Der Resistenzmechanismus von Escherichia coli induziert durch Ampicillin im Labor

Einführung

Pathogene Escherichia coli verursacht häufig Durchfall, Sepsis und andere klinische Symptome und ist immer noch einer der wichtigsten Darmpathogene, die die Gesundheit von Mensch und Tier beeinträchtigen. Ampicillin (AMP), ein halbsynthetisches β-Lactam-Antibiotikum, wird häufig zur Behandlung von E. coli-Infektionen bei Menschen und Tieren eingesetzt, aber in letzter Zeit hat seine Resistenzrate zugenommen.1-3 AMP wirkt auf das aktive Replikationsstadium von Bakterien und hemmt die Synthese der bakteriellen Zellwand. Bakterien widerstehen häufig solchen Antibiotika auf die folgenden Arten: kodiert β-Lactamase, ändert das Zielprotein in der Zellwand, verringert die Durchlässigkeit der äußeren Membran und erhöht den Ausdruck der Drogenausflusspumpe. Antibakterielle Medikamente werden von Tieren verwendet und dann über Exkremente in die Umwelt gelangen, was nicht nur die Umwelt verschmutzt, sondern auch der menschlichen Gesundheit und der nachhaltigen Entwicklung der Zuchtindustrie großen Schaden zufügt.4,5

Es wurde gezeigt, dass die Whole-Genome-Sequencing (WGS) die Prävention und Kontrolle von Bakterienresistenzen steuert.6 Der Einzelnukleotidpolymorphismus (SNP) bezieht sich hauptsächlich auf den DNA-Sequenzpolymorphismus, der durch die Variation eines Einzelnukleotids auf genomischer Ebene verursacht wird, und die Resequenzanalyse zum Screening der verschiedenen SNPs kann die Arzneimittelresistenz direkter untersuchen. Wir simulierten den Prozess klinischer Antibiotika in Organismen mit der Methode der AMP-Laborinduktion und untersuchten den Zusammenhang zwischen dem Grad der Arzneimittelresistenz und der Mutationsstelle. Screening auf nicht-synonymen Einzelnukleotidpolymorphismus (Nicht-SNP) zwischen arzneimittelresistenten und anfälligen Stämmen, um die Rolle von Nicht-SNP in arzneimittelresistenten Stämmen zu verstehen. Der Zweck dieser Studie ist es, das Gesetz und den Mechanismus der Arzneimittelresistenz von E. coli zu verstehen, neue Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika bereitzustellen, Antibiotika rationell einzusetzen und das mehrfache Auftreten und die Behandlung von Multiresistenz von E. coli in der klinischen Praxis.

Materialien und Methoden

Bakterienisolate und Reagenz

Der in dieser Studie verwendete E. coli-Stamm (E. coli 15743) wurde 2015 aus einer Stuhlprobe eines Patienten in einem Krankenhaus in Suixian, Provinz Henan, China, isoliert. Die Charakterisierung dieses Stammes durch die Papierdiffusionsmethode von Kirby Bauer (K-B) zeigte, dass der Stamm gegenüber acht Klassen von 20 Antibiotika empfindlich war. E. coli ATCC 25922 wurde als Kontrolle für unsere Studie verwendet.

M-H brühe medium und M-H feste medium (Oxoid unternehmen, UK), Pharma empfindliche papier (Hangzhou Binhe mikrobielle unternehmen, Hangzhou, China), AMP standard produkte (Chinesische drug identification Institute, Peking, China), DNA extraktion kit (Shanghai Laifeng Biotech unternehmen, Shanghai, China). Illumina Hiseq wurde bei Shanghai Lingen Biotechnology Co., Ltd.

Das im Experiment verwendete E. coli wurde speziell für diese Studie isoliert. Die Studie wurde von der Ethikkommission für Biowissenschaften der Universität Zhengzhou genehmigt, und der Patient unterzeichnete auch eine schriftliche Einverständniserklärung.

