti-NDRG2-Antikörper (#5667, 1:200, Cell Signaling Technology); Maus-Anti-NDRG2-Antikörper (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); Kaninchen-Anti-S100ß-Antikörper (# 2017-1, 1:500, Epitomics); Maus-Anti-Glutaminsynthetase (GS) -Antikörper (#MAB302, 1:200, Millipore); Kaninchen-Anti-MAP2-Antikörper (#ab32454, 1:500, Abcam); und Maus-Anti-α-Tubulin-Antikörper (#T6199, 1:500, Sigma). Anschließend wurden die Schnitte mit Mischungen aus Alexa-488 (grün, Invitrogen) und Alexa-647 (rot, Invitrogen)-konjugierten Esel-Anti-Kaninchen- oder Esel-Anti-Maus-Sekundärantikörpern für 2 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) wurde zum Färben von Kernen verwendet. Die Profile wurden mit 50% Glycerin bestückt. Schließlich wurden die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop Olympus BX51 (Japan) betrachtet und fotografiert. Die in unserer Studie verwendeten Antikörper wurden in unseren früheren Studien und von anderen Forschern häufig verwendet , und die Empfindlichkeit und Spezifität dieser Antikörper wurde bestätigt.
2.4. Western Blot
Cortex, Hippocampus und Thalamus wurden von C57BL/6-Mäusen im Alter von 1 Monat, 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten und 12 Monaten entnommen. Die Proben wurden in RIPA-Puffer homogenisiert und die Konzentration der Proteinproben mittels BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, US) gemessen. Die Proteinproben wurden durch 10% SDS-PAGE (SDS-PAGE Gel Kit, CW0022S, China) getrennt und elektrisch auf Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen transferiert. Die Komponenten des SDS-PAGE-Gel-Kits umfassten ein 30% Acr-Bis, SDS-PAGE-Trenngelpuffer, SDS-PAGE-Stapelgelpuffer, APS (Ammoniumpersulfat) und TEMED (N, N, N ‚, N‘-Tetramethylethylendiamin). Anschließend wurden die Membranen in 5% fettfreier Trockenmilch verdünnt in TBST (TBS mit 0,05% Tween 20) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert und anschließend mit spezifischen Primärantikörpern inkubiert: Maus-Anti-GFAP-Antikörper (#3670, 1:1000, Cell Signaling Technology); Kaninchen-Anti-NDRG2-Antikörper (#5667, 1:1000, Cell Signaling Technology); Kaninchen-Anti-S100ß-Antikörper (#2017-1, 1:1000, Epitomics); und Kaninchen-Anti-GAPDH-Antikörper (#5174, 1:1000, Cell Signaling Technology) über Nacht bei 4°C. Anschließend wurden die Membranen mit einem HRP-konjugierten sekundären Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-Antikörper (Thermo Scientific, USA) für 2 h. Chemilumineszenzsignale wurden mit Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer Life Sciences) entwickelt; Wellesley, MA) und von einem Bildanalysator LI-COR Odyssey System (LI-COR Biotechnology, USA) detektiert. Die Immunreaktivität von Proteinbanden wurde mit der Bio-Rad® Image Lab™ Software quantitativ analysiert. Banddichtewerte wurden auf GAPDH normalisiert.
2.5. Quantitative (Echtzeit-) Polymerase-Kettenreaktion (Echtzeit-PCR)
Cortex, Hippocampus und Thalamus wurden von C57BL/6-Mäusen im Alter von 1 Monat, 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten und 12 Monaten gesammelt. Die Gesamt-RNA wurde mit einem TransZol Up Plus RNA Kit (Code-Nr. ER501-01, Transgen, China) und quantifiziert mit einem NanoDrop 2000. Dann wurden 1000 ng Gesamt-RNA in einer 20 µL Reaktion bei 42°C für 15 min reverse transkribiert, gefolgt von 85°C für 5 sec unter Verwendung eines TransScript® All-in-One First-Strang cDNA Synthesis SuperMix für qPCR (Code No. AT341, Transgen, China). Die Komponenten des Kits umfassten einen 5×TransScript® All-in-One SuperMix für qPCR (TransScript® RT, RNase-Inhibitor, Anchored Oligo(dT)18 Primer, Random Primer(N9), dNTPs, Buffer), einen 5×TransScript® All-in-One No-RT Control SuperMix für qPCR, einen gDNA Remover und ein RNase-freies Wasser. Als Negativkontrolle wurde der 5×TransScript® All-in-One No-RT Control SuperMix für qPCR verwendet. Real-time PCR wurde in einer 20 µL Reaktion gemäß Herstellerhandbuch für TransStart Tip Green qRNA SuperMix (Code-Nr. AQ141, Transgen, China). Die verwendeten mRNA-Primersequenzen sind Tabelle 1 zu entnehmen. Die Reaktion wurde bei 94 °C für 30 sec durchgeführt, gefolgt von 40 Zyklen von 94 °C für 5 sec, 60 °C für 15 sec und 72 °C für 19 sec auf dem ViiA7 Real-Time PCR Detection System (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems). Die aus der relativen mRNA-Expression abgeleiteten Primer und Sequenzen wurden unter Verwendung der Formel analysiert.
