Diverse Motivensembles spezifizieren nicht redundante DNA-Bindungsaktivitäten von AP-1-Familienmitgliedern in Makrophagen

Statistische Analysen

In Abb. 1c wurden Unterschiede in der Genexpression mit dem unabhängigen T-Test (Freiheitsgrad = 1, two-tailed) an zwei Replikatexperimenten (n = 2) getestet. Differentiell exprimierte Gene in Fig. 1b wurden unter Verwendung von EdgeR55 mit Standardparametern und unter Verwendung der Cutoffs FDR < 0 identifiziert.05 und log2 Falzänderung ≥2. In Fig. 2c wurden Unterschiede zwischen jeder Gruppe (Veh, Shared und KLA 1 h) unter Verwendung eines unabhängigen T-Tests untersucht (Freiheitsgrad = 1, two-tailed); Die Anzahl der Loci in jeder Gruppe für jedes Monomer ist wie folgt: ATF3 (Veh = 1447, Shared = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Bedeutung für Motive in Fig. 4a wurde unter Verwendung des Likelihood-Ratio-Tests (Freiheitsgrad = 1) berechnet, wobei die Vorhersagen des vollständigen TBA-Modells und des gestörten TBA-Modells an allen Loci, die in Veh-behandelten Makrophagen gebunden sind, für Atf3 (n = 23.160), Jun (n = 15.548) und JunD (n = 19.653) verglichen wurden. Bedeutung für Motive in Ergänzender Fig. 4C wurde unter Verwendung des Likelihood-Ratio-Tests (Freiheitsgrad = 1) berechnet, wobei die Vorhersagen des vollständigen TBA-Modells und des gestörten TBA-Modells an allen durch JunD gebundenen Loci in GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12.931), HepG2 (n = 41.318), K562 (n = 47.477) und SK-N-SH (38.960). Bedeutung für Motive in Fig. 5b, Ergänzend Fig. 5B und ergänzend Fig. 5C wurde unter Verwendung des Likelihood Ratio-Tests (Freiheitsgrad = 1) berechnet, wobei die Vorhersagen des vollständigen TBA-Modells und des gestörten TBA-Modells an allen Loci, die in KLA-behandelten Makrophagen gebunden sind, für Atf3 (n = 36,745), Jun (n = 17,481), JunD (n = 31,641), Fos (n = 24,365), Fosl2 (n = 10,619) und JunB (n = 13,376). Signifikanzwerte für Fig. 6f und S6F wurden mit dem F-Test berechnet; die Anzahl der analysierten Loci für Monomere in vehikelbehandelten Makrophagen sind ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) und JunD (n = 4148); Die Anzahl der analysierten Loci für Monomere in KLA-behandelten Makrophagen sind: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) und JunB (n = 3616).

Generieren eines benutzerdefinierten Genoms für BALB/ cJ

Ein benutzerdefiniertes Genom für BALB/cJ durch Ersetzen invarianter Positionen des mm10-Genoms durch Allele, die vom Mouse Genomes Project gemeldet wurden (Version 3 VCF-Datei)43. Für C57BL/6J wurde das mm10-Referenzgenom aus dem UCSC Genome Browser verwendet. Um Vergleiche zwischen BALB / cJ und C57BL / 6J während der Analyse zu ermöglichen, wurden die Koordinaten für das benutzerdefinierte Genom für BALB / cJ verschoben, um den Positionen des mm10-Referenzgenoms mit MARGE34 zu entsprechen. Wir haben keine Lesevorgänge analysiert, die in Deletionen in BALB / cJ fielen. Lesevorgänge, die sich mit einer Einfügung überlappten, wurden der letzten Überlappungsposition in der Referenzdehnung zugeordnet.

Analyse von ChIP-seq-Peaks

Sequenzierungslesewerte aus ChIP-seq-Experimenten wurden mit der neuesten Version von Bowtie2 mit Standardparametern auf die mm10-Assembly des Mausreferenzgenoms (oder des benutzerdefinierten BALBc / J-Genoms) abgebildet56. Zugeordnete ChIP-Seq-Lesevorgänge zur Identifizierung mutmaßlicher TF-Bindungsstellen mit dem Befehl HOMER57 findPeaks (mit den Parametern -size 200 -L 0 -C 0 -fdr 0.9) unter Verwendung des dem Behandlungszustand entsprechenden Eingangschip-Experiments. Um die Anzahl der falsch positiven Peaks zu reduzieren, haben wir die IDR an jedem Peak berechnet (mit Version 2.0.3 des IDR-Programms) mit dem für jedes Replikatexperiment berechneten HOMER-Peak-Score als Eingabe für IDR und filterte dann alle Peaks mit IDR ≥ 0,0558. De novo Motive wurden mit dem HOMER berechnet findMotifsGenome.pl befehl mit Standardparametern. Die Anreicherung von de-novo-Motiven wurde unter Verwendung der findKnownMotifs.pl programm in HOMER mit Standardparametern.

