DISKUSSION
Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein transnationales Labornetzwerk durch sorgfältige Planung, Schulung und Standardisierung von Reagenzien und Protokollen in der Lage ist, konsistente und vergleichbare HAI-Assay-Ergebnisse zu erzielen. Die fünf öffentlichen Gesundheits- und akademischen Laboratorien, die an dieser Studie teilnahmen, waren Teil von PCIRN, das entwickelt wurde, um Kanadas nationale Kapazität zur Unterstützung der Impfstoff- und anderen Influenza-Forschung im Falle einer Pandemie zu erhöhen. In einer Pandemiesituation mit hochvolumigen, Hochdruck- und geografisch verteilten Influenza-Tests ist die Standardisierung des HAI-Assays von größter Bedeutung, um die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zwischen Laboratorien sicherzustellen. Die PCIRN-Labors zeigten einen hohen Standard der Reproduzierbarkeit innerhalb des Labors mit einer Genauigkeit von 99,8% der Duplikate (99.2% bis 100% pro Labor), 97,8% der Titer innerhalb eines 2-fachen Bereichs über wiederholte Testtage (93,3% bis 100% pro Labor) und 91,1% der Testseren, die eine Titerreproduzierbarkeit über jede einzelne Wiederholung des Sechs-Assay-Protokolls zeigen (60% bis 100% pro Labor). Die interlaboratorische Reproduzierbarkeit war ebenfalls hoch, wobei die medianen Titer über alle Replikate aus den vier Nichtreferenzlaboratorien für 100% der getesteten Seren innerhalb des 2-fachen des Referenzlabors lagen. Auf einer Pro-Labor-Basis, die Titer von 94,3% und 98.9% der Proben wurden innerhalb einer einzigen Verdünnung des Referenzlabors bzw. der Konsensustiter quantifiziert (Bereiche 85% bis 100% und 95% bis 100%). Diese Prozentsätze erfüllen typische Akzeptanzschwellenwerte für die HAI-Assay-Variabilität (d. h. Mindestens 80% der Proben liegen innerhalb von 1 Verdünnung der Nennwerte und / oder All-Assay-GMTs). Die HAI-Assay-Spezifität (100%) und Sensitivität (87,5% bis 100%) in den PCIRN-Laboratorien lagen ähnlich gut innerhalb der Akzeptanzkriterien früherer Studien (d. h., 100% von negativen Proben sollten als unter Niveaus der Quantifizierung quantifizieren, und mindestens 80% von positiven Proben sollten als positiv quantifizieren).
Für die intralaboratorische Komponente der HAI-Assay-Variabilität scheint die Wiederholbarkeit in PCIRN-Labors der in anderen Studien gezeigten ähnlich zu sein (5, 22). Eine Einschränkung dieser früheren Studien war, dass nicht mehr als drei Wiederholungen untersucht wurden, trotz der üblichen Validierungspraktiken für Immuntests, bei denen sechs oder mehr wiederholte Assays untersucht wurden (24-27). Daher ist nicht klar, ob ihre Daten direkt mit den Ergebnissen vergleichbar sind, die in dieser Studie in sechs Assays ermittelt wurden. Nichtsdestotrotz scheint unser Befund von 0% bis 6,7% (Median, 0%) der Assays mit Ergebnissen, die sich um mehr als das 2-fache von denen anderer Assay-Wiederholungen unterscheiden, mit den 4,8% bis 7,1% vergleichbar zu sein, die zuvor in einem Labor festgestellt wurden (22) und die 0% bis 15% (Median, 2%) in neun Laboratorien (5).