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2.6. Statistische Analyse
Statistische Tests wurden mit der Software PRISM v7.0 (GraphPad) durchgeführt. Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung von T-Tests der Schüler durchgeführt. Vergleiche zwischen verschiedenen Gruppen wurden unter Verwendung von Einweg-ANOVA mit Tukeys Posttest durchgeführt. Alle Werte wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Werte von p<0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. Die Verteilung der mit NDRG2, GFAP und S100ß markierten Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen
Die Regionen des Mäusehirns wurden durch Markierung der Zellkerne identifiziert. Zusätzlich wurde ein entsprechender Maus-Gehirnatlas verwendet, um die spezifischen analysierten Regionen zu verifizieren (Abbildung 1). Wir verwendeten dann eine Immunfluoreszenzfärbung, um die Verteilung von mit NDRG2, GFAP und S100ß markierten Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen erwachsener männlicher Mäuse im Alter von 6 Monaten nachzuweisen. NDRG2- und S100ß-positive Astrozyten waren häufiger und gleichmäßiger verteilt als GFAP-positive Astrozyten im gesamten Großhirn (Abbildung 2). NDRG2-positive Astrozyten waren im dorsalen Kortex (Region 1) und Thalamus (Region 5) konzentriert, jedoch weniger im Hippocampus (Region 4), Corpus callosum (Region 3) und ventralen Kortex (Region 2) und am wenigsten im Hirnstamm (Region 6) (Abbildungen 2 (a) und 2 (b)). GFAP-positive Astrozyten waren am stärksten im Hippocampus konzentriert; weniger wurden im Corpus callosum und im Hirnstamm nachgewiesen und fast nicht nachweisbar im dorsalen Cortex, ventralen Cortex und Thalamus (Abbildungen 2 (a) und 2 (c)). S100ß-positive Astrozyten konzentrierten sich am stärksten im dorsalen Kortex und Thalamus, weniger im Hippocampus und ventralen Kortex und am wenigsten im Hirnstamm und Corpus callosum (Abbildungen 2 (b) und 2 (c)). Die Verteilung der NDRG2-positiven Astrozyten war ähnlich der der S100ß-positiven Astrozyten.
(ein)
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Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen zeigten ungleiche Immunoreaktivitäten gegenüber NDRG2, GFAP und S100ß (Abbildung 2). Astrozyten im dorsalen Cortex und Thalamus reagierten stark auf NDRG2 und S100ß, aber schwach auf GFAP. Astrozyten im Hippocampus reagierten stark auf GFAP und mäßig auf NDRG2 und S100ß. Astrozyten im ventralen Cortex, Corpus callosum und Hirnstamm reagierten schwach bis mäßig auf NDRG2, GFAP und S100ß (Tabelle 2).
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+++: stark positiv; ++: mäßig positiv; +: schwach positiv.
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Die Verteilung der mit NDRG2, GFAP und S100ß markierten Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen männlicher Mäuse war ähnlich wie bei alten männlichen Mäusen (12 Monate) (Abbildung 3).
