Doppelblockade von CD47 und HER2 eliminiert radioresistente Brustkrebszellen

Zelllinien

Menschliche Brustkrebs-MCF-7-, MDA-MB-231-, BT474-, BT549-, SKBR3-Zelllinien, Glioblastom-U251- und Darmkrebs-HCT116-Zelllinien wurden von ATCC gekauft. MCF-7-, MDA-MB-231-, BT474-, BT549- und U251-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% FBS und SKBR3-Zellen in RPMI-1640-Medium mit 10% FBS gehalten. HCT116-Zellen wurden in McCoys 5a-Medium mit 10% FBS gehalten. Die strahlenresistenten MCF7 /C6- und MDA-MB-231 / C5-Zelllinien, die aus überlebenden Fraktionen von MCF7- und MDA−MB-231-Zellen nach wiederholter Bestrahlung kloniert wurden; die HER2-überexprimierenden Brustkrebsstammzellen (HER2 + / CD44 + / CD24- / niedrige BCSCs) wurden aus MCF7 / C626 isoliert. Maus-Triple-negative Brustkrebs-4T1-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% FBS gehalten. Humane Monozyten-THP-1 wurden in ATCC-formuliertem RPMI-1640-Medium kultiviert, das mit 10% FBS, 15 mM HEPES, 4,5 g / l Glucose und 2-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 0,05 mm Maus Mφ RAW 264 ergänzt wurde.7 Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% FBS nach der ATCC-Kulturmethode kultiviert. Alle Zelllinien wurden mit MycoSensor PCR Assay Kit (Agilent Technologies, Catalog #302108) auf Mycoplasma Kontamination getestet.

Plasmide und Reagenzien

CD47-Promotor-kontrollierter Luciferase-Vektor wurde durch Klonieren der humanen CD47-Promotorregion (-1554 nt) in pGL2-basisches Plasmid von KpnI/Hind III-Stellen konstruiert. Die Deletion der mutmaßlichen NF-kB-Bindungsstellen (TGGAAGCT-764-757) wurde mit einem Quick Mutation Kit (Stratagene, La Jolla, CA) durchgeführt. Die verwendeten Primersequenzen: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib (Katalog # S1028) wurde von Selleckchem gekauft. Anti-CD47 (B6H12) Antikörper für IHC, ICC und Western Blot wurde von Santa Cruz gekauft (Katalog # sc-12730). Anti-CD47-FITC für die Durchflusszytometrie wurde von BD Biosciences (Katalog # 556045) erworben. Der Anti-Human-CD47 (B6H12) -Antikörper für den Phagozytose-Assay wurde aus dem B6H12.2-Hybridom (ATCC® HB-9771™) extrahiert. Der Anti-Maus-CD47-Antikörper zur In-vivo-Tumorhemmung wurde aus dem von Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine) bereitgestellten MIAP301-Hybridom extrahiert. Der Anti-CD11b-Antikörper für die IHC-Färbung wurde von Invitrogen (Katalog # MA5-17857) erworben. Der monoklonale Anti-α-Tubulin-Mausantikörper für Western Blot wurde von Sigma-Aldrich gekauft (Katalog # T6074). Maus monoklonale Anti-β-Aktin-Antikörper für Western Blot wurde von Sigma-Aldrich (Katalog # A5441) gekauft. Anti-HER2 / ERBB2 (Katalog # 29D8) Antikörper für IHC-Färbung und Western Blot wurde von Cell Signaling Technology (Katalog # 2165) gekauft. Der Anti-HER2-APC-Antikörper für die Durchflusszytometrieanalyse wurde von BD Biosciences (Katalog # 340554) erworben.

Immunoblotting

Proteine aus Zellen oder Tumorgeweben wurden in RIPA-Lysepuffer (Pierce) extrahiert, ergänzt mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Zellsignalisierung). Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA-Assay (Pierce) bestimmt. Anschließend wurden Lysate denaturiert und Proben mit 30 µg Proteinen in 10%igem SDS-Polyacrylamidgel elektrophoretisch untersucht und anschließend auf Polyvinylidendifluoridmembranen (Bio-Rad) transferiert. Nach Blockierung mit 5% fettfreier Trockenmilch wurde die Membran dem Primärantikörper ausgesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Blots wurden durch Markierung mit HRP-gekoppelten Sekundärantikörpern (Sigma-Aldrich) und Inkubation mit Amersham ECL Western Blotting Detection Reagenz (Katalog # RPN2106) sichtbar gemacht. Blots wurden auf einem Konica SRX101A Entwickler entwickelt und mit ImageJ quantifiziert.