Die Quantifizierung von RNA-Expressionslesungen, die aus RNA-seq-Experimenten generiert wurden, wurden mit STAR Aligner mit Standardparametern an das mm10-Mausreferenzgenom (oder das benutzerdefinierte BALBc / J-Genom) angepasst59. Um das Expressionsniveau jedes Gens zu quantifizieren, berechneten wir die RPKM mit den Lesevorgängen, die sich innerhalb eines Exons befanden. Unnormalisierte Sequenzierungslesungen wurden verwendet, um differentiell exprimierte Gene mit EdgeR55 zu identifizieren; Wir betrachteten Gene mit FDR < 0.05 und einer Änderung der Expression zwischen zwei experimentellen Bedingungen, die zweifach oder größer differentiell exprimiert wurden. Um die Expression von entstehenden RNAs zu quantifizieren, haben wir unsere GRO-seq-Peaks mit der Anzahl der GRO-seq-Lesevorgänge (normalisiert auf 10 Millionen), die innerhalb von 500 bps des Peakzentrums lagen, mit dem HOMER annotiert annotatePeaks.pl befehl.

TBA-Modelltraining

Für jedes AP-1-Monomer haben wir unter jeder Behandlungsbedingung ein Modell trainiert, um Bindungsstellen für jedes Monomer von einem Satz zufällig ausgewählter genomischer Loci zu unterscheiden. Der Satz zufälliger Hintergrundloci, der zum Trainieren jedes Modells verwendet wurde, wurde gemäß den folgenden Kriterien ausgewählt: (1) Die GC-Gehaltsverteilung der Hintergrundloci entspricht dem GC-Gehalt der Bindungsstellen für ein gegebenes Monomer, (2) enthalten keine mehrdeutigen oder nicht zuordenbaren Positionen, und (3) Die Anzahl der Hintergrundsequenzen entspricht der Anzahl der Bindungsstellen k. Für jede der Sequenzen im kombinierten Satz der Bindungsstellen und Hintergrundloci berechneten wir den höchsten Log-Odds-Score (auch als Motiv-Score bezeichnet) für jedes der n Motive, die in das Modell aufgenommen werden60 Motivübereinstimmungen in beiden Orientierungen wurden berücksichtigt. Log-Odds-Werte kleiner als 0 wurden auf 0 gesetzt. Vor dem Training eines linearen Modells standardisierten wir die Log-Odds-Scores für jedes Motiv und skalierten die Scores für jedes Motiv so, dass der Mittelwert 0 und die Varianz 1 beträgt. Die Standardisierung skaliert die Scores für alle Motive auf den gleichen Bereich (längere Motive haben eine größere maximale Punktzahl) und hilft auch, den Effekt der Multikollinearität auf das Modelltraining zu reduzieren. Die Funktionen, die für das Training unseres Modells verwendet werden, sind eine n mal 2k-Matrix von Log-Odds-Scores, die für jede Zeile standardisiert sind. Um das entsprechende Array von Labels zu generieren, haben wir jeder Bindungsstelle ein Label von 1 und jedem Hintergrundloci ein Label von 0 zugewiesen. Unter Verwendung dieser Merkmalsmatrix und dieses Etikettenarrays trainierten wir Gewichte für jedes Motiv unter Verwendung eines L1-bestraften logistischen Regressionsmodells, wie es vom scikit-learn Python package61 implementiert wurde. Die in unserer Analyse angegebenen Gewichte sind die Mittelwerte über fünf Kreuzvalidierungsrunden hinweg, wobei 80% der Daten für das Training und 20% für die Tests in jeder Runde verwendet werden. Modelle wurden für ChIP-seqs trainiert, die in dieser Studie generiert wurden, sowie für Daten, die aus dem NCBI Gene Expression Omnibus (accession number GSE46494) und dem ENCODE data Portal (https://www.encodeproject.org) heruntergeladen wurden.

Quantifizierung der multiplen Kollinearität

Um das Ausmaß der Multikollinearität in den Motif-Score-Merkmalen zu beurteilen, die wir zum Trainieren unserer Modelle verwendet haben, haben wir jede Merkmalsmatrix, die jedem Experiment entspricht, genommen und die VIF für jedes Motiv berechnet38. Um den VIF zu berechnen, bestimmen wir zuerst den Bestimmungskoeffizienten R2 für jedes Motiv, indem wir die Log-Odds-Werte für ein Motiv gegen die Log-Odds-Werte der verbleibenden Motive regressieren. Als nächstes kann unter Verwendung des Bestimmungskoeffizienten die Toleranz für jedes Motiv als Differenz zwischen 1 und dem Bestimmungskoeffizienten (1 − R2) berechnet werden. Der VIF ist der Kehrwert der Toleranz \(\frac{1}{{1 – R^2}}\). Wir haben das Modul linear_model des Python-Pakets sklearn verwendet, um den Bestimmungskoeffizienten zu berechnen.