Induktionsprozess

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) wurde durch die Microbroth-Verdünnungsmethode bestimmt.7-9 Der Stamm von E. coli (isoliert aus klinischen und haben MHK-Wert), die empfindlich auf AMP ist, wurde in MH festes Medium kultiviert, 37 ° C Kultur nach 18-24 Stunden, wählen Sie eine einzelne Kolonie in 8 ml M-H flüssiges Medium zur Amplifikation von Bakterien. Die obige Bakterienlösung wurde in M-H-Flüssigmedium kultiviert, das jeweils 1 / 2MIC AMP enthielt, und die AMP-Konzentration wurde während des Subkulturprozesses kontinuierlich erhöht. Wenn die Antibiotikakonzentration 16 µg / ml erreichte, wurden jedes Mal 8 µg / ml erhöht und jede Konzentration zweimal subkultiviert. Wenn der Wert der MHK-Änderung eines Arzneimittels vor und nach der Induktion größer oder gleich dem Vierfachen MHK war, wurde davon ausgegangen, dass die MHK-Änderung nach der Induktion eine signifikante Bedeutung hatte.10 Das Kulturmedium der M-H-Brühe ohne Antibiotika wurde als Kontrolle während des gesamten Prozesses verwendet.

Multifokale Sequenztypisierung (MLST) von E. coli-Stämme wurden durch sieben Paare von Haushaltsgenen klassifiziert, die adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA und recA enthielten.

Suszeptibilitätstests

Kirby Bauer Papier Diffusionsmethode wurde verwendet, um die E. coli zu screenen, die auf acht Arten von Antibiotika empfindlich war, einschließlich Aminoglykoside, Penicilline, Cephalosporine, Tetracyclin, β-Lactamase-Inhibitoren, Carbamate, Sulfonamide und Chinolone. Die induzierten Stämme wurden unter Verwendung eines Arzneimittelempfindlichkeitstests wiederholt. Die Dateninterpretation wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute 2016 durchgeführt.11

Zuerst induzierten wir eine E. coli-Resistenz gegen AMP, indem wir E. coli kultivierten und die AMP-Konzentration schrittweise erhöhten (2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, und 256 µg/ml). Nachdem wir einen Resistenzstamm erhalten hatten, verglichen wir das Resistenzspektrum von 20 Antibiotika zwischen dem induzierten Stamm (E. coli 15743-256, induziert bei 256 µg / ml) und dem ursprünglichen Stamm (E. coli 15743) durch Durchführung von Arzneimittelempfindlichkeitstests. Die Bakteriensuspension wurde auf eine Agarplatte mit einem kleinen kreisförmigen Stück Papier, das verschiedene Antibiotika enthielt, verteilt und 16-20 Stunden bei 37 ° C kultiviert. Der Ringdurchmesser wurde gemessen.

WGS- und Resequenzanalyse

Die Stämme mit MHK-Werten von 32 und 256 wurden als E. coli 15743-32 bzw. E. coli 15743-256 bezeichnet. Die Analyse des gesamten Genoms wurde an den primären sensitiven Stämmen durchgeführt, und die Resequenzierung wurde an induzierten resistenten Stämmen durchgeführt. Die Ergebnisse der Resequenzierung wurden mit denen der ursprünglichen Karte verglichen. Screening von Nicht-SNPs, die die Proteinfunktion beeinträchtigen können.

Die Sequenzierung wurde von Shanghai ling’en Biotechnology Co. durchgeführt. Ltd. (Shanghai, China). Illumina Hiseq wurde in Kombination mit der Sequenzierungstechnologie der dritten Generation verwendet, um die genomische Sequenzierung der Stämme in diesem Projekt abzuschließen.

RT-PCR

Entfernen Sie die reverse transkribierte DNA aus dem 4 ° C Gefrierschrank und bereiten Sie die gewünschte Konzentration des Reagenzes gemäß den Anweisungen vor. Schalten Sie das ABI Fast7500-Gerät ein, stellen Sie 95 ° C für 30 s ein, reagieren Sie für 40 Zyklen, 95 ° C für 3 s, 60 ° C für 30 s und lösen Sie die Kurve für 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 60 s und 95 ° C für 15 s auf. Geben Sie die Probe in das 8-reihige EP-Röhrchen, drei Replizierschächte pro Probe, und entfernen Sie die Blasen durch Zentrifugation. Der durchschnittliche CT-Wert jeder Probe wurde nach Beendigung der Reaktion aufgezeichnet. Das relative Expressionsniveau des interessierenden Gens wurde unter Verwendung von 2−ΔΔCT berechnet. (ΔCT = CT-Wert des Zielgens-CT-Wert des internen Referenzgens. ΔΔCT = experimentelle Probe ΔCT – Kontrollgruppe ΔCT.)

