DNA triple helix formation: A potential tool for genetic repair

*Korrespondierender Autor: D. V. Kohli
Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, Indien
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Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Tripelhelix-bildende Oligonukleotide, die an doppelsträngige DNA binden, sind von besonderem Interesse, da sie auf das Gen selbst und nicht auf sein mRNA-Produkt abzielen (wie in der Antisense-Strategie). Die schlechte Stabilität einiger dieser Strukturen könnte jedoch ihre Verwendung unter physiologischen Bedingungen einschränken. Spezifische Liganden können in DNA-Tripelhelices interkalieren und diese stabilisieren. Diese Übersicht fasst die jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet zusammen und hebt gleichzeitig die wichtigsten Hindernisse hervor, die noch zu überwinden sind, bevor die Anwendung der Triplex-Technologie auf die therapeutische Genreparatur erreicht werden kann.

Tripelhelixbildung (Abb. 1) stand in jüngster Zeit wegen der möglichen Anwendung bei der Entwicklung neuer molekularbiologischer Werkzeuge sowie Therapeutika und wegen der möglichen Relevanz von H-DNA-Strukturen in biologischen Systemen im Mittelpunkt des Interesses . In intermolekularen Strukturen ist eine Oligopyrimidin-Oligopurin-Sequenz von DNA-Duplex durch ein Oligonukleotid des dritten Strangs in der Hauptrille gebunden .

Es wurden zwei Haupttypen von Tripelhelices beschrieben, abhängig von der Ausrichtung des dritten Strangs . Die ersten berichteten dreifachhelikalen Komplexe umfassten einen pyrimidischen dritten Strang, dessen Bindung auf Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindungen zwischen einem T-A-Basenpaar und Thymin sowie zwischen einem C-G-Basenpaar und protoniertem Cytosin beruht . Das (T,C)-haltige Oligonukleotid bindet parallel zum Oligopurin-Strang im sogenannten Pyrimidin-Motiv. Eine zweite Kategorie von Tripelhelices enthält Purine im dritten Strang, der antiparallel zum Oligopurinstrang orientiert ist. C · G × G- und T * A × A-Basistrillinge werden nach einem umgekehrten Hoogsteen-Wasserstoffbindungsschema gebildet . Oligonukleotide, die T und G enthalten, können auch Tripelhelices bilden, deren Orientierung von der Basenfolge abhängt .

Die Tripelhelixbildung bietet ein direktes Mittel zur selektiven Manipulation der Genexpression in Zellen, in denen DNA-Tripelhelices neue Perspektiven für die oligonukleotidgerichtete Genregulation bieten (Abb. 2). Synthetische Tripelhelix-bildende Oligonukleotide (TFOs) binden mit hoher Affinität und Spezifität an den Purinstrang in der Hauptrille der Homopurin- Homopyrimidin-Sequenz in doppelsträngiger DNA .

TFOs sind gute Kandidaten für die Verwendung als ortsspezifische DNA-Bindemittel und werden auf ihre Verwendung als potenzielle therapeutische Mittel untersucht. Sie wurden in Antisense-Anwendungen untersucht, bei denen sie auf mRNAs abzielen, in Antigenanwendungen, bei denen sie die Genexpression über die Tripelhelixbildung steuern, und in Anwendungen, die auf Proteine abzielen und bei denen sie als Aptamere verwendet werden .

TFOs können auch in der Gentherapie eingesetzt werden, wo sie auf die DNA-Sequenz des mutierten Gens abzielen, um dessen Transkription zu verhindern. Es wurde gezeigt, dass TFOs, die auf diese regulatorischen Stellen gerichtet sind, die Transkription der Zielgene selektiv reduzieren, wahrscheinlich durch Blockieren der Bindung transkriptioneller Aktivatoren und / oder Bildung von Initiationskomplexen. Triplex-vermittelte Modulation der Transkription hat potenzielle Anwendung in der Therapie, da es verwendet werden kann; zum Beispiel, um Ebenen von Proteinen zu reduzieren, die für Krankheitsprozesse wichtig sind. TFOs können auch als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung der Genexpression verwendet werden und haben sich in verschiedenen Gen-Targeting-Strategien in lebenden Zellen als wirksam erwiesen. TFOs können sequenzspezifisch an Polypurin/Polypyrimidin-Regionen in DNA binden. Die Spezifität dieser Bindung erhöht die Möglichkeit, die Triplexbildung für die gezielte Genommodifikation zu verwenden, mit dem ultimativen Ziel, genetische Defekte in menschlichen Zellen zu reparieren. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die Behandlung von Säugetierzellen mit TFOs DNA-Reparatur und Rekombination hervorrufen kann, in einer Weise, die ausgenutzt werden kann, um gewünschte Sequenzänderungen einzuführen. Es wurde über eine Reihe von Studien berichtet, in denen Oligonukleotide als Antigenverbindungen in den Zellen verwendet wurden .