Motif Clustering and Merging

Wir haben die Ähnlichkeit aller Paare von DNA-Sequenzmotiven bewertet, indem wir die Pearson-Korrelation der Aligned Position Probability Matrices (PPMs) berechnet haben, die einem gegebenen Paar von Motiven entsprachen62. Die Pearson-Korrelation für ein Motivpaar A und B der Länge i wird nach folgender Formel berechnet:

PPMs wurden zuerst mit dem Smith–Waterman-Ausrichtungsalgorithmus ausgerichtet63. Kürzere Motive werden vor dem Ausrichten mit Hintergrundfrequenzwerten aufgefüllt. Lücken in der Ausrichtung waren nicht zulässig, und jede Position in der Ausrichtung wurde mit der Pearson-Korrelation bewertet. Die Pearson-Korrelation wurde dann unter Verwendung der optimalen Ausrichtung berechnet. Als nächstes wurden Sätze von Motiven, die PPMs mit einer Pearson-Korrelation von 0,9 oder größer aufweisen, zusammengeführt, indem jedes PPM iterativ innerhalb des Satzes ausgerichtet und dann die Nukleotidfrequenzen an jeder Position gemittelt wurden.

Beurteilung der Signifikanz von Motiven für TBA

Die p-Werte für TBA wurden mit dem Log-Likelihood-Ratio-Test berechnet. Jedes Motiv wurde aus dem Satz von Merkmalen entfernt, die zum Trainieren eines gestörten TBA-Modells verwendet wurden (unter Verwendung einer fünffachen Kreuzvalidierung). Wir haben dann das vollständige Modell (mit allen Motiven) und das gestörte Modell verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung der Bindung an allen Bindungsstellen und Hintergrundsequenzen für ein gegebenes Monomer und alle Hintergrundregionen zu berechnen. Der Unterschied in den Wahrscheinlichkeiten, der durch das vollständige Modell und das gestörte Modell berechnet wurde, wurde dann verwendet, um den Chi-Quadrat-Test für jedes Motiv durchzuführen. Der Chi-Quadrat-Test wurde mit dem scipy Python package64 durchgeführt.

Vergleich mit anderen Methoden

BaMM motif und gkm-SVM wurden beide mit Standardparametern ausgeführt. Wir verwendeten die neueste Version des größeren Maßstab gkm-SVM, LS-GKM (kompiliert aus Quellcode heruntergeladen von https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm auf 8/25/16) und BaMM motif; v1.0 heruntergeladen von https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Beide Modelle wurden mittels fünffacher Kreuzvalidierung trainiert. Die Modellleistung wurde mit den Funktionen roc_auc_score und precision_score aus dem Metrics-Modul von sklearn bewertet.

Vorhersage von Änderungen der AP-1-Bindung nach einstündiger KLA-Behandlung

Um die Änderung der Bindung nach der KLA-Behandlung vorherzusagen, nutzten wir die Motivgewichte, die für jedes der n Motive (wn) durch ein TBA-Modell gelernt wurden, das auf den fahrzeugbehandelten Daten trainiert wurde (Wveh = ) und ein TBA-Modell, das auf den 1-h-KLA-behandelten Daten trainiert wurde (Wkla =) für jedes AP-1-Monomer. Die prognostizierte Bindungsänderung für jede Sequenz ist dann die Differenz zwischen dem Punktprodukt der für die Sequenz jeweils der k Bindungsstellen berechneten standardisierten Motivscores (Sk=) mit den KLA−Motivgewichten und dem Punktprodukt der Motivscores und den Veh−Motivgewichten (Δkla-veh,k = Wkla⋅Sk – Wveh⋅Sk). Vorhersagen wurden für alle genomischen Loci getroffen, die sich mit einem Peak für eines der AP-1-Monomere entweder im Vehikel- oder im KLA-Behandlungszustand kreuzten.

