Einzelmolekül-Echtzeitsequenzierung

Pacific Biosciences (PacBio) kommerzialisierte die SMRT-Sequenzierung im Jahr 2011, nachdem Ende 2010 eine Beta-Version seines RS-Instruments veröffentlicht worden war.

RS und RS IIEdit

SMRT-Zelle für einen RS- oder RS II-Sequenzer

Bei Kommerzialisierung hatte die Leselänge eine Normalverteilung mit einem Mittelwert von etwa 1100 Basen. Ein neues Chemie-Kit, das Anfang 2012 veröffentlicht wurde, erhöhte die Leselänge des Sequenzers; ein früher Kunde der Chemie zitierte mittlere Leselängen von 2500 bis 2900 Basen.

Das Ende 2012 veröffentlichte XL Chemistry Kit erhöhte die durchschnittliche Leselänge auf mehr als 4300 Basen.

Am 21.August 2013 veröffentlichte PacBio das neue DNA Polymerase Binding Kit P4. Dieses P4-Enzym hat durchschnittliche Leselängen von mehr als 4.300 Basen in Kombination mit der C2-Sequenzierchemie und mehr als 5.000 Basen in Kombination mit der XL-Chemie. Die Genauigkeit des Enzyms ist ähnlich wie bei C2 und erreicht QV50 zwischen 30X und 40X Abdeckung. Die resultierenden P4-Attribute lieferten qualitativ hochwertigere Baugruppen mit weniger SMRT-Zellen und verbesserten Variantenaufrufen. In Verbindung mit der Auswahl der Eingangs-DNA-Größe (unter Verwendung eines Elektrophoreseinstruments wie BluePippin) ergibt sich eine durchschnittliche Leselänge über 7 Kilobasen.

Am 3. Oktober 2013 veröffentlichte PacBio eine neue Reagenzkombination für PacBio RS II, die P5-DNA-Polymerase mit C3-Chemie (P5-C3). Zusammen verlängern sie die Sequenzierungsleselängen auf durchschnittlich etwa 8.500 Basen, wobei die längsten Lesevorgänge 30.000 Basen überschreiten. Der Durchsatz pro SMRT-Zelle beträgt rund 500 Millionen Basen, wie Sequenzierungsergebnisse aus der CHM1-Zelllinie zeigen.

Am 15. Oktober 2014 gab PacBio die Veröffentlichung der neuen Chemie P6-C4 für das RS II-System bekannt, das die 6. Generation der Polymerase und die 4. Generation der Chemie des Unternehmens darstellt und die durchschnittliche Leselänge weiter auf 10.000 – 15.000 Basen verlängert, wobei die längsten Lesevorgänge 40.000 Basen überschreiten. Der Durchsatz mit der neuen Chemie sollte zwischen 500 Millionen und 1 Milliarde Basen pro SMRT-Zelle liegen, abhängig von der zu sequenzierenden Probe. Dies war die endgültige Version der Chemie, die für das RS-Instrument veröffentlicht wurde.

Der Durchsatz pro Experiment für die Technologie wird sowohl von der Leselänge der sequenzierten DNA-Moleküle als auch vom Gesamtmultiplex einer SMRT-Zelle beeinflusst. Der Prototyp der SMRT-Zelle enthielt etwa 3000 ZMW-Löcher, die eine parallelisierte DNA-Sequenzierung ermöglichten. Bei der Kommerzialisierung wurden die SMRT-Zellen jeweils mit 150.000 ZMW-Löchern strukturiert, die in zwei Sätzen von 75.000 gelesen wurden. Im April 2013 veröffentlichte das Unternehmen eine neue Version des Sequenzers namens „PacBio RS II“, die alle 150.000 ZMW-Löcher gleichzeitig verwendet und den Durchsatz pro Experiment verdoppelt. Der Modus mit dem höchsten Durchsatz im November 2013 verwendete P5-Bindung, C3-Chemie, Auswahl der BluePippin-Größe, und ein PacBio RS II ergab offiziell 350 Millionen Basen pro SMRT-Zelle, obwohl ein menschlicher de-novo-Datensatz veröffentlicht wurde, wobei die Chemie durchschnittlich 500 Millionen Basen pro SMRT-Zelle betrug. Der Durchsatz variiert je nach Art der zu sequenzierenden Probe. Mit der Einführung der P6-C4-Chemie stieg der typische Durchsatz pro SMRT-Zelle auf 500 Millionen Basen auf 1 Milliarde Basen.

SequelEdit

SMRT-Zelle für einen Sequenzer Sequenzer

Im September 2015 kündigte das Unternehmen die Einführung eines neuen Sequenzierungsinstruments, das Sequel-System, an, das die Kapazität auf 1 Million ZMW-Löcher erhöhte.

Mit dem Sequel-Instrument waren die anfänglichen Leselängen vergleichbar mit dem RS, dann erhöhten spätere Chemie-Releases die Leselänge.

Am 23.Januar 2017 wurde die V2 Chemistry veröffentlicht. Es erhöhte durchschnittliche Leselängen zwischen 10.000 und 18.000 Basen.

Am 8. März 2018 wurde die Version 2.1 veröffentlicht. Es erhöhte die durchschnittliche Leselänge auf 20.000 Basen und die Hälfte aller Lesevorgänge über 30.000 Basen. Die Ausbeute pro SMRT-Zelle stieg auf 10 oder 20 Milliarden Basen, entweder für Bibliotheken mit großem Insert oder für Bibliotheken mit kürzerem Insert (z. B. Amplikon).

Pipettenspitze in einer 8M SMRT-Zelle

Am 19.September 2018 kündigte das Unternehmen die Sequel 6.0-Chemie mit einer durchschnittlichen Leselänge von 100.000 Basen für kürzere Insert-Bibliotheken und 30.000 für länger-Bibliotheken einfügen. SMRT-Zellausbeute erhöht bis zu 50 Milliarden Basen für kürzere Insert-Bibliotheken.

8M ChipEdit

Im April 2019 veröffentlichte das Unternehmen eine neue SMRT-Zelle mit acht Millionen ZMWs, wodurch der erwartete Durchsatz pro SMRT-Zelle um den Faktor acht erhöht wurde. Early Access-Kunden berichteten im März 2019 über einen Durchsatz von über 58 Kundenlaufzellen mit einer Rohausbeute von 250 GB pro Zelle mit Vorlagen mit einer Länge von etwa 15 KB und einer Ausbeute von 67,4 GB pro Zelle mit Vorlagen in Molekülen mit höherem Gewicht. Die Systemleistung wird jetzt entweder in kontinuierlichen langen Lesevorgängen mit hohem Molekulargewicht oder in vorkorrigierten HiFi-Lesevorgängen (auch als Circular Consensus Sequence (CCS) bezeichnet) angegeben. Bei Lesevorgängen mit hohem Molekulargewicht ist etwa die Hälfte aller Lesevorgänge länger als 50 kb.

Die HiFi leistung umfasst korrigiert basen mit qualität über Phred punktzahl Q20, mit wiederholt amplicon geht für korrektur. Diese nehmen Amplikons mit einer Länge von bis zu 20 KB auf.