Bildung von Triple-Helix-DNA

Die Triple-Helix-Bildung ist das Ergebnis der Bindung von Oligoinukleotiden mit einer hohen Erkennungsspezifität an die Hauptnut der doppelhelikalen DNA durch Bildung von Bindungen vom Hoogsteen-Typ mit Purinbasen der Watson-Crick-Basenpaare, der Verbindung, die rational zur künstlichen Regulation der Genexpression entwickelt wurde . Die Triplexbildung erfordert Mg2 + -Ionen, während sie durch K + -Ionen gehemmt wird.

Bei der Tripelhelix- oder Antigenstrategie bindet das Oligonukleotid in der Hauptrille der doppelsträngigen DNA über die Hoogsteen-Wasserstoffbrückenbindung zu einer Tripelhelix . TFOs binden Homopurin-Homopyrimidin-Sequenzen in doppelsträngiger DNA. Es gibt vier Strukturmotive für die Triplexbildung, die basierend auf der Zusammensetzung des dritten Strangs und seiner Orientierung relativ zum purinreichen Strang des Duplex beschrieben wurden. Purinmotiv-TFOs (solche, die aus G und A bestehen) bilden G*G:C- und A*A:T-Tripletts und binden in antiparalleler Orientierung bezüglich des Purinstrangs des Duplexes. Andererseits bilden Pyrimidinmotiv-TFOs (C / T) Triplexe in paralleler Orientierung und im Allgemeinen nur bei niedrigem pH-Wert, da die Cytosinbasen protoniert werden müssen, um Hoogsteen-Bindungen zu bilden; Sie bilden C + * G: C- und T * A: T-Tripletts. Schließlich binden gemischte Purin- und Pyrimidin-TFOs entweder parallel oder antiparallel und bilden G * G: C- und T * A: T-Tripletts. Die Orientierung, in der die gemischten Motiv-TFOs binden, hängt von der Anzahl der GpA- und ApG-Schritte im Homopurintrakt ab . Die antiparallele Ausrichtung wird durch eine größere Anzahl von Schritten begünstigt, während eine geringe Anzahl von Schritten die parallele Ausrichtung begünstigt.Sobald das beste Motiv für die Bindung einer bestimmten Zielsequenz etabliert ist, begrenzen Probleme mit natürlichen Phosphodiesteroligonukleotiden den Erfolg des Antigenansatzes und die therapeutischen Anwendungen von Oligonukleotiden im Allgemeinen. Oligonukleotide mit dem natürlichen Phosphodiesterrückgrat sind anfällig für Endo- und Exonukleasen. Die vorherrschende Aktivität, die Oligonukleotide abbaut, ist die 3′-Exonukleaseaktivität, aber in einigen Umgebungen wurde auch eine Endonukleaseaktivität beobachtet . Daher müssen TFOs für die Anwendung als Therapeutika in vivo in der Lage sein, sowohl der Exonuklease- als auch der Endonuklease-Aktivität zu widerstehen, um ihr Ziel zu erreichen. Eine Rückgratmodifikation, die Nukleaseresistenz verleiht, aber die Bindung an doppelsträngige DNA mit hoher Affinität ermöglicht, ist für die In-vivo-Anwendungen von TFOs erforderlich.