Durchflusszytometrische Analyse

Gesammelte Zellen wurden mit PBS mit 0,5% BSA in PBS gespült und die Zellpellets wurden mit fluoreszenzmarkierten Primärantikörpern bei 37 °C für 30 min inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen mit 0,5% BSA/PBS. Alle Antikörper wurden titriert, um den Zustand zu optimieren, bevor sie auf das Experiment angewendet wurden. Die Durchflusszytometrieanalyse wurde mit dem FACS Canto II Cytometer (BD) und die anschließende Analyse mit der Software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA) durchgeführt. Die Gating-Strategien basierten auf FSC- und SSC-Eigenschaften und wurden für positive Zellpopulationen in FITC-, APC-Kanälen eingerichtet.

Menschliches Brustkrebsgewebe

Frisch gefrorenes HER2-positives und -negatives Brustkrebsgewebe wurde vom UC Davis Comprehensive Cancer Center Biorepository (IRB # 283665 und IRB # 218204) bereitgestellt, das vom UC Davis Comprehensive Cancer Center Support Grant (CCSG) des National Cancer Institute (NCI P30CA093373) mit allen Patienteninformationen mit Ausnahme der Diagnoseergebnisse finanziert wurde. Zusätzliche menschliche brustkrebspathologische Proben, einschließlich der ungefärbten 4 µm dicken Abschnitte von formalinfixiertem, paraffin eingebettetem (FFPE) gepaart mit primärem Brustkrebs und rezidivierendem Brustkrebs, wurden von der Abteilung für Pathologie der Ohio State University mit IRB-Genehmigung für die Forschung erhalten (# 2002H0089).

Immunhistochemie (IHC)

Die immunhistochemische Färbung erfolgte an 4µm dicken FFPE-Gewebeschnitten. Kurz wurden die Objektträger deparaffiniert und rehydriert, und Antigene wurden für 40 min in einem Citratpuffer (pH 6,1) bei 95 °C entnommen. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit 3%iger H2O2-Lösung blockiert. Die Primärantikörperinkubation erfolgte bei 4°C über Nacht, gefolgt vom Vectastain ABC Kit (Vector Laboratories) bei RT für 30 min gemäß Herstellerangaben. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Peroxidase-Substrat-Kit nachgewiesen und mit Hämatoxylin (Vector Laboratories) gegengefärbt. Zwei leitende Pathologen waren für die Diagnose von Klinikbrustkrebs und die Bewertung experimenteller Tumoren verantwortlich. Die CD47-Expression wurde sowohl unter Verwendung der Färbeintensität als auch des Prozentsatzes der gefärbten Zellen bewertet. Die Färbeintensität wurde mit 0: negativ; 1: schwach; 2: mäßig; 3: stark bewertet. Hohe Expression war definiert als starke Färbungsintensität in mehr als 25% der Tumorzellen; mittlere Expression war moderate Färbungsintensität in mehr als 25% der Tumorzellen; geringe Expression war schwache Färbungsintensität in mehr als 25% der Tumorzellen oder mäßige Färbung in <25% der Tumorzellen unter Verwendung der ASCO-CAP-Leitlinien63 wurde für die Interpretation der HER2-Immunhistochemie (IHC) verwendet, und die HER2-Proteinexpression wurde als negativ bewertet IHC 0 (keine Färbung oder Membranfärbung, die unvollständig und schwach / kaum wahrnehmbar ist und innerhalb ≤10% der invasiven Tumorzellen liegt) oder negativ IHC 1+ (unvollständige Membranfärbung das ist schwach/kaum wahrnehmbar und innerhalb >10% der invasiven Tumorzellen); zweideutige IHC 2+ (unvollständige und / oder schwache / mäßige umlaufende Membranfärbung und innerhalb von >10% der invasiven Tumorzellen; und / oder vollständige und intensive umlaufende Membranfärbung und innerhalb von ≤10% der invasiven Tumorzellen); Positive IHC 3+ (vollständige und intensive umlaufende Membranfärbung in mehr als 10% der invasiven Tumorzellen). Wenn die Ergebnisse nicht eindeutig waren (2+), wurden Reflextests unter Verwendung von In-situ-Hybridisierung (ISH) durchgeführt. Zum Nachweis der CD47-Expression von in vivo bestrahlten Tumoren wurden behandelte Mäusetumoren entfernt und in 4% Paraformaldehyd in PBS für 24 h fixiert. Die Proben wurden mit Ethanol der Serie (70%, 95% und 100%) für 48 h dehydratisiert, bevor sie in die Paraffinlösung (Polysciences) eingebettet wurden.