Bioinformatische Analyse

SWISS-MODEL-Software wurde verwendet, um die Aminosäuresequenz des Proteins vor und nach der Genmutation zu analysieren und die Proteintertiärstruktur vorherzusagen.12,13

Statistische Analyse

SPSS17.0 wurde für die einfache lineare Regressionsanalyse verwendet und die Regressionsgleichung getestet. Größe eines Tests war 0,05 (α = 0,05).

Ergebnisse

Drug susceptibility test results

Unsere Daten zeigten, dass E. coli 15743 gegenüber 20 verschiedenen Antibiotika empfindlich war. Nach der Induktion, E. coli 15743-256 war resistent gegen AMP, Piperacillin, Cefuroxim, Cefazolin, Cefoxitin, AMP / Sulbactam, Amoxicillin / Clavulansäure, Piperacillin / Tazobactam und Aztreonam, aber immer noch empfindlich gegenüber den verbleibenden 11 Antibiotika (Tabelle 1, Beachten Sie, dass sie auch als Arzneimittelresistenz definiert wurden). Unsere Ergebnisse zeigten, dass ursprünglich empfindliche E. coli nicht nur induziert resistent gegen AMP, sondern auch resistent gegen eine Vielzahl anderer Antibiotika war und während der Induktion multiresistent wurde.

Tabelle 1 Antibakterieller Ringdurchmesser von Escherichia coli

Das Auftreten von Arzneimittelresistenz (bestimmt durch den MHK-Wert) während der Induktion

Um die Kinetik der Arzneimittelresistenz zu untersuchen, kultivierten wir E. coli mit zunehmender AMP-Konzentration für verschiedene Zeiträume und maßen die MHK bei jeder Konzentration, wie in Tabelle 2 angegeben. Die Regressionsanalyse wurde für den MHK-Wert und die Induktionszeit unter Verwendung von SPSS 17.0 durchgeführt. Die Regressionsgleichung war y = 1,0435lnx-0,7316. Der Anpassungseffekt der Gleichung wurde ausgewertet, R2=0,9605, P<0,05. Der MHK-Wert, der 32 µg / ml erreicht, ist der kritische Wert, und der MHK-Wert stieg vor Erreichen von 32 µg / ml schneller an als danach (Tabelle 2).

Tabelle 2 Der MIC-Wert von E. coli 15743 über die Zeit und induzierte Konzentration

Unterdessen wurde der Teil mit einem MHK-Wert kleiner oder gleich 32 µg/ ml für die Regressionsanalyse ausgewählt, und die Regressionsgleichung war y =0,0358x+1,2812. Der Anpassungseffekt der Gleichung wurde ausgewertet, R2=0,991, P<0,05. Der MHK-Wert von E. coli 15743 nahm mit zunehmender Induktionskonzentration und Induktionszeit zu (Abbildung 1).

Abbildung 1 Die Änderung des MIC-Wertes im Laufe der Zeit.Abkürzung: MIC, minimum inhibtiveconcentration.

MLST-Ergebnisse

Um zu zeigen, dass der induzierte Stamm (E. coli 15743-256) tatsächlich vom ursprünglichen Stamm (E. coli 15743) abgeleitet wurde, führten wir MLST der beiden oben genannten Stämme durch. Genomische DNA wurde durch bakterielles DNA-Extraktionskit extrahiert, PCR amplifiziert und von Sangon Biotech (Shanghai) Co. sequenziert., Ltd. Die Suche in der NCBI-Datenbank ergab, dass diese beiden Stämme identisch sind, MLST-Typ, adk-13, fumC-363, gyrB-302, icd-97, mdh-17, purA-94 und recA-93. Unsere Daten zeigen, dass der Induktionsprozess nicht kontaminiert war und der resistente Stamm E. coli 15743-256 vom sensitiven Stamm E. coli 15743 abgeleitet wurde.

Whole-genome analysis

E. coli 15743 enthielt 4408 Gene, 22 rRNA und 85 tRNA. Die Gendichte betrug 0,945 kb, der GC-Gehalt 51.7%, der Genprozentsatz betrug 88,3%, die Länge der intergenen Region betrug 545.151, der GC-Gehalt der intergenen Region betrug 42,6% und die intergene Region machte 11,7% des Genoms aus. Die Eigenschaften von E. coli 15743-Genomen sind in Abbildung 2 zusammengefasst. E. coli 15743 enthielt keine Plasmide.