Vorhersage der stammspezifischen Bindung mit TBA

Um die stammspezifische Bindung vorherzusagen, nutzten wir die Motivgewichte, die für jedes der n Motive (wn) durch ein TBA-Modell (W =) für jedes AP-1-Monomer unter Verwendung der C57BL / 6J-Daten ermittelt wurden, und die Motivwerte, die für jede der k Bindungsstellen unter Verwendung der genomischen Sequenz für C57BL / 6J und BALBc / J (SC57, k = , SBAL, k =) berechnet wurden. Als nächstes berechneten wir die Differenz der Motivscores für C57BL6 / J und BALBc / J (Dn = ) und standardisierten dann die Score-Unterschiede für jedes Motiv über alle k Bindungsstellen, die eine Mutation aufwiesen, wenn wir BALBc / J mit C57BL / 6J verglichen, was standardisierte Motivscore-Unterschiede für jede Bindungsstelle ergab (Zn = standardisieren (Dn) = ). Schließlich haben wir dann eine Vorhersage für die stammspezifische Bindung gemacht, indem wir das Punktprodukt der Motivgewichte und die standardisierte Differenz der Motivwerte zwischen C57BL6 / EiJ und BALBc / J für die k−te mutierte Bindungsstelle (ΔC57-BAL = W⋅) berechnet haben.

TBA-2Strain Model Training

Für jeden genomischen Loci, der sich mit einem Peak für eines der AP-1-Monomere in C57BL / 6J oder BALBc / J schnitt, berechneten wir den höchsten Log-Odds-Score für jedes der n Motive, die in das Modell aufgenommen werden, unter Verwendung der genomischen Sequenz aus beiden Stämmen, was zwei Sätze von Motiv-Scores für jede der k Bindungsstellen ergab (SC57, k = , SBAL, k =). Motivübereinstimmungen in beiden Orientierungen wurden berücksichtigt. Log-Odds-Werte kleiner als 0 wurden auf 0 gesetzt. Unter Verwendung der Motivwerte berechnen wir die standardisierte Differenz der Motivwerte über die beiden Stämme, wie im obigen Abschnitt beschrieben (Zn = ). Die Funktionen, die für das Training unseres Modells verwendet werden, sind eine n-mal-k-Matrix von Log-Odds-Scores, die für jede Zeile standardisiert sind. Als nächstes berechneten wir das Log2-Faltverhältnis der Anzahl der ChIP-seq-Lesevorgänge in C57BL / 6J im Vergleich zu BALBc / J, um das Ausmaß der stammspezifischen Bindung darzustellen. Mit dieser Merkmalsmatrix und dem Festlegen des log2-Faltverhältnisses der Bindung zwischen den beiden Stämmen als abhängige Variable trainierten wir die Gewichte für jedes Motiv mithilfe der linearen Regression, wie sie vom Python-Paket scikit-learn implementiert wurde. Die in unserer Analyse angegebenen Gewichte sind die Mittelwerte über fünf Kreuzvalidierungsrunden hinweg, wobei 80% der Daten für das Training und 20% für die Tests in jeder Runde verwendet werden. Vorhersagen für die dehnungsspezifische Bindung können anhand der berechneten Gewichte gemäß dem Verfahren im vorherigen Abschnitt getroffen werden.

ChIP protokoll

Protein A und G Dynabeads 50/50 mix von Invitrogen sind verklagt für ChIP (10001D, 10003D). IP Mix besteht aus 20 µL Beads/2 µg Antikörper pro 2 Millionen Zellchip. Antikörper gegen AP-1-Familienmitglieder wurden ausgewählt, um auf nicht konservierte Regionen abzuzielen, um das Potenzial für eine unspezifische Bindung zu minimieren. Antikörper sind in der ergänzenden Tabelle 3 aufgeführt. Zur Herstellung wurden Beads mit 2× 0,5% BSA–PBS gewaschen, anschließend wurden Beads–Antikörper mit 0,5% BSA–PBS für mindestens 1 h am Rotator (4°C) inkubiert. Waschen 2× mit 0.5% BSA-PBS, dann resuspendiert in Verdünnungspuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× Proteaseinhibitoren). Doppelvernetzung für ChIP: Medien wurden aus Zellen in 10 cm Platten dekantiert, einmal kurz mit PBS (RT) gewaschen. Disuccinimidylglutarat (Pierce Cat#20593) (verdünnt in DMSO bei 200 mM)/PBS (RT) wurde für 10 min verwendet. Anschließend wurde für weitere 10 min Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben. Die Reaktion wurde mit 1:10 1 M Tris pH 7,4 auf Eis gequencht. Die Zellen wurden gesammelt und gewaschen zweimal mit kaltem PBS, Spinnen bei 1000 × g für 5 min. Kernisolierung und Beschallung: Zellpellets in 1 ml Kernisolierpuffer (50 mm Tris–pH 8,0, 60 mM KCl, 0,5% NP40) + PI resuspendieren und 10 min auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie 2000 × g für 3 min bei 4 ° C. Resuspendieren Sie die Kerne in 200 µL frischem Lysepuffer (0,5% SDS, 10 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 50 mM Tris–HCl (pH 8)) + PI. Beschallung: Kerne wurden dann beschallt (10 Millionen Zellen) für 25 min in einem Biorupter (Einstellungen = 30 s = Ein, 30 s = Aus, Medium) mit dünnwandigen Rohren (Diagenode Cat # C30010010). Nach beschallung spin max geschwindigkeit für 10 min bei 4 °C. ChIP set up: Beschallte DNA wurde 5× mit 800 Verdünnungspuffer (1% Triton, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 20 mM Tris–HCl (pH 7,4), 1× Proteaseinhibitoren) verdünnt. Ein Aliquot wird für Eingangsproben (5%) entfernt. Proben bei 4 ° C während des Drehens. Waschen: Chips werden 1× mit TSE I (20 mM Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× mit TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% Desoxycholat, 1 mM EDTA), 1× mit TE + 0,1% Triton X-100 gewaschen, in ein neues Röhrchen überführt und dann ein anderes gewaschen zeit mit TE + 0,1% Triton X-100. Elution: Eluieren mit 200 µL Elutionspuffer (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) für 20 min bei RT, Schütteln am Vortex oder einem Nutator oder Rotator. Entvernetzung: 10 µL 5 M NaCl zugeben und bei 65°C (oder mindestens 8 h) inkubieren. Bereinigen Sie Proben mit Zymo ChIP DNA Clean und Concentrator. In 100 µL eluieren. Nehmen Sie 40 µL und fahren Sie mit dem Library Prep Protocol fort.