Immunzytochemie (ICC)

Die Zellen wurden auf runden Deckgläsern ausgesät und auf 60-80% Konfluenz gezüchtet, gefolgt von Spülen mit PBS, Fixieren in 4% Paraformaldehyd (pH 7,2) und Permeabilisierung mit 0,1% Triton X-100 in PBS. Anschließend wurden die Zellen 15 min in einer Blockierlösung inkubiert, bevor sie mit dem Primärantikörper über Nacht bei 4°C mit 1:250 Verdünnungen inkubiert wurden. Die Zellen wurden mit TR- oder FITC-konjugierten Sekundärantikörpern verdünnt 1:1000 in der Blockierungslösung für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert und mit konfokaler Mikroskopie analysiert.

Identifizierung von strahlungsassoziierten antigenen Proteinen

C57/B6-Maus wurde als Immunisierungswirt mit 5 × 106 MCF7/C6-Zellen in 0 verwendet.1 ml Volumen an der Basis des Schwanzes oder Fußballs pro Maus injiziert, gefolgt von einer Steigerung mit dem gleichen Zellvolumen am 14. Am 5.-7. Tag nach der zweiten Herausforderung wurden die Mäuse eingeschläfert und das Serum wurde gesammelt, um antigene Moleküle nachzuweisen, die in radioresistenten BC-Zellen exprimiert wurden. Um RAAPs von unspezifischen Molekülen zu unterscheiden, die in normalen Brustepithelzellen und Wildtyp-MCF7-Zellen exprimiert werden, wurde ein Vorreinigungsverfahren mit dem Rohserum durch die folgenden Schritte durchgeführt. Zwei Millionen humane normale brustepitheliale MCF10A-Zellen wurden in einer Lösung hergestellt, die 1 mm EDTA / PBS ohne Trypsin enthielt, um zu vermeiden, dass einige der empfindlichen Proteine verdaut wurden, gefolgt von zweimaligem Spülen mit PBS. Die Zellen wurden pelletiert und dann durch Klopfen auf den Boden des Röhrchens gelöst, gefolgt von Zugabe von 1 ml Maus-Antiseren und Drehen bei 4 ° C für 2 h. Die Mischung wurde dann bei 9391 × g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und die Überstände wurden gesammelt, was einmal wiederholt wurde. Das erste gereinigte Antiserum wurde durch Inkubation mit Wildtyp-MCF7-Zellen unter Verwendung der gleichen Verfahren weiter gereinigt und sechsmal wiederholt. Das endgültige gereinigte Antiserum wurde dann durch Western Blot gegen Proteinlysat aus MCF10A-Zellen, MCF7−Zellen, MCF7 / C6- und RD-BCSC-Zellen getestet, die nach Brustkrebsstammzellmarkern HER2 + / CD44 + / CD24- sowie Aldehyddehydrogenase (ALDH) 64 sortiert wurden. CD47 und HER2 zusammen mit anderen RAAPs in den radioresistenten BC-Zellen wurden durch Western-Blots oder durch Immunpräzipitation von aus RD-BCSC-Zellen gereinigten Membranproteinen identifiziert und die eluierten Fraktionen über LC/MS analysiert.