3.2. Die Morphologien von Astrozyten, die durch NDRG2, GFAP und S100ß in verschiedenen Hirnregionen markiert sind
Astrozyten werden hauptsächlich in zwei Typen unterteilt: fibröse Astrozyten in der weißen Substanz und die protoplasmatischen Astrozyten in der grauen Substanz. Daher verglichen wir die Morphologien der beiden Typen, die durch verschiedene Marker im Corpus callosum (weiße Substanz, Region 3) und im Hippocampus (graue Substanz, Region 4) markiert sind (Abbildung 4). Die Ergebnisse von erwachsenen männlichen Mäusen (6 Monate) zeigten, dass die NDRG2- und S100ß-positiven Astrozyten eine sternförmige Form aufwiesen, die durch großes und rundes Soma sowie kurze und grobe zytoplasmatische Prozesse mit wenigen Verzweigungen gekennzeichnet war. Die GFAP-positiven Astrozyten zeigten eine radiale Form, die durch kleines Soma, lange Prozesse und Mehrverzweigungen gekennzeichnet ist (Abbildung 4). Darüber hinaus zeigten die mit GFAP markierten Astrozyten im Corpus callosum und im Hirnstamm häufigere längere Prozesse als die mit NDRG2 und S100ß markierten (Abbildungen 5 und 7).
3.3. Die Kolokalisierung von NDRG2, GFAP und S100ß innerhalb von Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen
NDRG2 wurde fast mit GFAP in Astrozyten des ventralen Kortex, Corpus callosum und Hirnstamm kolokalisiert und meist mit GFAP in Astrozyten des Hippocampus kolokalisiert (Abbildungen 5 und 8 (a)). NDRG2 hatte fast keine Kolokalisation mit GFAP in Astrozyten des dorsalen Kortex und Thalamus (Abbildung 5). NDRG2 und S100ß zeigten eine nahezu vollständige Kolokalisation in Astrozyten der sechs Hirnregionen (Abbildungen 6 und 8 (b)). GFAP und S100ß zeigten eine signifikante Kolokalisierung in Astrozyten des ventralen Kortex, des Corpus callosum und des Hirnstiels und eine nahezu vollständige Kolokalisierung in Astrozyten des Hippocampus (Abbildung 7). GFAP und S100ß hatten fast keine Kolokalisation in Astrozyten des dorsalen Kortex und Thalamus (Abbildung 7).
(a)
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(c)
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(e)
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Wir haben auch eine Kolokalisierung von NDRG2 und einem anderen astrozytären Hersteller, der Glutaminsynthetase (GS), in Astrozyten des Großhirns von Mäusen nachgewiesen. NDRG2 und GS hatten eine signifikante Kolokalisierung in Astrozyten (Abbildung s1a). NDRG2 und GS zeigten eine gründliche Kolokalisierung in fibrösen Astrozyten des Corpus callosum und in protoplasmatischen Astrozyten des Hippocampus (Abbildung s1b). Die NDRG2-Proteinexpression in den Zellen der neuronalen Zelllinie HT22, der Oligodendrogliazelllinie OLN-93 und der Astrozytenzelllinie MA1800-57 wurde ebenfalls nachgewiesen (Abbildung s2). NDRG2-Protein wurde in MA1800-57-Zellen nachgewiesen und in HT22-Zellen und OLN-93-Zellen kaum nachgewiesen (Abbildungen s2a und s2b).
3.4. Die Expression von NDRG2-, GFAP- und S100ß-Proteinen in verschiedenen Hirnregionen
Wir verwendeten Western Blotting, um die Expressionsniveaus von NDRG2-, GFAP- und S100ß-Proteinen in drei Hirnregionen von erwachsenen männlichen Mäusen (6 Monate) nachzuweisen: Kortex, Hippocampus und Thalamus (Abbildung 8(c)). Wir analysierten die Expressionsniveaus dieser Marker in derselben Hirnregion (Abbildung 8 (d)). Im Cortex war das Niveau der NDRG2-Expression deutlich höher als das Niveau der GFAP- und S100ß-Expression (p<0,001, p<0,05). Das Expressionsniveau von S100ß war ebenfalls viel höher als das von GFAP (p<0.05). Im Hippocampus war das Niveau der GFAP-Expression höher als NDRG2 und S100ß (p<0.01), und das Niveau der NDRG2-Expression war etwas geringer als das S100ß-Expressionsniveau, obwohl der Unterschied statistisch nicht signifikant war. Im Thalamus war das Expressionsniveau von S100ß signifikant höher als das von GFAP und NDRG2 (p<0,01), während das Niveau der NDRG2-Expression dem von GFAP ähnlich war.