Abbildung 2 Die genomische Karte von E. coli 15743.Hinweise: Die äußerste kreis der kreis karte ist die genom-größe logo, jeder skala ist 0.1 Mp. Der zweite und dritte Kreis sind CDS auf der positiven und negativen Kette, und die verschiedenen Farben zeigen verschiedene Zahnradklassifizierungen der CDS an. Der vierte Kreis ist rRNA oder tRNA. Der fünfte Kreis ist der GC-Gehalt, und der äußere rote Teil zeigt an, dass der GC-Gehalt in der Region höher ist als der durchschnittliche GC-Gehalt des gesamten Genoms. Je höher der Spitzenwert ist, desto größer ist die Differenz zum durchschnittlichen GC-Gehalt, und der nach innen gerichtete blaue Teil zeigt an, dass der GC-Gehalt in der Region niedrig ist. Für den durchschnittlichen GC-Gehalt des gesamten Genoms zeigt ein höherer Peak eine größere Differenz zum durchschnittlichen GC-Gehalt an. Der innerste Kreis ist der GC-Skew-Wert. Der spezifische Algorithmus ist G-C oder G + C. Wenn der Wert im biologischen Sinne positiv ist, neigt die positive Kette dazu, CDS zu transkribieren. Wenn es negativ ist, neigt die negative Kette dazu, CDS zu transkribieren.Abkürzung: COG, Cluster orthologer Gruppen von Proteinen.

Die Genomkarte des Stammes umfasst die Verteilung der Gene auf den Ketten von Sense und Antisense, die funktionelle Klassifizierung von Clustern orthologer Proteingruppen (COG), den GC-Gehalt, die Genominsel und homologe Gene, die die Merkmale des Genoms vollständig anzeigen können.

COG

Die funktionelle Klassifikation von COG von E. coli 15743 zeigte, dass die meisten Gene mit Aminosäuretransport und -metabolismus, Kohlenhydrattransport und -metabolismus, Energieproduktion und -umwandlung, nur allgemeiner Funktionsvorhersage, anorganischem Ionentransport und -metabolismus und Zellhüllenbiogenese zusammenhängen (Abbildung 3).

Abbildung 3 Die funktionelle Klassifizierung von COG von E. coli 15743.Abkürzung: COG, Cluster von orthologen Gruppen von Proteinen.

Nicht-SNPs

Um festzustellen, ob es nach Induktion des Originalstamms eine Veränderung im E. coli-Genom gab, führten wir eine genomweite Sequenzierung der induzierten resistenten Stämme durch (E. coli 15743-32 und E. coli 15743-256) und analysierte die Anzahl der Mutationen und den Ort der Mutation.Im Vergleich zum ursprünglichen E. coli-Stamm (E. coli 15743) gab es neun Nicht-SNPs in zwei induzierten arzneimittelresistenten Stämmen, darunter drei gemeinsame Nicht-SNPs, die in den Genen orf00819, orf01200 und orf02235 vorhanden waren. Andere Nicht-SNPs waren in den Genen orf01916, orf00490, orf03479, orf04094 vorhanden. Drei Nicht-SNPs-Mutationen traten im orf03479-Gen auf, und nur eine SNP-Mutation trat in jedem der verbleibenden Gene auf. Drei Nicht-SNPs befanden sich in Genen, die für Zellmembranproteine kodieren. Drei waren in Genen mit unbekannten Funktionen. Einer bezog sich auf den Transport und Metabolismus anorganischer Ionen, einer auf die Transkription und einer auf Signaltransduktionsmechanismen (Tabelle 3).

Tabelle 3 Die Nicht-SNPs-Analyseergebnisse von E. coli 15743-32 und E. coli 15743-256

Unsere Daten zeigten, dass es in E. coli 15743-32 vier Nicht-SNPs gab, die auf vier Genen lagen. Es gab acht Nicht-SNPs in E. coli 15743-256, verteilt auf sechs Gene. Die funktionelle Klassifizierung von COG zeigte, dass die meisten Gene mit Aminosäuretransport und -metabolismus, Kohlenhydrattransport und -metabolismus, Energieproduktion und -umwandlung, nur allgemeiner Funktionsvorhersage, anorganischem Ionentransport und -metabolismus und Zellhüllenbiogenese zusammenhängen.