PolyA RNA Isolierung und Fragmentierung

RNA Isolierung: RNA wurde mit TRIZOL-Reagenz (Ambion cat#15596018) und DIRECT-ZOL RNA Mini-prep Kit (cat#11-330MB) isoliert. Poly-A-RNA-Isolierung: Verwenden Sie 0.2 gesamt-RNA als Ausgangsmaterial für ideale Abbildungseffizienz und minimale Klonalität. Sammeln Sie 10 µl Oligo (dT) (NEB cat # S1419S) Perlen pro RNA-Probe. Die Perlen wurden zweimal mit 1× DTBB (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100) gewaschen. Die Beads wurden in 50 µL 2× DTBB resuspendiert. 50 µL Beads wurden mit 50 µL RNA gemischt und 2 min auf 65°C erhitzt. Anschließend wurden RNA-Beads 10 min bei RT unter Rotation inkubiert. Anschließend wurden RNA-Beads auf einem Magneten gesammelt und jeweils 1× mit RNA WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.1% Triton X-100) und WB3 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,5 M LiCl, 1 mM EDTA). 50 µL Tris–HCl pH 7,5 zugeben und zum Eluieren 2 min auf 80 °C erhitzen. Sammeln Sie RNA und führen Sie eine zweite Oligo-DNA-Perlensammlung durch. Nach Waschen der zweiten Sammlung wurde statt Eluieren 1× mit 1× Erststrangpuffer; 250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 (ThermoFisher SSIII Kit Cat#18080093). Fragmentierung: Dann 10 µL 2× Erststrangpuffer plus 10 mM DTT zugeben und DNA 9 min bei 94 °C fragmentieren. Perlen auf Magnet sammeln und Eluat mit fragmentierter mRNA auf einen neuen PCR-Streifen übertragen. Sollte 10 µl fragmentierte RNA wiederherstellen. Erststrangsynthese: Wir mischten fragmentierte RNA mit 0,5 µL Random Primer (3 µg/µL) Life Tech #48190-011, 0,5 µL oligo-dT (50 µM aus SSIII Kit), 1 µL dNTPs (10 mm Life Tech, cat 18427088) und 0,5 µL SUPERase-In (ThermoFisher Cat#AM2696) und erhitzen 50 °C für 1 min. Sofort auf Eis legen. Wir fügten dann 5,8 µL ddH2O, 0,1 µL Actinomycin (2 µg / µL Sigma cat # A1410), 1 µL DTT (100 mm Life Tech cat # P2325), 0,2 µL 1% Tween und 0,5 µL hochgestelltes III hinzu und inkubierten 25 ° C für 10 min, dann 50 ° C für 50 min. Perlen aufräumen: Wir fügten 36 µL RNAClean XP (Ampure XP) hinzu und mischten, wobei wir 15 min auf Eis inkubierten. Die Perlen wurden dann auf einem Magneten gesammelt und 2 × mit 75% Ethanol gewaschen. Anschließend wurden die Beads 10 min luftgetrocknet und mit 10 µL nukleasefreiem H2O eluiert. 10 µL cDNA/RNA wurden gemischt mit 1,5 µL 10× Blaupuffer (Enzymatics cat#B0110L), 1 µL dUTP/dNTP Mix (10 mM Affymetrix cat#77330), 0,1 µL dUTP (100 mM Affymetrix cat#77206), 0,2 µL RNase H (5 U/µL Enzymatics cat#Y9220L), 1 µL DNA Polymerase I (10 U /µL Enzymatics cat#P7050L), 0,15 µL 1% Tween-20 und 1.05 µL nukleasefreies Wasser. Die Reaktion wurde 2,5 h bei 16°C inkubiert. Bead Clean up: DNA wurde durch Zugabe von 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Iec 6515-2105-050250) pro Reaktion in 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% Endkonzentration) gereinigt und 10 min bei RT inkubiert. Perlen wurden dann auf einem Magneten gesammelt und 2 × mit 80% Ethanol gewaschen. Die Beads wurden 10 min luftgetrocknet und in 40 µL nukleasefreiem Wasser eluiert. DNA ist bereit für die Bibliotheksvorbereitung.