Phosphorodiamidat-Morpholino-Oligomere sind modifizierte Backbone-Oligonukleotide, die zuvor als Antisense-Mittel untersucht wurden . Morpholino-Oligonukleotide haben ein ungeladenes Rückgrat, in dem der Desoxyribosezucker der DNA durch einen sechsgliedrigen Ring und die Phosphodiesterbindung durch eine Phosphorodiamidatbindung ersetzt ist (Abb. 3). Morpholino-Oligonukleotide sind resistent gegen enzymatischen Abbau und scheinen als Antisense-Mittel zu wirken, indem sie die Translation stoppen oder das Prä-mRNA-Spleißen stören, anstatt RNase H zu aktivieren. Sie wurden erfolgreich an Gewebekulturzellen durch Methoden geliefert, die die Zellmembran physikalisch stören, und eine Studie, die mehrere dieser Methoden verglich, ergab, dass das Scrape-Loading die effizienteste Methode der Abgabe war; Da das Morpholino-Rückgrat jedoch ungeladen ist, sind kationische Lipide keine wirksamen Mediatoren der Morpholino-Oligonukleotidaufnahme in Zellen . Ein kürzlich veröffentlichter Bericht zeigte die Triplexbildung durch ein Morpholino-Oligonukleotid, und aufgrund des nichtionischen Rückgrats zeigten diese Studien, dass das Morpholino-Oligonukleotid in Abwesenheit von Magnesium zur Triplexbildung fähig war .

Es wurde gezeigt, dass Kationen eine wichtige Rolle bei der Tripelhelixbildung spielen. Wenn Phosphodiesteroligonukleotide als TFOs verwendet werden, wird Magnesium im Allgemeinen für die Triplexbildung mit Purin und Mischmotiv-TFOs benötigt; es beschleunigt auch die Reaktion und stabilisiert den mit Pyrimidinmotiv-TFOs gebildeten Triplex . Es wurde gezeigt, dass andere zweiwertige Kationen in Bezug auf die Triplexbildung in der gleichen Kapazität wie Magnesium funktionieren. Magnesium tritt in einer Konzentration von ~ 0,8 mM in der Zelle und ~ 1,5 mM im Blut auf , aber die meisten In-vitro-Triplexreaktionen werden in 5-10 mM MgCl2 durchgeführt. Kalium kommt in der Zelle in einer Konzentration von ~ 140 mM und bei 4 mM im Blut vor. Hohe Kaliumkonzentrationen können die Triplexbildung mit guaninreichen Oligonukleotiden, die als TFOs ausgelegt sind, hemmen, indem sie andere sekundäre DNA-Strukturen wie Dimere und Quadruplexe begünstigen . Es wird notwendig sein, die begrenzte Fähigkeit von Phosphodiester-TFOs zu überwinden, einen Triplex in niedrigem Magnesium und hohem Kalium zu bilden, damit sie unter physiologischen Bedingungen wirksam sind. In einer kürzlich durchgeführten Studie mit Morpholino-TFOs wurde die Triplexbildung in Abwesenheit von Magnesium und in Gegenwart von Kalium nachgewiesen. Diese Eigenschaften machen Morpholino TFOs zu guten Kandidaten für weitere Studien als Antigentherapeutika.

Molekulare Modellierung

Die DNA-Triplex-Struktur kann durch molekulare Modellierungstechniken konstruiert werden, indem Koordinaten verwendet werden, die die Zuckerkonformation von (T, C) -Motiv-Tripelhelices korrekt berücksichtigen . Diese Struktur ist näher an einer B-Form-DNA, wie durch NMR-Studien berichtet, im Vergleich zu der vorgeschlagenen Struktur , basierend auf Faserröntgenbeugung. Das JUMNA-Programm ermöglicht die Konstruktion von DNA-Strukturen nach ihren helikalen Parametern . Eine Interkalationsstelle kann leicht im Triplex erzeugt werden, indem der Anstiegsparameter für zwei benachbarte T · A × T-Basistriplets verdoppelt wird (Anstieg = 6,8 Å) und anschließend der Verdrehungsparameter zwischen diesen beiden Triplets von 34 ° auf 16 ° verringert wird, um die Bindungsabstandsbeschränkungen zu verringern.

Mit Hilfe der molekularen Modellierung kann man die Möglichkeit demonstrieren, eine parallele Tripelhelix zu bilden, in der der Einzelstrang mit dem intakten Duplex in der Nebenrille über neuartige Basisinteraktionen interagiert .