RT-PCR

Re-Sequenzierung des gesamten Genoms von E. coli 15743-32 und E. coli 15743-256, fluoreszierender quantitativer Echtzeit-PCR-Nachweis von Konsensusgenen. Die Gene, in denen Nicht-SNPs vorkommen, wurden gescreent, und E. coli 15743-32 und E. coli 15743-256 hatte drei identische Gene (orf00819, orf01200, orf02235), und die Expressionsniveaus dieser Gene in jedem Generationsstamm sind in Abbildung 4A–C dargestellt.

Abbildung 4 Ergebnisse der mRNA-Expression in verschiedenen Generationen von Stämmen.

RT-PCR zeigte, dass die Gene orf01200, orf00819, orf02235 eine hohe Expression in resistenten Stämmen (E. coli 15743-32, E. coli 15743-64, E. coli 15743-128, E. coli 15743-256).

Proteinstrukturvorhersage

Die Tertiärstruktur ändert sich nur in Proteinen, die von den Genen orf01200 und orf04094 kodiert werden, und die vorhergesagten Ergebnisse sind in den Abbildungen 5 und 6 dargestellt.

	Abbildung 5 Die Tertiärstruktur des Proteins, das vom orf01200-Gen kodiert wird.Anmerkungen: (A) Vor der Mutation; (B) nach der Mutation.
	Abbildung 6 Die Tertiärstruktur des Proteins durch orf04094 Gen kodiert.Anmerkungen: (A) Vor der Mutation; (B) nach der Mutation.

Vor der Mutation von orf01200, 2hrt.1.A wurde als Referenzschablonenprotein ausgewählt (Abbildung 5A). Die Modellpalette der verbleibenden Infrastruktur betrug 2-1033, die Sequenzähnlichkeit 0.59, und die Vorlage Abdeckung war 1.00. Nach der Mutation von orf01200, 1iwg.1.A wurde als Referenzschablonenprotein ausgewählt (Abbildung 5B). Die Modellpalette der verbleibenden Infrastruktur betrug 7-1036, die Sequenzähnlichkeit 0,59 und die Vorlagenabdeckung 1,00.

Vor der Mutation von orf04094, 4cti.1.B wurde als Referenzschablonenprotein ausgewählt (Abbildung 6A). Die Modellpalette der verbleibenden Infrastruktur betrug 184-436, die Sequenzähnlichkeit 0,56 und die Vorlagenabdeckung 0,59. Nach der Mutation von orf04094, 3ib7.1.A wurde als Referenzschablonenprotein ausgewählt (Abbildung 6B). Die Modellpalette der verbleibenden Infrastruktur betrug 10-262, die Sequenzähnlichkeit 0,33 und die Vorlagenabdeckung 0,91.

Diskussion

Die Regressionsanalyse von MHK und Induktionszeit zeigte, dass der MHK-Wert des Stammes mit dem Anstieg des exogenen Antibiotikadrucks und der Induktionszeit zunahm. Liu et al. zeigten, dass während der Induktion der E. coli-Resistenz durch Imipenem der MHK-Wert mit der Zeit anstieg.14 Selbst wenn die induzierte Konzentration das 128-fache des MHK-Wertes des Primärstamms erreichte, wurde die Induktion fortgesetzt, und der MHK-Wert stieg mit der Induktion weiter an. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Studie stieg der MHK-Wert von E. coli mit der Zeit und der induzierten Konzentration an. Es zeigt, dass, wenn die Dosis nicht begrenzt ist, die Resistenz des Stammes immer ernster wird.AMP wurde 63 Stunden lang an E. coli 15743 induziert (MHK erreichte 32 µg/ml), und der MHK-Wert war achtmal so hoch wie der des anfälligen Stammes. Zuvor stieg der MHK-Wert rasch an, während bei Induktion auf einen MHK-Wert von 32 µg / ml die Induktion fortgesetzt wurde und die Wachstumsrate des MHK-Wertes abnahm. Eine bakterielle Resistenz kann kurz vor Erreichen der Arzneimittelresistenzschwelle (MHK-Wert von 32 µg/ml) auftreten. Nach Erreichen des kritischen Wertes können die Bakterien faul sein und langsam wachsen, aber der MHK-Wert steigt weiter an. Es wird auch angenommen, dass dieser Stamm bestimmte Resistenzmechanismen aktiviert und den Arzneimittelresistenzstatus der Bakterien verändert.Zhang et al. zeigten, dass Chloramphenicol empfindliche Shigellen zum arzneimittelresistenten Zustand induzierte und sein Arzneimittelresistenzspektrum sich ändern würde.10 Infolgedessen war Shigella nicht nur resistent gegen Chloramphenicol, sondern auch resistent gegen andere Arten von Antibiotika. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Studie wurde das Arzneimittelresistenzspektrum von E. coli nach Induktion verstärkt. Die Ergebnisse zeigten, dass E. coli 15743-256 war nicht nur resistent gegen AMP, sondern auch gegen Piperacillin, Cefuroxim, Cefazolin, Cefoxitin, AMP / Sulbactam, Amoxicillin / Clavulansäure, Piperacillin / Tazobactam und Aztreonam. Es wird angenommen, dass während der Induktion von E. coli durch AMP das Expressionssystem von AcrAB-TolC aktiviert wird oder mehr als eines der multiplen Effluxpumpensysteme aktiviert wird und es andere Resistenzmechanismen als den Effluxmechanismus gibt.

