Wenn Sie genügend Zeit und eine vibrationsfreie Umgebung hätten, könnten Sie geduldig warten und die Schwerkraft würde die meisten Schwebeteilchen auf den Boden eines Zentrifugenröhrchens bringen. Die kleinsten Partikel würden wahrscheinlich aufgrund der brownschen Bewegung in Suspension bleiben, und die meisten Makromoleküle würden gleichmäßig verteilt sein, da sie sich eher in Lösung als in Suspension befinden würden. Ich weiß nicht, wie es Ihnen geht, aber ich habe nicht die nötige Geduld, um mich bei der Trennung fester von flüssigen Komponenten ausschließlich auf die Schwerkraft zu verlassen. Außerdem würde das Pellet, das Sie erhalten haben, für praktische Zwecke viel zu leicht zersetzt werden, um das feste Material effektiv vom Überstand zu trennen. Die Schwerkraft wäre kein besonders wirksames Mittel, um Schwebstoffe aufgrund ihrer Größe oder anderer Eigenschaften zu trennen.
Beschreibung der Zentrifugationsbedingungen
Bei der Beschreibung eines Zentrifugationslaufs in Materialien und Methoden ist es selten erforderlich, mehr als die Kraft, die Zeit und die Temperatur der Zentrifugation anzugeben. Die erforderliche Drehzahl (U / min) hängt von der verwendeten Zentrifuge und dem Rotor ab, die von Labor zu Labor variieren. Daher ist es selten relevant, die Marke der Zentrifuge, den Rotortyp oder die Drehzahl anzugeben.
Der Zentrifugationsprozess
Die Zentrifugation erzeugt eine Zentripetalkraft, die das Hundert- oder Tausendfache der Schwerkraft betragen kann, wodurch der Prozess erheblich beschleunigt wird. Je größer die Anzahl der Umdrehungen pro Minute (U / min) ist, desto größer ist die Schwerkraft. Der Nutzen der Zentrifugation bei der Zellfraktionierung wäre begrenzt, wenn wir nur Schwebeteilchen auf den Boden eines Röhrchens treiben könnten. Die Forscher sind jedoch in der Lage, die Größe von Partikeln, die heruntergebracht werden, dank der Physik von Partikeln in Suspension zu kontrollieren.
In einer Suspension von runden Partikeln gleicher Dichte, aber unterschiedlichen Durchmessers ist die Kraft, die ein gegebenes Partikel nach unten treibt, gleich seiner Masse mal der aufgebrachten Beschleunigung. Das Volumen des Partikels ist eine Funktion seines Radius, und seine Masse ist gleich seinem Volumen mal seinem Dichtekoeffizienten, der eine Konstante ist. Das Volumen einer Kugel ist gleich 4/3 mal pi (eine Konstante) mal dem Würfel des Radius. Für eine Suspension von kugelförmigen Partikeln gleicher Dichte unter bestimmten Bedingungen ist die einzige Variable, die die Kraft auf ein bestimmtes Partikel bestimmt, sein Radius.
Der Widerstand gegen Bewegung durch eine Lösung ist proportional zu dem Teil der Oberfläche, der durch das Medium drückt. Bei Partikeln ähnlicher Form stoßen kleinere Partikel auf einen geringeren Widerstand als größere. Da die Oberfläche einer Kugel 4 mal pi mal das Quadrat des Radius ist und 4 mal pi eine Konstante ist, ist für sphärische Partikel gleicher Zusammensetzung die einzige Variable, die den Widerstand unter bestimmten Bedingungen bestimmt, der Radius des Partikels.
Die Antriebskraft nimmt proportional zum Würfel des Radius zu. Der Bewegungswiderstand nimmt proportional zum Quadrat des Radius zu. Es ist nicht schwer zu erkennen, dass mit zunehmendem Radius eines Partikels auch seine Tendenz, sich dem Boden zu nähern, zunimmt. Fügen Sie eine erhebliche Menge an Widerstand hinzu, und das Gravitationsexperiment, das Galileo zugeschrieben wurde, funktioniert schließlich nicht so gut. Da große Partikel schneller sedimentieren als kleine Partikel, kann ein Forscher große von kleinen Organellen, Zellen usw. trennen. einfach durch Steuerung der Zeit und Drehzahl eines Zentrifugenlaufs.
Fraktionierung durch Differentialzentrifugation
Für ein typisches Zellhomogenat wird eine 10 min. spin bei niedriger Geschwindigkeit (400-500 x g) ergibt ein Pellet, das aus ungebrochenem Gewebe, ganzen Zellen, Zellkernen und großen Trümmern besteht. Das Pellet mit niedriger Geschwindigkeit wird traditionell als Kernpellet bezeichnet. Ein 10 min. spin mit einer mäßig hohen Geschwindigkeit, was Kräfte von 10.000 bis 20.000 x g bringt Mitochondrien zusammen mit Lysosomen und Peroxisomen. Daher wird das zweite Pellet im traditionellen Zellfraktionierungsschema als mitochondriales Pellet bezeichnet.
Eine weitere Zellfraktionierung durch Differentialzentrifugation erfordert den Einsatz einer Ultrazentrifuge. Ein solches Instrument ist dazu ausgelegt, Rotoren mit hohen Winkelgeschwindigkeiten zu drehen, um sehr hohe g-Kräfte zu erzeugen. Die Luft muss aus der Kammer gepumpt werden, um Wärmestau durch Luftreibung zu vermeiden. Tatsächlich sind viele Rotoren, die für eine Ultrazentrifuge ausgelegt sind, nicht einmal aerodynamisch gebaut, da sie im Vakuum gedreht werden. Ein einstündiger Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugenlauf, der eine Kraft in der Größenordnung von 80.000 x g erzeugt, ergibt ein mikrosomales Pellet. Mikrosomen umfassen Membranfragmente, einschließlich Zellmembran und endoplasmatischem Retikulum. Membranfragmente bilden Vesikel, wenn sie in einem wässrigen Medium aufgeschlossen werden, so dass die Untersuchung zahlreiche Membranvesikel unterschiedlicher Größe ergeben würde. Die Vesikel selbst können aufgrund des unterschiedlichen Proteingehalts aufgrund der Dichte getrennt werden. Aber das ist ein Thema für ein anderes Dokument.
Spin für mehrere Stunden bei 150.000 x g oder so, und Sie können Ribosomen und sogar die größten Makromoleküle herunterbringen. Der verbleibende Überstand besteht aus löslichen Bestandteilen des Zytoplasmas, einschließlich Salzen, kleinen Makromolekülen und Vorläufermolekülen sowie gelösten Gasen.