Library prep protocol

dsDNA-Endreparatur: Wir mischten 40 µL DNA aus ChIP- oder RNA-Protokollen mit 2,9 µL H2O, 0.5 µL 1% Tween-20, 5 µL 10× T4 Ligase Puffer (Enzymatics cat# L6030-HC-L), 1 µL dNTP Mix (10 mM Affymetrix 77119), 0,3 µL T4 DNA pol (Enzymatics P7080L), 0,3 µL T4 PNK (Enzymatics Y9040L), 0,06 µL Klenow (Enzymatics P7060L) und inkubiert für 30 min bei 20°C wurde 1 µL Seradyn 3 EDAC SpeedBeads (Iec 6515-2105-050250) in 93 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% final) zugegeben und 10 min inkubiert. Bead Clean-up: Perlen wurden auf einem Magneten gesammelt und 2 × mit 80% Ethanol gewaschen. Die Beads wurden 10 min luftgetrocknet und anschließend in 15 µL ddH2O. dA-Tailing eluiert. DNA wurde mit 10 gemischt.8 µL ddH2O, 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Blue Buffer (Enzymatics cat#B0110L), 0,6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzymatics P7010-LC-L) und 30 min bei 37°C inkubiert. 55,8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl ( 13% final) zugegeben und 10 min inkubiert. Dann war das Aufräumen erledigt. Perlen wurden in 14 µL eluiert. Y-förmige Adapterligatur. Die Probe wurde mit 0,5 µL eines BIOO Barcode Adapters (BIOO Scientific cat#514104), 15 µL Rapid Ligation Buffer (Enzymatics cat@ L603-LC-L), 0,33 µL 1% Tween-20 und 0 gemischt.5 µL T4 DNA Ligase HC (Enzymatics L6030-HC-L) und 15 min bei RT inkubiert. 7 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl wurden zugegeben und 10 min bei RT inkubiert. Bead Clean up wurde durchgeführt und Beads wurden in 21 µL eluiert. 10 µL wurden dann zur PCR-Amplifikation (14 Zyklen) mit IGA- und IGB-Primern (AATGATACGGCGACCACCGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA) verwendet.