CRISPR-Editierung von HER2 und CD47

Die sgRNAs wurden nach den Anweisungen der CRISPR-Designsoftware von Dr. Zhang Lab (http://crispr.mit.edu) und dem etablierten Protokoll, das in der vorherigen Veröffentlichung beschrieben wurde65. Vier Oligos wurden entsprechend den humanen sgRNAs synthetisiert und nach dem Zhang Lab GeCKO Pooled Library Amplification Protocol in den lentiCRISPR v2-Vektor kloniert. Um die Möglichkeit eines unspezifischen Targetings zu minimieren, wurden drei sgRNA-Oligos jedes Targeting-Gens synthetisiert und getestet. Für nachfolgende Experimente wurde die sgRNA mit der besten durch Western-Blotting ermittelten Knockout-Effizienz ausgewählt. Die sgRNA-Sequenzen wurden für humane und Mauszellen wie folgt verwendet:

hHer2gRNA_F: CACCGCGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Nach 12-stündiger Inkubation wurden den Zellen 1 ml virushaltiger Überstand mit 8 ng Polybren zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 6 h. Anschließend wurden 0,5 ml zusätzliches reguläres Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS zugegeben und über Nacht weiter kultiviert. Das Infektionsmedium wurde durch 2 ml Frischmedium mit 10% FBS ersetzt und 72 h kultiviert. Die Zellen wurden auf 60 mm Gewebekulturschalen passagiert und durch Kultivierung in 0,3 µg/ml Puromysin für 1 Woche selektiert und der Knockout des Zielgens durch Immunoblotting verifiziert.

Luziferase-Assay

Zellen wurden mit pGL2-basic-CD47- oder pGL2-basic-CD47-ΔNF-kB- oder pGL2-NF-kB-Luziferase-Reportern transfiziert und die Luziferase-Aktivität wurde mit einem Luminometer (Promega, Madison, WI) gemessen. Zur Normalisierung der Reporter-Transfektionseffizienz wurde die Gesamtproteinkonzentration von Lysaten mit dem BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL) mit BSA als Standard gemessen.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Assay

Zellen wurden 10 min mit Formaldehyd (1% final) vernetzt, mit eiskaltem PBS gewaschen und in SDS-Lysepuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8) gesammelt. 1). Chromatin wurde durch Ultraschall geschert, mit Protein-G-konjugierten Agarosekügelchen vorgereinigt und mit Anti-p65, Anti-c-Rel oder normalem IgG bei 4 C über Nacht inkubiert. Nach Zugabe von Protein G für 2 h bei 4°C wurde der Komplex sequentiell mit salzarmen und salzreichen Immunkomplexwaschpuffern gewaschen (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.1 plus 150 mM NaCl für salzarme und 500 mM NaCl für salzreiche Puffer) gefolgt von TE-Puffer (zweimal). Die DNA-Transkriptionsfaktor-Interaktion wurde nach Zugabe von NaCl und Inkubation bei 65 °C über Nacht umgekehrt. Nach RNase A- und Proteinase K-Aufschluss wurden DNA-Fragmente durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt. DNAs wurden gereinigt und für die PCR mit Primern verwendet, die spezifisch für die Genpromotorregion sind, die NF-kB-Bindungsstellen umfasst. Die CD47-Primer waren:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. Monoklonale Ratten-Anti-Maus-CD47-IgG2a-Antikörper (MIAP301) und Hybridom wurden von Dr. William Frazier (Washington University School of Medicine) erhalten. Beide Hybridomzelllinien wurden in IMDM-Medium mit 20% FBS gehalten. Antikörper wurden aus Hybridoma-Überstand unter Verwendung von Protein-G-Harz von GenScript (Katalog # L00209) nach Herstellungs-Standardverfahren gereinigt. Die Proben wurden dann 10-20-fach mit mikroseptischen Geräten von Pall Life Sciences weiter konzentriert. Konzentrationen von gereinigtem IgG wurden durch Messung der Extinktion bei OD280 bestimmt.