JUMNA verwendet eine Mischung aus helikalen und internen Koordinaten (Valenz- und Diederwinkel), um die Flexibilität der Nukleinsäure zu beschreiben. Die helikalen Parameter positionieren jedes 3’Monophosphat-Nukleotid in Bezug auf ein Festachsensystem. Übergänge zwischen aufeinanderfolgenden Nukleotiden werden mit quadratischen Beschränkungen der O5 ‚-C5‘-Abstände aufrechterhalten. Zusätzlich zu einer reduzierten Anzahl von Variablen in Bezug auf kartesische Koordinatenprogramme ermöglicht die Wahl physikalisch bedeutsamer Variablen große, konzertierte Konformationsbewegungen während der Minimierung, zusammen mit einer effizienten Kontrolle der Struktur und einer einfachen Einführung von Einschränkungen oder Beschränkungen. Zu den verfügbaren Werkzeugen gehören sowohl adiabatische Kartierungen als auch kombinatorische Suchen in Bezug auf ausgewählte Strukturparameter. Zu den Besonderheiten des Flexkraftfeldes gehören das Vorhandensein eines spezifischen Terms zur Berücksichtigung der Winkelabhängigkeit der Wasserstoffbindung und die Möglichkeit einer elektrostatischen Energieabschirmung mit einer sigmoidalen dielektrischen Funktion ε (R) = D- (D-D0) / 2 exp (-RS), wobei R der Abstand zwischen zwei Ladungen ist. Die Steigung S, der Plateauwert bei großer Entfernung D und der Anfangswert D0 der Funktion sind einstellbar, mit Standardwerten von 0,16, 80 bzw. 1, wobei zwei Annahmen verwendet werden, die bereits für die Konstruktion der Nebenrillen-Tripelhelix verwendet wurden. Zunächst werden die Basistripletts so zurückgehalten, dass sie koplanar sind, um mögliche Interbase-Triplett-Wechselwirkungen zu vermeiden. Solche Wechselwirkungen bilden sich leicht beim Aufbau von gestreckten Helices, können aber bei der Erkennung oder dem Strangaustausch keine Rolle spielen, da diese Prozesse unabhängig von der Gesamtsequenz sind. Es wurde geprüft, dass die optimierte Struktur des Moll-Nut-Triplexes unabhängig von diesen Einschränkungen ist. Die zweite Annahme, in Übereinstimmung mit der Stöchiometrie von RecA / DNA-Komplexen, die drei Nukleotide pro RecA-Monomer zeigt, ist die Verwendung der Trinukleotidhelixsymmetrie. Aus diesem Grund wurden Vorstudien auf Sequenzen mit Trinukleotidwiederholung beschränkt.

Für die Triplex-Konstruktion und -manipulation sind spezifische Einschränkungen oder Einschränkungen erforderlich. Dazu gehören die „Plateau“ -Beschränkungen und die zuvor beschriebenen Einschränkungen der Trinukleotidsymmetrie . Die „Plateau“ -Zurückhaltung behält die Koplanarität der Basen bei, die ein Triplett bilden, während die für die Basenpaarumschaltung erforderlichen Rotationen und Verschiebungen ermöglicht werden. Die Trinukleotidsymmetrieeinschränkung impliziert die Äquivalenz der Variablen, die jede aufeinanderfolgende Gruppe von drei Nukleotiden beschreiben. Stretching dsDNA, so dass die Verdrehung abnimmt und die kleine Rille öffnet, wurde zuvor erreicht, indem der Abstand zwischen den terminalen O3′-Atomen der Trinukleotidsymmetrieeinheit begrenzt wurde. Diese Zurückhaltung wurde geringfügig modifiziert, da der O3′-O3′-Abstand durch eine seitliche Verschiebung der Backbones beim Strangwechsel verändert werden kann. In einer neueren Arbeit wurde nur die Komponente des O3′-O3′-Vektors parallel zur Helixachse zurückgehalten. Die Beschränkungen der Nutbreite, die mit Hilfe numerischer Poisson-Boltzmann-elektrostatischer Berechnungen kalibriert wurden, wurden verwendet, um eine Nutverengung aufgrund des Fehlens expliziter Lösungsmittelmoleküle zu vermeiden .

Die Basenpaarumschaltung wird durch Basenrotation unter Verwendung des von Bernet et al. Dies beinhaltet eine Beschränkung des Winkels θ zwischen der glykosidischen Bindung (Purin: C1′-N9 oder Pyrimidin: C1′-N1) und dem Vektor, der die beiden C1′-Atome eines Basenpaares verbindet, projiziert auf die Ebene senkrecht zu einer lokalen Schraubenachse. θ hat in der kanonischen B-DNA einen Wert von 55°. Das Modellieren des Basenpaarwechsels für eine ausgewählte Basis beinhaltet eine adiabatische Variation von θ von 65 ° bis 10 ° in Schritten von 2 °, während sowohl „Plateau“ – als auch Dehnungsbeschränkungen beibehalten werden.