GRO-seq

Die im Entstehen begriffene Transkription wurde mittels Global Nuclear Run-on Sequencing (GRO-seq) erfasst. Kerne wurden aus TGEMs mittels hypotoner Lyse isoliert (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% IGEPAL CA-630) und in GRO-Gefrierpuffer (50 mM Tris–HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 40% Glycerin) blitzgefroren. Lauf-auf. 3-5 × 106 BMDM-Kerne wurden mit BrUTP-markierten NTPs mit 3× NRO–Puffer (15 mM Tris-Cl (pH 8,0), 7,5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT, 450 mM KCl, 0,3 U/µL SUPERase In, 1,5% Sarkosyl, 366 µM ATP, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) und 1,2 µM CTP (Roche, zur Begrenzung des länge bis ~40 Nukleotide)). Die Reaktionen wurden nach 5 min durch Zugabe von 500 µL Trizol LS Reagenz (Invitrogen) gestoppt, 5 min vortext und RNA wie vom Hersteller beschrieben extrahiert und gefällt. RNA-Pellets wurden in 18 µL ddH2O + 0,05% Tween (dH2O +T) und 2 µL Fragmentierungsmischung (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)) resuspendiert und anschließend 15 min bei 70°C inkubiert. Die Fragmentierung wurde durch Zugabe von 2,5 µL 100 mm EDTA gestoppt. BrdU Bereicherung. Die BrdU-Anreicherung wurde unter Verwendung von BrdU-Antikörpern (IIB5) und AC-Beads (Santa Cruz, sc-32323 AC, Los #A0215 und #C1716) durchgeführt. Die Beads wurden einmal mit GRO-Bindungspuffer (0,25× Saline-Natrium-Phosphat-EDTA-Puffer (SSPE), 0,05% (vol/vol) Tween, 37,5 mM NaCl, 1 mM EDTA) + 300 mM NaCl, gefolgt von drei Wäschen in GRO-Bindungspuffer gewaschen und als 25% (vol/vol) Slurry mit 0,1 U/µL SUPERase-in resuspendiert. Zur Fragmentierung der RNA wurden 50 µL kalter GRO-Bindungspuffer und 40 µL äquilibrierte BrdU-Antikörperperlen zugegeben und die Proben 80 min lang bei 4 °C langsam gedreht. Anschließend wurden die Perlen 15 s bei 1000×g aufgeschleudert, der Überstand entfernt und die Perlen in eine Millipore Ultrafree MC-Säule (UFC30HVNB) überführt; Millipore) in 2 × 200 µL GRO-Bindungspuffer. Die IP-Reaktion wurde zweimal mit 400 µL GRO-Bindungspuffer gewaschen, bevor die RNA durch Inkubation in 200 µL Trizol LS (ThermoFisher) unter leichtem Rühren für 3 min eluiert wurde. Die Elution wurde ein zweites Mal wiederholt, 120 µL dH2O+T zur Erhöhung des Überstandes zugegeben und wie vom Hersteller beschrieben extrahiert. Endreparatur und Decapping: Zur Endreparatur und Decapping wurden RNA-Pellets in 8 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) durch kräftiges Vortexen gelöst, 2 min auf 70°C erhitzt und auf Eis gelegt. Nach einem Quick Spin wurden 22 µL Repair Master Mix (3 µL 10× PNK Puffer, 15,5 µL dH2O+T, 0,5 µL SUPERase-In RNase Inhibitor (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)) zugegeben, gemischt und 1 h bei 37°C inkubiert. Zur Phosphorylierung des 5’Endes wurden anschließend 0,5 µL 100 mM ATP zugegeben und die Reaktionen für weitere 45 min inkubiert bei 37 ° C (die hohe ATP-Konzentration löscht die RppH-Aktivität). Nach der Endreparatur wurden 2,5 µL 50 mm EDTA zugegeben, gründlich gemischt und dann 2 min auf 70 ° C erhitzt, bevor sie auf Eis gelegt wurden. Eine zweite BrdU-Anreicherung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. RNA-Pellets wurden in 2,75 µL TET + 0,25 µL Illumina TruSeq 3’Adapter (10 µM) gelöst, 2 min auf 70°C erhitzt und auf Eis gelegt. 7 von 3’master Mix (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL 10 × T4 RNA Ligase Puffer, 0,25 µL SUPERase-In, 1 µL T4 RNA Ligase 2 abgeschnitten (200U; NEB)) wurde zugegeben, gut gemischt und die Reaktionen wurden 1 h bei 20 ° C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 10 µL TET + 2 µL 50 mM EDTA verdünnt, 2 min auf 70 ° C erhitzt, auf Eis gelegt und eine dritte Runde Es wurde eine BrUTP-Anreicherung durchgeführt. RNA-Pellets wurden während der 75%igen Ethanolwäsche auf PCR-Streifen übertragen und getrocknet. Die Proben wurden in 4 µL TET (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) + 1 µL 10 µM Reverse Transkription (RT) Primer gelöst. Zur Temperung des RTPRIMERS wurde die Mischung bei 75°C für 5 min, 37°C für 15 min und 25°C für 10 min inkubiert. Zur Ligation des 5’Illumina TruSeq-Adapters wurden 10 µL 5’master Mix (1,5 µL dH2O + 0,2% Tween 20, 0,25 µL denaturierter 5’Truseq-Adapter (10 µM), 1,5 µL 10× T4 RNA-Ligase-Puffer, 0,25 µL SUPERase-In, 0,2 µL 10 mM ATP, 5,8 µL 50% PEG8000, 0,5 µL T4 RNA-Ligase 1 (5U; NEB)) zugegeben und 1 h bei 25°C inkubiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung von Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB FirstStrand Buffer (NEB; E7421AA), 0,25 µL SUPERase-In, 0,75 µL Protoscript II (150U; NEB)) bei 50°C für 1 h durchgeführt. Nach Zugabe von 30 µL PCR Master Mix (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Master Mix (NEB), 0,2 µL 100 µM Forward Primer, 2,8 µL 5 M Betain und 2 µL 10 µM Individual Barcoding Primer) wurden Mischungen amplifiziert (95°C für 3 min, (95°C für 60 s, 62°C für 30 s, 72°C für 15 s) x13, 72°C für 3 min). PCR-Reaktionen wurden mit 1,5 Volumina SpeedBeads (GE Healthcare) in 2,5 M NaCl/20% PEG8000 aufgereinigt. Bibliotheken wurden Größe auf Seite / TBE Gele zu 160-225 Basenpaare ausgewählt. Gelscheiben wurden durch Schleudern durch ein 0,5 ml perforiertes PCR-Röhrchen, das auf ein 1,5 ml-Röhrchen gelegt wurde, zerkleinert. 150 µL Gel EB (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris–HCl (pH 7,8)) wurden zugegeben und der Slurry über Nacht unter Rühren inkubiert. Zur Aufreinigung der eluierten DNA wurden 700 µL Zymogen-ChIP-DNA-Bindungspuffer in das 1,5 ml-Röhrchen mit der zerkleinerten Gelscheibe und der Gelschicht gegeben, durch Pipettieren gemischt und die Aufschlämmung in eine ZymoGeniElute Säule überführt. Die Proben wurden zuerst bei 1000 × g für 3 min, dann 10.000 × g für 30 s gesponnen. Der Durchfluss wurde entfernt und die Proben mit 200 µl Zymo WashBuffer (mit EtOH) gewaschen. Gelreste wurden durch Flicken entfernt und Säulen durch Zugabe von weiteren 200 µL Zymo WashBuffer (mit EtOH) gewaschen. Der Durchfluss wurde entfernt, die Säulen durch Zentrifugation bei 14.000 ×g für 1 min trockengeschleudert und die DNA durch Zugabe von 20 µL vorgewärmtem Sequenzierungs-TET (10 mM Tris–HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) eluiert. Bibliotheken wurden sequenziert.