Als nächstes analysierten wir die Expressionsniveaus desselben Markers in verschiedenen Hirnregionen (Abbildung 8(e)). Das Niveau der NDRG2-Expression im Kortex war viel höher als im Hippocampus und Thalamus (p<0,01), und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Hippocampus und Thalamus beobachtet. Das Niveau der GFAP-Expression im Hippocampus war das höchste unter den drei Regionen (p<0,001, p<0,01); Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Kortex und Thalamus beobachtet. Das Niveau der S100ß-Expression im Thalamus war signifikant höher als im Cortex und Hippocampus (p<0.01), wobei zwischen den beiden letzteren kein signifikanter Unterschied beobachtet wurde.Wir haben auch die Proteinspiegel von NDRG2, GFAP und S100ß im Kortex, Hippocampus und Thalamus männlicher Mäuse im Alter von 1 Monat, 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten und 12 Monaten nachgewiesen (Abbildungen 9 (a) -9 (f)). Die Proteinspiegel von NDRG2 und GFAP im Kortex, Hippocampus und Thalamus nahmen mit zunehmendem Alter allmählich zu (p<0,05, p<0,01). Die Proteinspiegel von S100ß im Kortex und Thalamus, jedoch nicht im Hippocampus, nahmen mit zunehmendem Alter allmählich zu (p<0.05, p<0,01, p<0,001). Die mRNA-Spiegel von NDRG2, GFAP und S100ß im Cortex, Hippocampus und Thalamus männlicher Mäuse im Alter von 1 Monat, 3 Monaten, 6 Monaten, 9 Monaten und 12 Monaten stimmten mit denen der Proteinspiegel überein (p <0,05, p < 0,01, Abbildungen 9 (g) -9 (i)).
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(h)
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4. Diskussion
In dieser Studie fanden wir heraus, dass Astrozyten, die mit NDRG2 und S100ß markiert waren, im gesamten Großhirn junger, reifer und alter Mäuse weiter und gleichmäßiger verteilt waren als die mit GFAP markierten. Dies deutet darauf hin, dass NDGR2 und S100ß geeignetere Marker sind, um die Gesamtverteilung und die Zahlenänderungen von Astrozyten zu beobachten. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen unterschiedliche Immunreaktivität gegenüber NDRG2, GFAP und S100ß zeigten, was darauf hindeutet, dass NDRG2 und S100ß im Cortex und Thalamus geeignetere astrozytische Marker sind als GFAP. Die unkontrollierbare Immunreaktivität von Astrozyten gegenüber NDRG2, GFAP und S100ß könnte auch auf die Empfindlichkeit und Spezifität der von uns verwendeten Antikörper zurückzuführen sein. Zusätzlich waren die Morphologien von Astrozyten, die durch NDRG2 und S100ß markiert wurden, einander ähnlich, unterschieden sich jedoch offensichtlich von denen, die durch GFAP markiert wurden, da diese Marker unterschiedliche Zytoskelettstrukturen markierten. NDRG2 färbt das Zytoplasma und die Zellmembranen und färbt den Zellkern schwach . GFAP färbt hauptsächlich das Soma und die Prozesse, aber nicht den Kern, während S100ß den Kern und einen Teil des Zytoplasmas und der Prozesse färbt . Durch den Vergleich der Morphologien von Astrozyten, die mit NDRG2, GFAP und S100ß markiert waren, fanden wir heraus, dass GFAP ein geeigneterer Marker für Astrozyten im Corpus callosum, im Hirnstamm und insbesondere im Hippocampus war. Die Proteine NDRG2 und S100ß wurden am meisten im Cortex bzw. Thalamus exprimiert. Wir schließen daraus, dass NDRG2 für Astrozyten im Kortex besser geeignet ist, während S100ß für Astrozyten im Thalamus besser geeignet ist, wenn die Astrozytendichte quantifiziert wird. Die unterschiedlichen Proteinexpressionsmuster von NDRG2, GFAP und S100ß im Cortex, Hippocampus und Thalamus bestätigten die astrozytische funktionelle Heterogenität.Es wurde festgestellt, dass Astrozyten eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen und aktiv an fast allen neurologischen Störungen wie ischämischen Schlaganfällen, traumatischen Hirnverletzungen, Alzheimer und Parkinson beteiligt sind . Es wurde gezeigt, dass sich Astrozytenmorphologie, Genexpression und Funktion in verschiedenen Regionen des Großhirns unterschieden . Fibröse Astrozyten und protoplasmatische Astrozyten sind zwei große Subpopulationen, die durch ihre Morphologie identifiziert werden . Faserige Astrozyten haben lange, dünne Prozesse und ein sternartiges Aussehen, während die protoplasmatischen zahlreiche feine Prozesse haben, die Synapsen kontaktieren und umhüllen . Interessanterweise werden viele Gene heterogen von Teilmengen von Astrozyten exprimiert. Diese Gene kodieren Proteine wie Glutamattransporter und Ionenkanäle sowie Glutamat- , Dopamin- und Opioidrezeptoren .