Hindernisse und Einschränkungen bei der Tripelhelixbildung

Biologische Anwendungen von TFOs werden durch grundlegende biophysikalische Überlegungen sowie durch physiologische Bedingungen beeinträchtigt. Die Triplexbildung beinhaltet die Annäherung und Bindung eines negativ geladenen dritten Strangs an einen doppelt negativ geladenen Duplex. Die Neutralisierung der Ladungsabstoßung erfolgt typischerweise experimentell durch Mg ++ (5-10 mM), die viel höher sind als das, was in Zellen verfügbar ist . Darüber hinaus beinhaltet die Triplexbildung Konformationsänderungen seitens des dritten Strangs und eine gewisse Verzerrung des zugrunde liegenden Duplexes . Pyrimidinmotivtriplexe sind bei physiologischem pH-Wert instabil, da bei relativ saurem pH-Wert (pKa = 4,5) eine Cytosinprotonierung erforderlich ist. Dies ist für die zweite Hoogsteen-Wasserstoffbindung notwendig, obwohl die resultierende positive Ladung offenbar den wichtigeren Beitrag zur Triplexstabilität leistet . Pyrimidinmotiv-Triplexe, die benachbarte Cytosine enthalten, sind oft weniger stabil als solche mit isolierten Cytosinen. Traditionell wurde dies auf Ladungs-Ladungs-Abstoßungseffekte zurückgeführt , obwohl eine kürzlich durchgeführte Studie darauf hindeutet, dass eine unvollständige Protonierung benachbarter Cytosine der kritische Faktor sein könnte . Darüber hinaus können Purinmotiv-Drittstränge (die G-reich sind) G-Tetraden in physiologischen K + -Spiegeln bilden, die die Triplexbildung hemmen . All diese Faktoren setzen der Triplexbildung kinetische Barrieren auf und verringern die Stabilität von Triplexen, die einmal gebildet wurden (die meisten Triplexe sind selbst unter optimalen Bedingungen in vitro weniger stabil als der zugrunde liegende Duplex .

Strategien, um den Einschränkungen entgegenzuwirken

Das erste und wichtigste Problem bei der tripelhelikalen Antigenstrategie ist die Instabilität des von den TFOs gebildeten Triplexes unter physiologischen Bedingungen, was folglich die Nutzung dieser sehr faszinierenden Strategie, die für die Genkorrektur bestimmt ist, in unterschiedlichem Maße einschränkt. Daher wurden verschiedene Ansätze und Strategien vorgeschlagen, um der gebildeten dreifachhelikalen Struktur Stabilität zu verleihen.

Oligonukleotid-gerichtete Tripelhelices könnten stabilisiert werden, indem Nukleinsäure-Liganden verwendet werden, die selektiv Tripelhelices stabilisieren. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Ethidiumbromid eine Tripelhelix aus Poly (dT) · Poly (dA) × Poly (dT) bindet und stabilisiert, die nur T · A × T-Tripletts enthält . Diese Verbindung stabilisiert (oder destabilisiert) jedoch die Tripelhelices, die sowohl T · A × T- als auch C · G × C + -Basistripletts enthalten, wahrscheinlich infolge elektrostatischer Abstoßung schlecht . Benzopyridoindolderivate waren die ersten Moleküle, von denen berichtet wurde, dass sie diese letztere Art von Tripelhelices stark stabilisieren, obwohl sie eine Präferenz für T · A × T × haben . Es wurde auch gezeigt, dass mehrere andere Interkalatoren sowie verschiedene DNA-Minor-Groove-Liganden an DNA-Tripelhelices binden. Zum Beispiel können Tripelhelices durch chemische Modifikation von Oligonukleotiden stabilisiert werden, wie es gezeigt hat, dass Psoralen, das an Oligonukleotide gebunden ist, ihre biologische Aktivität nach UV-Bestrahlung erhöht . Interkalatoren stabilisieren gewöhnlich in größerem Maße Tripelhelices, die T · A × T-Tripletts enthalten, während kleinere Rillenbinder gewöhnlich Triplexe destabilisieren, außer in einem bestimmten Fall, in dem die Tripelhelix einen RNA-Strang betraf . Da keine Strukturdaten zu Tripelhelix-Ligand-Komplexen verfügbar sind, ist nicht viel über die Wechselwirkungen bekannt, die die spezifische Interkalation in Tripelhelices lenken. Es wurde gezeigt, dass BPI-Derivate zwischen T · A × T-Basistrillingen interkalieren durch Anregungsfluoreszenzenergietransfer von Basistrillingen zu Liganden und durch linearen und zirkulären Dichroismus . Es wurde festgestellt, dass Pyrimidinparallele Morpholino-Oligonukleotide ein Triplex mit Duplex-Target bilden können. Dieses Motiv erforderte erwartungsgemäß einen niedrigen pH-Wert für die Triplexbildung, wie es das pyrimidinparallele Motiv Phosphodiester TFO erfordert. Es kann möglich sein, diese pH-Abhängigkeit mit solchen Substitutionen wie 5-Methylcytosin für die Cytosine im TFO zu überwinden .Ein alternativer Ansatz, mit dem Tripelhelices stabilisiert werden können, sind chemische Modifikationen von Oligonukleotiden, wie die kovalente Bindung eines Acridinmoleküls . Es hat sich gezeigt, dass die Acridinsubstitution die Hemmung der Restriktinenzymspaltung stark erhöht und auch die Sequenzspezifität für die Triplexbildung nicht beeinträchtigt.