Unsere Ergebnisse einer hohen HAI-Titer-Reproduzierbarkeit zwischen geografisch verteilten PCIRN-Laboratorien stehen im Gegensatz zu früheren Berichten, die eine erhebliche Variabilität zwischen internationalen Laboratorien zeigen, die diesen Assay durchführen (5, 6, 9-12). Zum Beispiel fanden Daten aus einer großen kollaborativen Studie (11 Laboratorien) GCVs pro Probe im Bereich von 84% bis 803% (medianes GCV pro Virus von 138%, 155% und 261%). Andere Studien berichteten über GCVs für H1N1- und H5N1-Proben, die sich über 95% bis 345% (11) und 22% bis 582% (6) erstreckten, und GMTs unterschieden sich zwischen den Laboratorien um das bis zu 80-fache (11) oder 128-fache (9). Während frühere Berichte häufig eine höhere Anzahl teilnehmender Laboratorien enthielten als die aktuelle Studie, betrug der mediane Ringversuch-GCV für fünf H1N1-Proben 83%, selbst wenn nur sechs Laboratorien Daten beisteuerten, wobei 80% von ihnen einen 4-fachen Unterschied zwischen den Laboratorien überstiegen (11). Im Gegensatz dazu zeigte die aktuelle Studie einen mittleren GCVs pro Virus von nur 39% und 17%, wobei 95% der Proben einen 4-fachen Unterschied zwischen den Labors aufwiesen. Eine Probe überschritt den 4-fachen Unterschied; der Titer war für diese Probe in einem Labor nicht quantifizierbar, und daher wurde der niedrigste Wert zugewiesen und nicht gemessen. Wenn diese Probe in den Analysen weggelassen würde, würde der maximale GCV 75,5% betragen, was einen niedrigeren Wert als der minimale GCV in anderen Studien darstellen würde. Obwohl diese Probe eine höhere Variabilität als andere zeigte, erschien dieser niedrige Messbereich im Allgemeinen weniger präzise als höhere Bereiche. Zum Beispiel reichte GCV von 43,4% bis 156,4% bei Titern zwischen 10 und 80 im Vergleich zu 11,1% bis 53,1% bei höheren Titern (Abb. 3). Eine größere Variabilität mit Proben mit niedrigeren Titern wurde ebenfalls zuvor beschrieben (23) und trug wahrscheinlich zu inkongruenten Seroprotektionsklassifikationen in der aktuellen Studie für die drei H1N1-Proben mit Titern bei, die dem Schwellenwert von 40 am nächsten kamen (Konsensustiter von 22, 24 und 43). Trotzdem blieb die diagnostische Genauigkeit der Seroprotektion in den PCIRN-Labors insgesamt hoch (93,6% bei Verwendung von Konsensustitern zur Definition der Seroprotektion und 89,5% im Vergleich zu Referenzlaborwerten).
Eine hohe Übereinstimmung der HAI-Titer im Ringversuch in PCIRN-Labors kann auf die sorgfältige Harmonisierung der HAI-Testverfahren und Reagenzien im gesamten PCIRN zurückzuführen sein. Teilnehmer an früheren Studien, die eine hohe Variabilität zwischen den Labors zeigten, verwendeten im Allgemeinen HAI-Assay-Methoden, die zwischen den Labors variierten. Zu den Assayvariablen, von denen angenommen wird, dass sie zur Variabilität der Ergebnisse beitragen, gehörten die Menge des zugesetzten Virus, das Viruskultursystem (z., embryonierte Hühnereier versus Gewebekultur), die Dauer der RDE-Behandlung, die anfängliche Serumverdünnung, die Art und das Alter der verwendeten Erythrozyten und die für das Absetzen der Erythrozyten zulässige Zeit (5, 11, 12). Überraschenderweise jedoch, wenn Wood et al. sofern kommerzielle und öffentliche Laborteilnehmer, die an saisonalen Influenza-Impfstofftests in Europa beteiligt waren, ein detailliertes Standardverfahren und gängige Reagenzien / Materialien erhielten, berichteten sie, dass die Variation zwischen den Labors nicht signifikant verbessert wurde (10). Die Autoren spekulierten, dass anhaltende „lokale technische Variationen“ sowie verschiedene Erythrozytenlieferanten die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien beeinträchtigt haben könnten, stellten jedoch fest, dass eine weitere Standardisierung für ihre Studie außerhalb der Machbarkeitsgrenzen lag. Spätere Veröffentlichungen interpretierten diese Ergebnisse als Hinweis darauf, dass die Standardisierung von HAI-Assays zwischen Laboratorien im Allgemeinen kein praktikabler Ansatz zur Harmonisierung von HAI-Ergebnissen in verschiedenen Laboratorien ist (8, 12), und mindestens eine Gruppe hat versucht, einen modifizierten und robusteren HAI-Assay zu entwickeln, um zuverlässigere und reproduzierbarere Daten zu generieren (22).
In der aktuellen Studie hielten sich die PCIRN-Laboratorien strikt an das standardmäßige, öffentlich zugängliche HAI-Assay-Protokoll der Weltgesundheitsorganisation, in dem Punkte, die technischen oder interpretativen Abweichungen unterliegen, vor Studienbeginn zwischen den Laboratorien harmonisiert wurden. Schlüsselreagenzien (z. B. RDE, RBC, Virusbestände) wurden so weit wie möglich von denselben Lieferanten bezogen. Darüber hinaus ermöglichte die Beschränkung der Tests auf einen einzigen Technologen an jedem Teststandort eine erhöhte Standardisierung. Der mögliche Effekt der Verwendung mehrerer Mitarbeiter in jedem Labor wurde in dieser Studie nicht getestet. Während die Verwendung mehrerer Operatoren die Variabilität möglicherweise erhöhen könnte, zeigte die einzige Studie, die diese Möglichkeit für HAI-Tests untersuchte, keinen signifikanten Unterschied zwischen den Ergebnissen von zwei Operatoren im selben Labor (22).