Der molekulare Mechanismus der bakteriellen Resistenz ist noch unklar. Um den spezifischen molekularen Mechanismus von E zu untersuchen. coli-Resistenz gegen AMP, bakterielle WGS-Analyse wurde durchgeführt. Die Sequenzierungsergebnisse wurden mit der Referenzsequenz verglichen und 20 SNPs aus der Sequenz von E. coli 15743-32 gescreent, von denen 4 nicht-synonyme SNPs waren. Sechsundzwanzig SNPs wurden aus dem Stamm E. coli 15743-256 gescreent, von denen acht nicht-synonyme SNPs waren. Xiang et al. zeigten, dass das Resistenzniveau mutierter Stämme höher war als das von nicht mutierten Stämmen, und es gab eine quantitative Reaktion zwischen Punktmutationen und bakteriellen Resistenzniveaus, und mehrere Genmutationen könnten die Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika erhöhen.15 In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Studie war die Anzahl der mutierten Gene in E. coli 15743-32 geringer als in E. coli 15743-256, was darauf hinweist, dass die Anzahl der Mutationen mit dem Grad der Arzneimittelresistenz zusammenhängen kann und je mehr Mutationsstellen vorhanden sind, desto höher ist der Grad der Arzneimittelresistenz.

Nach der Sequenzierung wurden die in diesem Experiment gescreenten Nicht-SNPs in den Genen von orf00490, orf00819, orf01916, orf01200, orf02235, orf03479 und orf04094 verteilt. Unter ihnen sind die Gene orf00490, orf00819 und orf01916 an der Zellwandsynthese beteiligt. Die Anmerkungen in KEGG sind Fumaratreduktase-Untereinheit D (frdD), Zellteilungsprotein ftsI (Penicillin-bindendes Protein 3) und Porin-Außenmembranprotein OmpD. Studien haben gezeigt, dass das FRD-Gen ein FRD-Enzym kodiert, um die Umwandlung zwischen Fumaratreduktase und Succinatdehydrogenase zu katalysieren.16 Es wurde auch gefunden, dass die Amplifikation des frdD-Gens unter Verwendung eines Plasmidvektors die Ausbeute an Bernsteinsäure erhöhen kann.17,18 In Kombination mit dieser Studie wird davon ausgegangen, dass das frdD-Gen an bestimmten Stoffwechselwegen beteiligt ist, die möglicherweise mit einer AMP-Resistenz verbunden sind. In E. coli sind die Hauptziele von β-Lactam-Antibiotika PBP1 (Aufrechterhaltung der Zellmorphologie), PBP2 (Aufrechterhaltung der E. coli-Spannung und Stäbchenform) und PBP3 (im Zusammenhang mit der Bakterienteilung). PBP3 ist eine Kernkomponente von Zellteilungsproteinen, die die Vernetzung von Zellwandpeptidoglykanen während der Zellteilung katalysieren.19-22 Studien haben gezeigt, dass eine Herunterregulierung des OmpD-Proteins und der OMPD-Genexpression in bakteriellen Biofilmen zu einer verringerten Zellmembranpermeabilität und einer erhöhten Antibiotikaresistenz führt.23,24 In Übereinstimmung mit den Ergebnissen dieser Studie initiiert die OmpD-Genmutation einen Mechanismus der bakteriellen Resistenz gegen β-Lactam-Antibiotika, und die Abnahme der E. coli-Zellmembranpermeabilität ist einer der Gründe für die erhöhte Resistenz gegen AMP. Es wird angenommen, dass diese Veränderungen in der Funktion von Proteinen, die von Genen kodiert werden, die an der Zellwandsynthese beteiligt sind, die Resistenz von Bakterien gegen AMP beeinflussen.