Anwendungen von Tripelhelix-DNA

Die Bildung intermolekularer DNA-Tripelhelices bietet die Möglichkeit, Verbindungen mit umfangreichen Sequenzerkennungseigenschaften zu entwerfen, die als Antigenagenten oder Werkzeuge in der Molekularbiologie nützlich sein können . In den letzten zehn Jahren hat sich in der medizinischen Chemie ein neuer Ansatz herausgebildet, bei dem DNA-Analoga als therapeutische Mittel verwendet werden. Dies basiert auf der Regulierung der Expression von Genen krankheitsbezogener Proteine/ Enzyme durch Blockierung ihrer Transkription (Antigen) oder Translation (Antisense) (Abb. 4). Es wird durch sequenzspezifische Bindung komplementärer Oligonukleotide entweder an DNA-Duplex über Triplexbildung beeinflusst, um die Produktion von mRNA zu hemmen oder in die Translation der letzteren in Proteine einzugreifen. Da Oligonukleotide nicht leicht in Zellen eindringen und durch zelluläre Nukleasen zerstört werden können, werden eine Vielzahl chemisch modifizierter Analoga von Oligonukleotiden für die Entwicklung als therapeutische Mittel entworfen, synthetisiert und bewertet.

Die spezifische Erkennung von Homopurin-Homo-Pyrimidin-Regionen in Duplex-DNA durch triplexbildende Oligonukleotide (TFOs) bietet eine attraktive Strategie für die genetische Manipulation mit dem ultimativen Ziel, genetische Defekte in menschlichen Zellen zu reparieren. Die Fähigkeit, auf Mutationen abzuzielen, kann sich als nützlich erweisen, als Werkzeug zur Untersuchung der DNA-Reparatur und als Technik für die Gentherapie und Gentechnik .

Für verschiedene biochemische Anwendungen wie die Entwicklung hochspezifischer künstlicher Nukleasen wurden effiziente Werkzeuge auf Basis von Tripelhelices entwickelt. Die Antigenstrategie bleibt eines der faszinierendsten Anwendungsgebiete von Triplex zur selektiven Kontrolle der Genexpression (Tabelle 1). Das Targeting genomischer Sequenzen hat sich in einer noch begrenzten Anzahl von Studien als wertvolles Konzept erwiesen; Die lokale Mutagenese ist in dieser Hinsicht eine interessante Anwendung triplexbildender Oligonukleotide auf Zellkulturen .

Table 1: Antigennukleinsäurestudien in eukaryotischen Zellen80

Antigenstrategien konzentrieren sich in erster Linie auf das Gen-Targeting durch homologe Rekombination oder durch Triple-Helix-bildende Oligodesoxynukleotide . Aus vielen technischen Gründen, einschließlich der sehr begrenzten Genzugänglichkeit innerhalb der stark malariakondensierten, proteinumhüllten Chromosomenstruktur, ist die klinische Anwendung dieser Methoden nicht schnell vorangekommen. Haben kürzlich einen alternativen Ansatz beschrieben, bei dem Polyamide verwendet werden, die in den Zellkern diffundieren und spezifische DNA-Sequenzen erkennen können . Obwohl sehr aufregend, steckt diese Methode noch in den Kinderschuhen und ihr endgültiger klinischer Nutzen ist unbekannt .

