Encephalitozoon cuniculi Stamm III ist eine Ursache für Encephalitozoonose bei Mensch und Hund

Abstract

Mikrosporidien sind obligate intrazelluläre eukaryotische Organismen, die in einer Vielzahl von Wirten von Wirbeltieren und Wirbellosen vorkommen. Encephalitozoon cuniculi kommt häufig bei Hauskaninchen und Nagetieren vor und tritt auch bei Hunden, anderen Caniden und Primaten, einschließlich Menschen, auf. Die DNA-Sequenzierung der ribosomalen RNA-Gene wurde verwendet, um diese Parasiten auf Speziesebene zu identifizieren und die E. cuniculi-Stämme I, II und III. Acht neue Hundeisolate wurden unter Verwendung molekularer Methoden als E. cuniculi-Stamm III charakterisiert. Dieser Stamm wurde auch in Isolaten von immungeschwächten Menschen identifiziert, was auf das zoonotische Potenzial dieser Parasitenart hindeutet. Es wird auch über eine verlängerte mikrosporidische Sporenabgabe von asymptomatischen Hunden berichtet.

Encephalitozoon cuniculi ist ein obligates intrazelluläres Protozoon des Stammes Microspora und ein häufiger Parasit von Hauskaninchen und Nagetieren. Gelegentlich wurden diese Parasiten bei anderen Wirten berichtet, einschließlich Hunden, Blaufüchsen (Alopex lagopus) und einer kleinen Anzahl anderer wilder Fleischfresser . Immer mehr Berichte beschreiben auch klinische Erkrankungen beim Menschen, die durch E. cuniculi verursacht werden, aber die Quelle (n) der menschlichen Infektion ist unbekannt .

Historisch gesehen basierte die Identität von Parasiten auf morphologischen und manchmal ultrastrukturellen Eigenschaften. Vor kurzem, morphologisch ähnliche Mitglieder der Gattung Encephalitozoon wurden unter Verwendung immunologischer Merkmale und molekularer Charakterisierung der ribosomalen RNA-Gene spezifiziert . Isolate von E. cuniculi wurden weiter als Stämme I, II oder III unterteilt, basierend auf der Anzahl der Wiederholungen einer 4-Basen-Sequenz (5′-GTTT-3′) in der internen transkribierten Spacer (ITS) -Region des ribosomalen RNA-Gens . Zwei dog E. cuniculi Isolate wurden aufgrund der Anwesenheit von 4 Sequenzwiederholungen als Stamm III bezeichnet. Anschließend wurden ⩾4 humane Isolate in zwei Berichten aus Europa als Stamm III (Isolate „Donovan“ GenBank X98466, CDC: V282 und IPZ: MX-H5) und als Stamm I identifiziert. Diese Studie erweitert diese Arbeit durch die Identifizierung von 8 zusätzlichen Hundeisolaten von E. cuniculi aus 4 Ausbrüchen als Stamm III. Obwohl keine epidemiologischen Daten die Übertragung von Hund zu Mensch direkt bestätigt haben, legen molekulare Daten nahe, dass Hunde als potenzielle Reservoire für Parasiten dienen können. Darüber hinaus wurde die langfristige Ausscheidung von Sporen durch asymptomatische Hunde dokumentiert, was die Wahrscheinlichkeit einer zoonotischen Übertragung des Parasiten weiter erhöht.

Materialien und Methoden

Parasitenisolate

Die Körper von 7 Welpen aus 3 nicht verwandten Würfen und 1 Hund wurden über 18 Monate dem Texas Veterinary Diagnostic Laboratory zur postmortalen Bewertung vorgelegt. Die Tiere stammten aus vier unabhängigen Quellen aus verschiedenen Regionen von Texas. Die Diagnose Enzephalitozoonose wurde jeweils anhand histologischer Befunde gestellt. Acht Parasitenisolate wurden aus frischen Geweben der Tiere hergestellt: 5 Isolate wurden aus Gehirn- oder Nierengeweben von 5 bis 7 Wochen alten Boston Terrier Welpen Wurfgeschwistern (2 Rüden, 3 Hündinnen) gewonnen, die an neurologischen Erkrankungen starben (Isolate 1-5, Wurf 1). Isolat 6 wurde aus dem Gehirn eines 10 Wochen alten männlichen Malteser Terriers gewonnen, der 1 von 4 Wurfgeschwistern (Wurf 2) war, die an neurologischen Erkrankungen starben. Isolat 7 wurde aus dem Gehirn eines 10 Wochen alten weiblichen Zwergpudelwelpen (Wurf 3) gewonnen, der an einer neurologischen Erkrankung starb. Isolat 8 wurde aus der Niere eines 18 Monate alten weiblichen Miniaturdackels gewonnen, der an Nierenversagen starb (Tabelle 1).

postmortal wurden Gewebe aseptisch entnommen und homogenisiert (Ten Broeck tissue homogenizer; Corning, Corning, NY) unter Verwendung von PBS, pH 7.2, plus 2 × antibiotisch-antimykotische Lösung (Gibco, Gaithersburg, MD). Mikrosporidische Sporen wurden aus Wirtsgewebehomogenat unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Percoll-Dichtegradientenmethode gereinigt, die durch Ändern der Zentrifugationsgeschwindigkeit auf 600 g modifiziert wurde. Die Mikrosporidien wurden in RK-13-Zellen (ATCC CCL-37) unter Verwendung von RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum und 2× Antibiotikum-Antimykotikum-Lösung (Gibco), wie zuvor beschrieben, gezüchtet. Parasitenkultur und DNA-Analyse wurden über mehrere Monate durchgeführt, basierend auf dem Erhalt der verschiedenen Fallproben, so dass die Möglichkeit einer versehentlichen Kreuzkontamination vernachlässigbar war.