Western Blotting

Zellen wurden mit Igepal-Lysepuffer (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% Igepal) und Proteinkonzentrationen wurden mit BioRad Protein Assay Reagenz unter Verwendung von BSA als Standard bestimmt. Proteine wurden auf NuPage 4-12% Bis–Tris Gradientengelen (Invitrogen) aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran (Amersham) transferiert. Membranen wurden in TBS mit 0,1% Tween-20 und 5% BSA blockiert. Membranen wurden mit den angegebenen Primärantikörpern über Nacht bei 4°C geblottet. Meerrettichperoxidase-konjugierte Sekundärantikörper wurden mittels ECL plus Western Blotting Detection System (Amersham) nachgewiesen.

Tiere und Zellkultur

TGEMs wurden 3 Tage nach der Injektion von männlichen 8-wöchigen C57Bl / 6J– oder BALB / cJ-Mäusen gesammelt und bei 20 × 106 Zellen pro 15 cm Petrischale in DMEM plus 10% FBS und 1 × Penicillin-Streptomycin plattiert. Einen Tag nach dem Plattieren wurden die Zellen mit frischen Medien ergänzt und 1 h lang mit PBS (Veh) oder 100 ng / ml KLA behandelt und dann direkt für nachgeschaltete Analysen verwendet. iBMDM werden durch Infektion von BMDM mit einem Retrovirus hergestellt, das myc und Braf V600E66 enthält. Die immortalisierten Zellen werden dann über mehrere Wochen herausgewachsen. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Annual Care and Use Committee (IUCAC) der University of California, San Diego, festgelegt wurden.

Lentivirus-Produktion

Lguide wurde modifiziert, um ein U6-bsmbi-spgRNA-Gerüst und einen CMV-Promotor zu enthalten, der tagBFP2 antreibt. Für jedes Target wurden 2 CRISPR-Guides über PCR-Amplifikation mit dem H1-Promotor (bsmbi-Site/ guide1/Scaffold/H1-Promoter/guide 2/bsmb1-Site) für insgesamt 2 Guides pro Virus (U6 und H1-Site) eingefügt (Ergänzende Tabelle 4). Virus wurde mit pVSVg / ppAX2-System hergestellt. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Medien gesammelt und bei 4°C für 2 h bei 20.000 ×g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde über Nacht bei 4°C in OPTI-MEM rekonstituiert und bei -80 °C gelagert.

Herstellung von CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs wurden unter Verwendung einer lentiviralen Infektion hergestellt. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP wurden mit MOI 100, gemessen an 293T Zellen, mit Lentiblast (OZ biosciences) (je 5 µL Reagenz) in OPTI-MEM infiziert. Anschließend wurde 1 h bei Raumtemperatur bei 1300g zentrifugiert. Anschließend wurden Medien entfernt und Zellen in Knochenmarksmedien (30% L-Zelle, 20% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin in DMEM) für 2 Tage supplementiert. Die Zellen wurden dann für die Infektion durch Expression eines Transgens auf der viralen Sequenz (tagBFP2) sortiert.

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum experimentellen Design finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.

Verfügbarkeit des Codes