Mögliche Variationen zwischen den Labors in den Virusstämmen, die für die Verwendung im Assay gezüchtet wurden, wurden zwischen den PCIRN-Labors minimiert, indem virale Saatgutbestände aus einer einzigen Quelle verwendet wurden, die in allen Labors unter ähnlichen Bedingungen in derselben Zelllinie gezüchtet wurden. Wir spekulieren, dass die Reproduzierbarkeit zwischen den Laboren noch weiter verbessert werden könnte, wenn die Arbeitsmaterialien zentral hergestellt und an die teilnehmenden Labors verteilt würden. Die Bedeutung viraler Stammvariationen für HAI-Endpunkttiter wird durch die 2- bis 3-fach niedrigeren Titer gut veranschaulicht, die in einer Studie gezeigt wurden, als der HAI-Assay einen A / Cal-pH1N1-Stamm im Vergleich zum X179A-Reassortanten verwendete, der noch äquivalente Hämagglutinine und Neuraminidasen aufwies (11). Leider wurden Bestände im Rahmen dieser Studie nicht sequenziert, so dass wir nicht überprüfen können, ob alle Labors Viren mit identischen Hämagglutinin-Sequenzen verwendeten. Selbst wenn geringfügige Sequenzvariationen durch lokale Vermehrung von Virusbeständen eingeführt wurden, war die Variabilität zwischen den Laboratorien in dieser Studie gering, und so ist es schwer vorstellbar, wie die Verwendung von Beständen mit identischen HA-Sequenzen die Variabilität weiter reduzieren könnte. Obwohl die Unterschiede in dieser kleinen Stichprobe das 2-fache nicht überstiegen, Geringfügige Variationen in der HA-Sequenz, die durch lokale Vermehrung von Virusbeständen eingeführt wurden, könnten eine mögliche Erklärung für die Trends zur Unterschätzung der H1N1-Titer und zur Überschätzung der H3N2-Titer sein.Verschiedene Studien haben eine verringerte Variabilität der HAI-Titer zwischen den Labors durch Kalibrierung der Ergebnisse gegen internationale Standards berichtet (6, 11-13); Solche Standards existieren jedoch nicht für die aktuellen saisonalen Influenza-B- und Influenza-A-H3N2-Virusstämme, und die konstante antigene Drift saisonaler Stämme, die die jährliche Neuformulierung der Impfstoffe vorantreibt, erfordert möglicherweise die kontinuierliche Entwicklung und Validierung neuer Standards. In dieser Studie scheint die Vergleichbarkeit zwischen den Laboren besser zu sein als die, die durch die Verwendung selbst der effektivsten Kalibrierungsstandards erreicht wird. Beispielsweise können nach Kalibrierung mit IS 09/194, Wood et al. (11) berichteten, dass die maximalen Unterschiede zwischen den GMTs in verschiedenen Laboratorien vom 80-fachen auf das 64-fache abnahmen (d. h. Ein Wert, der in der aktuellen Studie immer noch deutlich über dem maximalen 11-fachen lag) und dass die GCV—Bereiche zwischen den Laboratorien von 95% auf 345% (Median, 105%) auf 34% auf 231% (Median, 109%) abnahmen – d. h. weit über dem in dieser Studie beobachteten Bereich von 0% auf 156% (Median, 27%). In ähnlicher Weise ist die Verwendung von Ersatz 10/202 verminderte den GCV zwischen Laboratorien von einem Bereich von 108% bis 157% auf einen Bereich von 24% bis 144% über fünf Proben und maximale Unterschiede zwischen Laboratorien von 43-fach bis 21-fach (13), und unter Verwendung des 07/150-Standards, Stephenson et al. (6) reduzierte den medianen GCV von 15 NIBRG-14 H5N1 Clade 1-Proben von 125% (Bereich 31% bis 582%) auf 61% (34% bis 535%).
Während der genaue Grund für die hohe Übereinstimmung zwischen den PCIRN-Labors im Vergleich zu früheren Studien nicht ermittelt werden kann, wurde unser Erfolg durch den Anreiz erleichtert, den wir als nationales Netzwerk hatten, auf das gemeinsame Ziel hinzuarbeiten, reproduzierbare Prozesse zu etablieren. Eine detaillierte und rigorose Prozess- und Reagenzienharmonisierung zwischen den Standorten ist vielleicht der einzige „neue“ Aspekt, den wir in diese Studie eingebracht haben, verglichen mit der langjährigen Literatur, die eine schlechte HAI-Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien zeigt. Unsere Daten deuten jedoch darauf hin, dass bei sorgfältiger Standardisierung die Ringversuchsschwankungen der HAI-Titer auf ähnliche Werte reduziert werden können wie in einzelnen Labors. Mögliche nächste Schritte zur Minimierung von Variationen der HAI-Titer in Labors weltweit wären die Mobilisierung von Netzwerken / Konsortien, die Umsetzung von Richtlinien und / oder regulatorischen Anforderungen für die Verwendung von Standardverfahren und Reagenzien, standardisierte Schulungen zur Gewährleistung der Reproduzierbarkeit und die Bereitstellung von Unterstützung und / oder Anreizen für die Laboratorien, das Konzept der „Standardisierung“ zu übernehmen.