DNA-Isolierung

Für die Isolate 1-6 und 8 wurden Parasiten in Kurzzeitkultur gezüchtet, um adäquate Sporen für die molekulare Charakterisierung zu erzeugen. Für Isolat 7 wurden Parasiten zur DNA-Isolierung direkt aus frischem Welpenhirngewebe gereinigt. Bei den meisten Isolaten wurde die DNA aus gereinigten Sporen unter Verwendung der Instagene Matrix (BioRad, Hercules, CA) gemäß dem Herstellerprotokoll für Bakterienkulturen extrahiert . Für einen Teil der molekularen Arbeit mit den Isolaten 6 und 8 wurden Sporen wie zuvor beschrieben verarbeitet, und DNA wurde aus Sporen durch eine Standard-Phenolchloroform-Extraktionsmethode unter Verwendung eines Partitionsgel-Mikrofugenröhrchensystems (Light Phase Lock Gel system; 5 Prime → 3 Prime Manufacturer, Westchester, PA) extrahiert, um die DNA-Rückgewinnung zu optimieren. Die DNA wurde in Ethanol gefällt, das Pellet in TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) resuspendiert und die DNA-Konzentration mittels A260:A280-Verhältnissen mittels UV-Spektrophotometrie (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ) abgeschätzt. DNA, die aus Gewebekultursporen von Encephalitozoon hellem extrahiert wurde, wurde als Positivkontrolle verwendet, und eine Nur-Reagenz-Negativkontrolle wurde in alle Extraktions- und Sequenzierungsreaktionen einbezogen.

DNA-Partialsequenzierung und Analyse des small subunit ribosomal DNA (SSU rRNA) Gens

Ein Teil des 5′ Endes des SSU rRNA Gens aus jedem der 8 Isolate wurde unter Verwendung des Primerpaares PMP1 und PMP2 amplifiziert, wie zuvor beschrieben. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) für jedes Isolat wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (GeneAmp PCR core Reagens, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). Die Verstärkung erfolgte in einem Thermocycler (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Nach anfänglicher Denaturierung für 5 min bei 95°C wurde zu jeder 25-µL-Reaktion Taq-Polymerase (0,5 U) zugegeben. Die Proben wurden dann 35 Zyklen Denaturierung (94 ° C, 30 s), Glühen (60 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 1 min) unterzogen, gefolgt von 10 min bei 72 ° C zur endgültigen Verlängerung. Nicht inkorporierte Nukleotide wurden mit Chromatographiesäulen (Micro Bio-Spin 30; BioRad) entfernt. Die Proben wurden bei 4 ° C gehalten, bis sie zur automatisierten Sequenzierung verarbeitet wurden.

DNA-Analyse der ITS-Region

Ein Teil der ITS-Region des ribosomalen RNA-Gens jedes Isolats wurde durch PCR mit dem Primerpaar int530f und int580r unter Verwendung der oben beschriebenen Amplifikationsmethoden amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt wurde in einem automatisierten DNA-Sequenzer (Modell 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems/Roche Molecular Systems, Branchburg) sequenziert.

DNA automatisierte Sequenzierung

PCR-amplifizierte DNA jedes Isolats wurde für die automatisierte Sequenz mit einem kommerziellen Kit (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit) amplifiziert; Promega, Madison, WI) nach den Anweisungen des Herstellers. Alle Reaktionen wurden in einem Thermocycler (MJ Research Minicycler) durchgeführt. Die Proben wurden dann 35 Zyklen Denaturierung (94 ° C, 30 s), Glühen (60 ° C, 30 s) und Verlängerung (72 ° C, 1 min) unterzogen, gefolgt von 10 min bei 72 ° C zur endgültigen Verlängerung. Die Produkte wurden mit Chromatographiesäulen (Micro Bio-Spin; BioRad) gereinigt, in einer Vakuumzentrifuge (Savant Instruments, Holbrook, NY) getrocknet und bei -20 ° C gelagert, bis sie in einem automatisierten Sequenzer (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems) sequenziert wurden.

Unter Verwendung einer Alignment-Software (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI) wurden Konsensussequenzen von ∼265 Basen für einen Teil des SSU-rRNA-Gens für jedes Parasitenisolat erhalten. Diese Sequenzen wurden auf Homologie mit zuvor gemeldeten Enzephalitozoon-Sequenzen in der NCBI-GenBank-Datenbank unter Verwendung einer einfachen BLASTN-Suche bewertet.