Therapeutische Anwendungen der Antigen-Technologie

Triple-Helix-DNA hat Aufmerksamkeit erregt wegen der möglichen Anwendung von TFOs als Therapeutika, für die Anwendung wie intrazelluläres Gen-Targeting, als rationale chemische Lösungen zur sequenzspezifischen Erkennung eines DNA-Duplexes und Identifizierung von Genen, die für das Zellwachstum und die maligne Transformation verantwortlich sind . Mit diesem Wissen ist der natürliche Wunsch entstanden, diese Informationen in neue, zielspezifische therapeutische Strategien zur Behandlung von Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen häufigen Erkrankungen der Menschheit umzusetzen (Tabelle 2). Die jüngste Entwicklung eines relativ spezifischen biochemischen Inhibitors der bcr / abl-Protein-Tyrosinkinase bei Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie ist ein erstaunliches Beispiel für diese Suche . Für Therapien, die direkt auf den Ersatz, die Reparatur oder die Deaktivierung von krankheitsverursachenden Genen abzielen, waren die Fortschritte viel langsamer und ein Erfolg, der dem biochemischen bcr / abl-Inhibitor entspricht, muss noch erreicht werden. Die Gründe dafür sind komplex und variieren mit der Art der verwendeten gengesteuerten Therapie .

Tabelle 2: Einige Krankheiten, die durch DNA-Therapeutika behandelt werden können

Stephenson und Zamecnik zeigten, dass ein kurzes (13nt) DNA-Oligonukleotid reverse komplementär in der Sequenz (Antisense) zum Rous-Sarkom-Virus die Virusreplikation in kultur. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Antisense- und Antigenoligonukleotiden bei ihrer Verwendung als Therapeutika ist ihre Nukleaseresistenz. Phosphorothioat-Oligonukleotide sind die häufigste Art von Oligonukleotiden mit relativ hoher Nukleaseresistenz und wurden als Arzneimittel gegen Cytomegalovirus-induzierte Retinitis auf den Markt gebracht . Oligonukleotide mit einem 2′-O,4′-C- Ethylen-Nukleinsäure (ENA) -Rest an der zweiten Position vom 3′-Ende zeigen eine viel höhere Nukleaseresistenz als solche mit einem Ethylen-Nukleinsäure (LNA) -Rest an derselben Position .Obwohl Kurreck et al. berichteten, dass LNA-Oligonukleotide im menschlichen Serum stabil waren , waren partiell modifizierte ENA-Oligonukleotide viel nukleaseresistenter als LNA-Oligonukleotide im Rattenplasma. Darüber hinaus zeigen Oligonukleotide, die am 3′- und 5′-Ende mit ENA-Resten zusammenhängend modifiziert sind, eine höhere Stabilität als solche, die teilweise modifiziert sind. Somit haben ENA-Oligonukleotide ein hohes Potenzial als Antisense- und Antigenmittel, die in vivo verwendet werden können . Sequenzspezifische Triplexbildung kann für Gen-Targeting, Gen-Silencing und Mutagenese angewendet werden.

Zukunftsaussichten

Oligonukleotide können durch Tripelhelixbildung ortsspezifisch an ein interessierendes Zielgen binden. Triplexbildende Oligonukleotide binden derzeit an das HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) / neu-Gen, ein Gen, das in einer Vielzahl von menschlichen Tumoren überexprimiert wird, einschließlich nicht kleinzelligem Lungenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs und GI-Tumoren. Diese Strategie wird weit verbreitet sein, um die Expression vieler Onkogene oder anderer krebsbezogener Gene zu verhindern. Diese „Antigen“ -Oligonukleotide werden nun verwendet, um DNA-Alkylierungsmittel an spezifische Basen im HER-2 / neu-Promotor und in der kodierenden Sequenz abzugeben, um die Transkriptionsinitiierung und -verlängerung zu verhindern. Insbesondere wurden triplexbildende Oligonukleotide verwendet, um Stickstoffverbindungen, wie Chlorambucil, an eine spezifische Guaninbase im HER-2 / neu-Gen abzugeben, um die Genexpression zu verhindern. Eine zielspezifische Krebsbekämpfungsstrategie mit Antigenoligonukleotiden, die an DNA-Wirkstoffe gekoppelt sind, wird sich in naher Zukunft als Meilenstein erweisen.

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