Phagozytose-Assay

Sowohl humane Monozyten-THP1-Zellen als auch Maus-Mφ RAW 264.7-Zellen (ATCC, TIB-71) wurden in einem 5% igen CO2-Inkubator bei 37 ° C gehalten 66 bei einer ungefähren Dichte von 1 × 106 / ml. Etwa 0,8 × 106 Zellen/ml ROHE 264,5 Zellen oder 1 ×106 THP1-Zellen wurden auf eine 6-Well-Platte ausgesät. Nach 24 h Inkubation wurden 264,7 Zellen durch Behandlung mit 0,1 µg/ml Lipopolysaccharid (LPS) für 24 h aktiviert. Monozyten-THP1-Zellen wurden durch Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) (40 nM) für 48 h aktiviert. Aktivierte Makrophagen wurden mit Dio bei Endkonzertation 40 nM in einem Medium für 20 min angefärbt, gefolgt von dreimaligem Spülen mit Medium. Krebszellen wurden mit 1 µM DDAO (5 mM Stammlösung in DMSO bei -20°C gelagert) in PBS bei 37°C für 15 min markiert und mit PBS mit 1% FBS gewaschen. DDAO-markierte Zielzellen (1 × 106) wurden zu DIO-gefärbten Mφs gegeben und in einem Endvolumen von 2 ml bei 37 °C für 2 h inkubiert. Die Phagozytose wurde beurteilt, indem die dual-markierten Zellen (DIO + / DDAO +), die phagozytierte Brustkrebszellen durch reife Mφs darstellen, mittels Durchflusszytometrie bewertet wurden. Zur Analyse wurde die Software FlowJo verwendet.

Klonogener Überlebensassay

Der klonogene Überlebensassay wurde nach Bestrahlung mit oder ohne Behandlung durchgeführt (Lapatinib, 10 µM für 72 h; Anti-CD47-Antikörper 10 µg/ ml über Nacht). Die behandelten Zellen wurden 10-14 Tage kultiviert und Kolonien fixiert, gefärbt mit Coomassie-Blaufärbung. Kolonien, die mehr als 50 Zellen enthielten, wurden als überlebende Klone gezählt und auf die Plattierungseffizienz jeder mit Schein behandelten Tumorzelllinie normalisiert.

Gap-Filling Rate Assay

Die Gap-Filling-Kapazität wurde mit 1 × 106 Zellen gemessen, die in jeder der 6-Well-Platten auf 100% Konfluenz gezüchtet wurden, gefolgt von 24 h Zellmangel. Dann wurde der Spalt durch diagonales Abkratzen der Schale mit einer sterilen Pipettenspitze erzeugt. Die Zellen wurden entweder unbehandelt gelassen oder während der Versuchsdauer mit 10 µg/ml IgG oder Anti-CD47-Antikörper behandelt. Die Füllkapazität wurde für 72 h überwacht und repräsentative Bilder wurden an Tag 0 (Tag des Schabens) und Tag 3 aufgenommen.

Tumorsphärenbildung

Zellen wurden mit 40 µm Zellsieben gesiebt (Katalog #352340. Corning) und Einzelzellsuspensionen wurden mit einer Dichte von 1000 Zellen/ml in niedermolekulare 60-mm-Petrischalen ausgesät. Die Zellen wurden in serumfreiem Mamma-Epithel-Basalmedium (MEBM) gezüchtet, ergänzt mit B27 (Katalog #17504-044. Life Technology), 20 ng/ml EGF (Katalog # 4022-500. Bio-Vision), 20 ng/ml basic-FGF (Katalog # 13256-029. Invitrogen) und 4 µg/ml Heparin (Katalog # 80603-686 EMD MILLIPORE). Die Zellen wurden für 10 Tage kultiviert und Tumorsphären wurden unter Lichtmikroskopie gezählt.

Transwell Invasion assay

Aliquoten (0. 4 ml) Matrigel (Katalog # 356231. BD Biosciences) wurden in Beschichtungspuffer: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl auf die Endkonzentration von 200-300 µg/ml verdünnt. Etwa 100 µl wurden in die obere Kammer von 24-Well Transwell (Katalog # 3422. Costar) und bei 37°C zur Gelierung ca. 1 h inkubiert. Entfernen Sie vorsichtig den verbleibenden Beschichtungspuffer von der durchlässigen Trägermembran, ohne die Schicht zu stören, und fügen Sie dann Zellen hinzu (2,5 × 104 / ml). Die untere Kammer wurde mit 800 µl MEM-Medien gefüllt, die 5 µg / ml Fibronektin enthielten (Katalog # SC-29011. Santa Cruz). Der Transwell mit unterschiedlich behandelten Zellen wurde 48 h inkubiert und mit Diff-Quick Stain Kit (Katalog #K7128. IN: IMEB INC.