Die Heterogenität der Genexpression implizierte die funktionelle Vielfalt der Astrozyten. Zum Beispiel unterscheidet sich die Glutamataufnahme zwischen verschiedenen Teilmengen . Zusätzlich unterscheiden sich spontane Kalziumoszillationen zwischen verschiedenen Schichten des somatosensorischen Kortex. Kortikale Astrozyten der Schicht 1 zeigten häufige asynchrone Ca2 + -Aktivität, während Astrozyten der Schicht 2/3 selten synchrone Ca2 + -Aktivität zeigten . Im Kortex reagieren Astrozyten auf Glutamat und Noradrenalin mit einem Anstieg des Kalziums, während Hippocampus-Astrozyten Kalziumreaktionen auf ATP, GABA, Glutamat, Acetylcholin, Prostaglandine und Endocannabinoide aufweisen . Studien haben auch gezeigt, dass kultivierte Astrozyten aus verschiedenen Hirnregionen unterschiedliche Fähigkeiten haben, das Wachstum und die Verzweigung von Neuriten zu stimulieren . Da Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen unterschiedliche Morphologie- und Funktionsmerkmale aufweisen, ist die Identifizierung des am besten geeigneten Markers für Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen für Astrozytenforscher von entscheidender Bedeutung.
Obwohl berichtet wurde, dass mehrere Proteine selektiv von Astrozyten exprimiert werden, wurde gezeigt, dass keines vollständig auf alle astrozytischen Subtypen beschränkt ist. GFAP, der am weitesten verbreitete astrozytäre Marker, wird bevorzugt in weißen Astrozyten gegenüber grauen exprimiert und markiert nicht alle Prozesse von Astrozyten . Noch wichtiger ist, dass es Teilmengen von GFAP-negativen Astrozyten gibt, die spannungsabhängige K + -Ströme darstellen, während die GFAP-positiven Astrozyten das klassische Muster von zeit- und spannungsunabhängigen Strömen darstellen .Frühere Studien fanden heraus, dass S100ß in der Lage war, Astrozyten sowohl in der grauen als auch in der weißen Substanz zu markieren; Es wurde jedoch auch in einigen Oligodendrozyten und Neuronen exprimiert . Es wurde festgestellt, dass S100ß am stärksten in Thalamus-Astrozyten exprimiert wird, einem Subtyp von Zellen, die an der Reinigung von daergen Trümmern beteiligt sind, die durch die Degeneration von daergen Terminals bei der Parkinson-Krankheit erzeugt werden, indem sie das Vorhandensein von Lysosomen und die Bildung von Autophagosomen erleichtern . Die transkriptomische Analyse von Astrozyten identifizierte die Aldehyddehydrogenase 1-Familie, Mitglied L1 (ALDH1L1), als astrozytären Marker . ALDH1L1 markierte jedoch auch Oligodendrozyten . In ähnlicher Weise hatten die exzitatorischen Aminosäuretransporter Glutamat / Aspartattransporter (GLAST), Glutaminsynthetase (GS), Glutamattransporter-1 (GLT-1), Vimentin, Connexin 43, Aquaporin 4 und das Zelloberflächenglykoprotein CD44 auch Einschränkungen bei der Markierung von Astrozyten .
