Beschreibung
Thermo Scientific Pierce Ellman’s Reagenz (DTNB) reagiert mit Sulfhydrylgruppen zu einem gefärbten Produkt und bietet eine zuverlässige Methode zur Messung reduzierter Cysteine und anderer freier Sulfhydryle in Lösung.Ellmans Reagenz (5,5′-Dithio-bis-) wird verwendet, um Sulfhydrylgruppen in einer Probe durch Vergleich mit einer Standardkurve einer sulfhydrylhaltigen Verbindung wie Cystein abzuschätzen. Alternativ können Sulfhydrylgruppen unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von TNB (14.150 M-1 cm-1 bei 412 nm) untersucht werden. Ellmans Reagenz wurde für andere Anwendungen als die Sulfhydrylschätzung verwendet, z. B. zur Bestimmung von Alkylthiolen durch HPLC unter Verwendung eines Vorsäulenderivatisierungsverfahrens und zur Untersuchung von Thiolen im aktiven Zentrum mehrerer Enzyme.
Merkmale von Ellmans Reagenz:
* Sulfhydryl-Assay – reagiert quantitativ mit freien (reduzierten) Sulfhydrylgruppen (—SH), um nachweisbares TNB-Produkt zu erhalten
• Kolorimetrischer Nachweis – farbiges Produkt ermöglicht spektrophotometrische Messung in Küvetten oder Mikroplatten (λmax = 412 nm; ε = 14,150 / M·cm)
• Bewährte Methode — Eine gut charakterisierte Chemie ermöglicht die Quantifizierung von Peptid- oder Proteinsulfhydrylgruppen unter Verwendung der Berechnung des Extinktionskoeffizienten oder durch Vergleich mit einem Cysteinstandard
Reagenseigenschaften
• Alternative Namen: DTNB, Ellman’s Reagenz
• Chemischer Name: 5,5′-dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure)
• Reaktiv gegenüber: Sulfhydrylgruppen (—SH)
• Chemische Formel: C14H8N2O8S2
• CAS-Nummer: 69-78-3
• Molekulargewicht: 396,35
• Form: Gelbes kristallines Pulver
DTNB reagiert mit einer freien Sulfhydrylgruppe zu einem gemischten Disulfid und 2-Nitro-5-Thiobenzoesäure (TNB). Das Ziel von DTNB in dieser Reaktion ist die konjugierte Base (R—S-) einer freien Sulfhydrylgruppe. Daher hängt die Geschwindigkeit dieser Reaktion von mehreren Faktoren ab: (1) dem Reaktions-pH-Wert, (2) dem pKa‘ des Sulfhydrylsund (3) sterischen und elektrostatischen Effekten. TNB ist die farbige Spezies, die in dieser Reaktion erzeugt wird und einen hohen molaren Extinktionskoeffizienten im sichtbaren Bereich aufweist. Der molare Extinktionskoeffizient von TNB wurde ursprünglich von Ellman (1959) mit 13.600 M-1 cm-1 bei 412 nm und pH 8,0 angegeben. Folglich wurde dieser Wert in der Literatur häufig zitiert. Spätere Studien haben jedoch gezeigt, dass der molare Extinktionskoeffizient durch einen Wert von 14.150M-1 cm-1 bei 412 nm genauer reflektiert wird. Die Extinktion von TNB wird durch Änderungen des pH-Werts zwischen 7,6 und 8,6 nicht beeinflusst. Die Extinktion von TNB ist jedoch in anderen Lösungsmitteln unterschiedlich.