Herstellung von F (ab‘)2-Fragmenten

CD47 F (ab‘)2-Fragmente wurden durch Papainharzspaltung von IgG unter Verwendung eines F (ab‘)2-Präparationskits hergestellt (Katalog # 786272. G-Bioscience) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und dem gemeldeten Verfahren67. Nach dem Papainverdau wurde das Fab-Fragment von unverdautem IgG getrennt und die Fc-Region mit der Protein-A-Spinsäule aus dem Fab-Fragmentierungskit Die SpinOUT-GT-600-Entsalzungssäulen wurden zugeführt, um sicherzustellen, dass die anfängliche Antikörperprobe die optimale Bedingung für die Fab-Fragmentierung war, und das gereinigte Anti-Maus-CD47-IgG wurde für die In-vivo-Maus-Tumorbehandlung gesammelt.

Bestrahlung von BC-Zellen mit CRISPR-KO CD47 und/oder HER2

Zum in vivo Test der Tumorhemmung Wirksamkeit durch Bestrahlung mit mangelhaftem CD47 und HER2 Status wurden 5 × 105 4T1/C2 Zellen mit CRISPR−Knockout von CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) oder Doppel (CD47−/−/HER2−/-) in die Brustfettpolster von BALB/c implantiert (n = 6 pro Gruppe). Das Tumorwachstum wurde durch Messen des Tumorvolumens beurteilt alle 2 Tage ab Tag 7 bis das Tumorvolumen die Grenze erreichte. Um die Strahlenempfindlichkeit von Tumoren mit unterschiedlichem Status von CD47 und HER2 zu beurteilen, wurde jedem Tumor am Tag 9 lokale Tumorstrahlung mit 5 Gy zugeführt und das Tumorwachstum wurde jeden zweiten Tag gemessen, bis die Kontrolltumoren die maximale Begrenzung erreichten.

RT von Maus-BC mit Anti-CD47- und / oder HER2-Behandlung

Für In-vivo-Tests der Tumorhemmung mit einem einzelnen CD47-Antikörper in Gegenwart oder Abwesenheit einer Strahlentherapie folgte die Anti-CD47-Behandlung dem Protokoll von Willingham et al20 mit einigen Modifikationen. Acht Wochen alten immunkompetenten (BALB/ c) weiblichen Mäusen (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) wurden 1 × 105 Maus-Brust-4T1-Zellen in die 4. Brustdrüse injiziert. Fünfzig Mikroliter PBS, die 100 µg Kontroll-IgG oder Anti-CD47 F (ab‘) -Fragmente enthielten, wurden in die Tumorstelle (Tag 1) oder in das Tumorgewebe (Tag 15) injiziert und jeden zweiten Tag bis zum Ende der Experimente wiederholt. Das Tumorvolumen wurde alle 5 Tage überwacht. Zur Strahlenbehandlung, Anti-CD47 oder Bestrahlung in Kombination mit Anti-CD47 wurden die Tiere mit 4T1-Tumoren zufällig in verschiedene Behandlungsgruppen und eine Kontrollgruppe (5-10 Mäuse pro Gruppe) eingeteilt. Die lokale Tumorbestrahlung begann, wenn das Tumorvolumen 200 mm3 mit FIR erreichte (5 Gy / Tag / Tumor für vier Fraktionen unter Verwendung einer Mikrostrahl-IR-Quelle; Gesamtdosis = 20 Gy), kombiniert mit dreimaligen Tumorinjektionen von Anti-CD47 F (ab‘). Die Strahlenempfindlichkeit der in vivo bestrahlten Tumoren mit der Anwesenheit oder Abwesenheit von Anti-CD47 F (ab‘) wurde durch Messung des Tumorvolumens am Ende der Experimente bewertet. Die Tiere wurden eingeschläfert, wenn die Tumore ~ 1400 mm3 groß waren oder wenn die Tiere sich unwohl fühlten, selbst wenn der Tumor kleiner als 1400 mm3 war, um den UCD IACUC-Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren in der Forschung zu entsprechen. Das Tiernutzungs- und Pflegeprotokoll der In-vivo-Strahlentherapie wurde vom Institutional Animal Use and Care Committee der University of California Davis (IACUC 15315) genehmigt.Für In-vivo-Tests der Tumorhemmung mit dualen Antikörpern gegen CD47 und HER2 in Gegenwart oder Abwesenheit einer Strahlentherapie wurden acht Wochen alten immunkompetenten (BALB / c) weiblichen Mäusen (Charles River Laboratories, Sacramento, USA) 1 × 105 Mausbrust-4T1-Zellen in die 4. Brustdrüse injiziert Drüsen. Als das Tumorvolumen etwa 200 mm3 erreichte, wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt (6 Mäuse pro Gruppe). PBS-, IgG-, Anti-CD47 F (ab‘) -Fragmente (100 µg) oder Herceptin (5 mg / kg) wurden 4 h vor der lokalen Strahlentherapie (5 Gy pro Tag für 2 Tage) in Tumorgewebe injiziert. Injektionen wurden durchgeführt und Tumorgrößen wurden jeden zweiten Tag bis zum Ende der Experimente überwacht. Mäuse wurden eingeschläfert, wenn die Tumore ~ 1400 mm3 groß waren oder wenn die Tiere sich unwohl fühlten, selbst wenn der Tumor kleiner als 1400 mm3 war, um den UCD IACUC-Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren in der Forschung zu entsprechen. Das Tiernutzungs- und Pflegeprotokoll der In-vivo-Strahlentherapie wurde vom Institutional Animal Use and Care Committee der University of California Davis (IACUC 15315) genehmigt.