Doppelsträngiger DNA-Heteroduplex-Mobilitätsassay

DNA aus Isolat 6 wurde wie zuvor beschrieben durch PCR mit dem Primerpaar int530f und int580r amplifiziert. Die PCR-amplifizierten Produkte wurden auf die Erzeugung von Heteroduplexen und Homoduplexen unter Verwendung zuvor charakterisierter Isolate von E. cuniculi aus verschiedenen Wirten untersucht.

Ergebnisse

In Gewebekultur wurden insgesamt 8 Parasitenisolate aus 4 separaten klinischen Ausbrüchen nachgewiesen. Sowohl lichtmikroskopische Merkmale als auch In-vitro-Wachstumsmerkmale der Parasiten deuteten darauf hin, dass es sich um E. cuniculi handelte, einen Mikrosporidian, der zuvor sowohl bei Hunden als auch bei anderen Wirten berichtet worden war. Die partielle Sequenzierung des 5′-Endes des SSU-rRNA-Gens jedes Isolats (GenBank AF144246–AF144253) bestätigte die Identität der Parasiten als E. cuniculi, da alle Proben eine 100% ige Homologie mit zuvor veröffentlichten Sequenzen aufwiesen (GenBank L39107dEZORGOA, L17072 ¦ EZORGSMALL; X98470 ¦ ECDSSRR2).Die Heteroduplex-Analyse und Sequenzierung der ITS-Region des ribosomalen RNA-Gens charakterisierte alle Hundeisolate weiter als Stamm III und bestätigte frühere Berichte über subtile Variationen zwischen E. cuniculi-Isolaten von verschiedenen Nagetieren, Kaninchen und menschlichen Wirten. Abbildung 1 veranschaulicht die DNA-Homoduplexbildung zwischen dem caninen Isolat 6 und einem zuvor charakterisierten Stamm-III-Isolat sowie die Heteroduplexbildung zwischen Isolat 6 und den anderen E. cuniculi-Stämmen.

Diskussion

Die biologische Bedeutung mehrerer Stämme von E. cuniculi muss noch geklärt werden; Die Fähigkeit, zwischen Parasitenstämmen zu unterscheiden, kann jedoch ein Instrument zur Verfolgung von Infektionsquellen in epidemiologischen Studien darstellen. Unsere molekularen Daten, die 8 mikrosporidische Isolate von Hunden als E. cuniculi Stamm III identifizieren, stimmen mit einer früheren Studie überein, die 2 Hundeisolate als Stamm III klassifizierte . Kaninchen-, Maus- und Fuchsisolate wurden als Stämme I oder II gemeldet. Diese Daten deuten darauf hin, dass Stamm III überwiegend mit Hunden assoziiert sein könnte. Humane Isolate wurden in der westlichen Hemisphäre als Stamm III und in Europa als Stamm I identifiziert. Obwohl die Quelle(n) der menschlichen Exposition gegenüber E. cuniculi ist unbekannt, es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass Tiere als Infektionsreservoir dienen können, und es besteht die Möglichkeit einer zoonotischen Übertragung des Organismus zwischen Tieren und Menschen. Es ist eine interessante Möglichkeit, dass geografische und kulturelle Unterschiede im Besitz von Haustieren eine Rolle bei der Exposition des Menschen spielen können, da Hunde in den Vereinigten Staaten häufige Haustiere sind, während Kaninchen in der Schweiz und anderen europäischen Ländern häufig als Haustiere oder als Nahrung gehalten werden.

Die Untersuchung von Fäkal- und Urinproben der klinisch normalen Boston Terrier-Eltern und 1 Welpen aus Wurf 1 zeigte ⩾4 Monate nach dem Tod der Wurfgeschwister (Isolate 1-5; unveröffentlichte Daten) eine geringe Sporenausscheidung. Diese Beobachtung legt ferner einen möglichen Mechanismus für die direkte oder indirekte Übertragung der Parasiten von Hunden auf den Menschen durch die Kontamination lokalisierter Umgebungen mit Harn- und Stuhlausscheidungen von Hunden nahe. Obwohl keine epidemiologische Studie die Beziehung zwischen Haustierbesitz / Exposition und menschlichen Mikrosporidieninfektionen untersucht hat, wurde in einem einzigen Fall, in dem Kinder Welpen mit offener Enzephalitozoonose ausgesetzt waren, 1 von 3 Kindern serokonvertiert . Zusätzliche E. cuniculi-Isolate von verschiedenen Wirten müssen analysiert werden, um das Risiko der Aufrechterhaltung potenziell infizierter Haustiere in Haushalten von immungeschwächten Personen mit hohem Risiko für Mikrosporidieninfektionen weiter zu bewerten.

Danksagung

Wir danken den Texas Veterinary Medical Diagnostic Laboratory Pathologen Jay Hoffman, Joanne Mansell und Bruce Abbitt für die Bereitstellung von Hundegewebe für diese Studie.Ich habe mich sehr gefreut, als ich das Buch gelesen habe.

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