Gene orf04094, orf01200, orf02235 sind in KEGG als osmotischer Drucksensor Histidinkinase (envZ), Multi-Drug Efflux Pump Gene (acrB) und Multi-Drug Resistance Protein, das an der Transkriptionsregulation (marR) beteiligt ist, annotiert. In den letzten Jahren ist der aktive Effluxmechanismus der Hauptgrund für die multiple Arzneimittelresistenz von Bakterien.25-27 Da der größte Teil des Abwassersystems Substrate weit transportiert und viele aktive Abwassersysteme in denselben Bakterien existieren können, kann dieses System zu einer bakteriellen Resistenz gegen verschiedene antibakterielle Arzneimittel mit völlig unterschiedlichen Strukturen führen, nämlich zu einer Mehrfachresistenz. In Marlen Adlers Studie erhöhten Mutationen im ftsI-Gen allein die Antibiotikaresistenz nicht, während FTSI- und envZ-Genmutationen die Wirksamkeit von Antibiotika um ein Vielfaches erhöhten. Cohen et al. zeigten, dass die Funktion des von dem mutierten MarR-Gen codierten inhibitorischen Proteins verringert wäre und die Wirkung der Bakterien auf die multiple Resistenz von Antibiotika gering war, wenn nur die MarR-Mutation nachgewiesen wurde.28 Merric et al. fanden heraus, dass E. coli nur geringe Multiresistenz zeigte, wenn das MarR-Gen mutiert war.29 Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass mehrere Gene gleichzeitig mutiert waren und die E. coli-Resistenz gegen AMP erhöht war.

Gen orf03479 ist als Valin Glycine Repeat G (VgrG) Protein in KEGG annotiert. Das Typ-VI-Sekretionssystem (T6SS) ist ein phagenverwandtes System, das in vielen bakteriellen Krankheitserregern wie E. coli, Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cenocepacia vorkommt. Die Effektorfaktoren können an das extrazelluläre von Bakterien sezerniert werden, und das Proteinsekretionssystem ist eng mit der Virulenz pathogener Bakterien verbunden. Wang Jianfeng et al. zeigten, dass die VgrG-Genmutation die Toxizität und Arzneimittelresistenz von Bakterien beeinflusst, aber die Funktion des Glutamat-Valin-Wiederholungsproteins ist noch unklar.30 Diese Studie ist der Ansicht, dass das VgrG-Gen mit einer AMP-Resistenz assoziiert sein kann, und sein Mechanismus bedarf weiterer Untersuchungen.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die COG-Funktion dieser mutierten Gene mit der Entstehung von Zellmembranen, dem Transport und Metabolismus anorganischer Ionen, Transkriptions- und Signaltransduktionsmechanismen zusammenhängt. Studien haben gezeigt, dass Bakterien unter antibiotischem Stress sowohl aktive als auch passive Abwehrmaßnahmen ergreifen können, um ihr Überleben zu sichern.31 In passive verteidigung, bakterien machen selbst ruhenden, reduzieren die vitalität des lebens und block die kombination von antibiotika und ziel zu reduzieren die tötung wirkung von antibiotika. In der aktiven Verteidigung erhöhen sie die Aktivität der Effluxpumpe, um den Efflux von Antibiotika zu erhöhen und die Ansammlung von Antibiotika in Bakterien zu reduzieren, wodurch die abtötende Wirkung von Antibiotika auf Bakterien verringert wird. Diese Studie legt nahe, dass die Resistenz von E. coli gegen AMP eine Kombination aus aktiven Abwehrsystemen und passiven Abwehrsystemen ist. Arzneimittelresistenz kann auftreten, kurz bevor der bakterielle MHK-Wert die Arzneimittelresistenzschwelle erreicht. Gene frdD, ftsI, acrB, OmpD, marR, VgrG und envZ sind mit AMP-Resistenz assoziiert. Diese Studien werden dazu beitragen, den molekularen Mechanismus von E. coli zu verbessern, die gegen β-Lactam-Antibiotika resistent sind, und eine Forschungsgrundlage für die Prävention und Bekämpfung von multiresistenten Bakterien und die Ziele neuer Antibiotika bieten.