NDRG2 wird spezifisch in Astrozyten von Ratten und Mäusen exprimiert und ist mit dem Wachstum und der Reifung des sich entwickelnden embryonalen Gehirns assoziiert . Neben Zellproliferation, Differenzierung und Transmembrantransporten ist NDRG2 auch an Stressreaktionen, Depressionen, ischämischen Erkrankungen und neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt . Bei Mäusen und Menschen ist NDRG2 an der Entwicklung der Aufmerksamkeitsdefizit- / Hyperaktivitätsstörung (ADHS) beteiligt, einer Erkrankung, die mit dem Bewegungszentrum in der Großhirnrinde assoziiert ist . Flugge et al. detektierte die Expression von NDRG2 im Großhirn von Menschen, Äffchen, Spitzmäusen, Ratten und Mäusen und schlug vor, dass NDRG2 ein neuer Astrozytenmarker sei, insbesondere für reife, nicht reaktive und nicht proliferierende Astrozyten . In dieser Studie haben wir zunächst das Verteilungsmuster von NDRG2-positiven Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen und Unterschiede zu den mit den klassischen Markern GFAP und S100ß markierten Astrozyten nachgewiesen.
Astrozyten und Astrozytenmarker veränderten sich während der normalen Gehirnalterung. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Astrozyten früh im Alter aktiviert werden, und der signifikante Anstieg von GFAP-positiven Astrozyten wurde in den Hippocampusregionen gealterter Mäuse gefunden . Die Spiegel von GFAP-Protein und GFAP-mRNA stiegen in verschiedenen Teilen alternder Gehirne an, wie z. B. in der Großhirnrinde, im Hippocampus und im Kleinhirn . Es bestehen weiterhin Diskrepanzen zwischen verschiedenen Berichten über S100ß im alternden Gehirn . Zunehmend haben Studien gezeigt, dass NDRG2 mit altersbedingten Erkrankungen wie Alzheimer assoziiert ist. In unserer Studie nahmen die Spiegel von GFAP- und NDRG2-mRNA im Kortex, Hippocampus und Thalamus mit zunehmendem Alter allmählich zu, während die Spiegel von S100ß-mRNA im Hippocampus und Thalamus mit zunehmendem Alter zunahmen, jedoch nicht im Kortex.
Wir sollten beachten, dass derzeit viele Marker zusätzlich zu den von uns getesteten, wie ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 und Vimentin, verwendet werden, um Astrozyten zu markieren. In unserer Studie verglichen wir nur die klassischen zerebralen Astrozyten, die mit dem neuartigen vorgeschlagenen Marker NDRG2 markiert sind, und die am häufigsten verwendeten Marker: GFAP, S100ß und GS im Großhirn.Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass NDRG2 und S100ß geeignetere Marker für Astrozyten im Cortex bzw. Thalamus sowie für die Beobachtung der Gesamtverteilung und der Veränderungen der Anzahl der Astrozyten im gesamten Großhirn sind. Inzwischen ist GFAP NDRG2 und S100ß überlegen, wenn es die Prozesse und Zweige von Astrozyten im Corpus callosum, im Hirnstamm und insbesondere im Hippocampus markiert. Unsere Studie zeigt, wie wichtig es ist, den am besten geeigneten Marker für Astrozyten in verschiedenen Hirnregionen der Maus auszuwählen, der neurowissenschaftlichen Forschern bei der Erforschung astrozytischer Funktionen eine Anleitung bietet.
Datenverfügbarkeit
Die Daten, die zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie verwendet wurden, sind im Artikel enthalten.
Offenlegung
Zengli Zhang und Zhi Ma sind die Co-Erstautoren.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Beiträge der Autoren
Zengli Zhang und Zhi Ma trugen gleichermaßen zu dieser Studie bei.
Danksagung
Diese Arbeit wurde von der Beijing Natural Science Foundation (Nr. 7194321 an Lixia Zhang), der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81801138 an Yulong Ma, Nr. 81771206 an Wangyuan Zou), dem Young Scholar Research Grant der Chinese Anesthesiologist Association (Nr. 21700001 an Yulong Ma), der Miaopu Foundation of Chinese PLA Allgemeines Krankenhaus (Nr. 18KMM47 an Lixia Zhang) und die Beijing Municipal Science & Technology Commission (Nr. 1811000017180022 an Hang Guo).
Ergänzende Materialien
Ergänzende Abbildung 1. Die Kolokalisierung von NDRG2 und GS in Astrozyten. Ergänzende Abbildung 2. Die Expression von NDRG2-Protein in Zelllinien. (Ergänzende Materialien)