Tumorinfiltrierte Makrophagen und Makrophagen-Phagozytose

GFP-exprimierende Maus-Brustkrebs-4T1-Zellen wurden in 4. Brustfettpolster von BALB / c-Mäusen implantiert und die Behandlung wurde begonnen, wenn Tumore etwa 200 mm3 erreichten, indem dreimal täglich 50 µl PBS mit 100 µg Kontroll-IgG, Anti-CD47 F (ab‘) -Fragmenten, Herceptin oder beiden Antikörpern injiziert wurden. Tumorlokale RT wurde an den Tagen 10 und 11 mit 5 Gy / Tag / Tumor für zwei Fraktionen, Gesamtdosis = 10 Gy, abgegeben und Experimente wurden 2 Tage nach Beendigung der Antikörperbehandlungen beendet. Tumore wurden extrahiert und FFPE-Schnitte wurden für die Immunfluoreszenzfärbung vorbereitet, um dem Standardverfahren zu folgen: Die Objektträger wurden deparaffiniert und rehydriert, und Antigene wurden für 40 min in einem Citratpuffer (pH 6,1) bei 95 ° C entnommen. Um die Autofluoreszenz zu entfernen, wurden die Objektträger bei RT für 48 h in De-Autofluoreszenz-Lösung (0,5 M CuSO4, 0,05 M NH4COOH in H2O) gesockt, 5 min 3 mal mit Wasser gespült und dann mit 1: 100 pferdeserum. Die Primärantikörperinkubation erfolgte bei 4°C über Nacht: Anti-GFP (1:100; Dako), Anti-CD11b (1:100; Millipore); Nach dem Waschen wurden Objektträger mit 1:250 verdünnten fluoreszierenden konjugierten Sekundärantikörpern (Rhodamin für CD11b, Alexa Fluor 488 für GFP) bei RT für 1 h inkubiert und anschließend mit Vectashield Antifade Lösung enthaltend DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) montiert. Makrophagen-vermittelte Phagozytose wurde mit Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung der Axiovision-Software (Zeiss, Deutschland) nachgewiesen und Mikrofotographien wurden mit ImageJ quantifiziert.

Statistische Analyse

Alle experimentellen Daten aus In-vitro-Zellstudien und Tierversuchen werden als Mittelwert ± SE dargestellt und mit dem Two-Tailed Student t-Test für zwei Gruppen oder ANOVA für mehrere Gruppen analysiert. Die statistische Signifikanz der Kaplan-Meier-Überlebenskurven wurde mit einem Mann–Whitney-Test bewertet. Die Anzahl der unabhängigen Experimente und die Replikate wurden in der Abbildung unten angegeben. P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen und sind wie folgt durch Sternchen gekennzeichnet: *P < 0.05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

Berichtszusammenfassung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.