Experimentelle und therapeutische Medizin

Einführung

Bronchialasthma ist eine chronisch entzündliche Atemwegserkrankung, an der viele Entzündungszellen und Mediatoren beteiligt sind. T-Zellen, insbesondere T-Helfer (Th)1 und Th2. haben eine entscheidende Rolle bei Derinduktion von Atemwegsentzündungen bei Asthmatikern (1). Komplizierte Immunantworten sind in der Lage, Th1-Mangel und Th2-Hyperaktivität zu induzieren, was zu einem Th1 / Th2-Ungleichgewicht führt. Dieses Ungleichgewicht fördert die Immunglobulin (Ig) -Sekretion und sensibilisiert Mastozyten und Eosinophile über eine veränderte Zytokinsekretion und verursacht allergische Entzündungen und Hyper-Reaktionsfähigkeit der Atemwege (2,3).Interferon (IFN)-γ und Interleukin (IL)-4 sind typische Zytokine von TH1 bzw.

Bei Asthmapatienten wird eine anhaltende Atemwegsentzündung durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) ausgelöst, die verschiedene Allergene in ein Signal für T-Zellen integrieren und die nachfolgenden Immunantworten auslösen (4,5).Die Aktivierung von T-Zellen erfordert Signale, die über theTCR-Komplex und Cluster of Differentiation (CD)28 initiiert werden. Reife dendritische Zellen (mDCs) exprimieren hohe Spiegel der co-stimulierenden Moleküle CD80 und CD86, die das Signal liefern, das für die Aktivierung, Expansion und Differenzierung von T-Zellen durch Interaktion mit CD28 erforderlich ist (6). Frühere Studien haben gezeigt, dass die CD80- und CD86-Spiegel bei Patienten mit Asthma erhöht sind (7,8).

In früheren Studien, die asthmatische Modelle untersuchten, wurde gezeigt, dass mDCs die Th2-Polarisation induzieren, die IL-4-Sekretion hochregulieren, die IFN-γ-Produktion herunterregulieren und eine eosinophile Entzündung induzieren (9,10). Studien, die die Auswirkungen des Knockdowns von CD80 und CD86 in DCs auf die Differenzierung und Zytokinsekretion durch T-Helferzellen in Urinmodellen von Asthma untersuchen, fehlen jedoch.

In der vorliegenden Studie wurden co-stimulierende T-Zell-Aktivierungssignale durch die Unterdrückung der CD80- und Cd86molekülexpression auf DCs unter Verwendung von Small Interfering RNA (siRNA) blockiert, und die Auswirkungen von CD80- und CD86-Knockdown auf die Expressionsniveaus der Th1 / Th2-typischen Zytokine IFN-γ und IL-4 wurden bewertet. Daher wurde das Potenzial von CD80 und CD86 als Ziele für die Anwendung von RNA-Interferenz (RNAi) im therapeutischen Targeting von Asthma untersucht.

Materialien und Methoden

Tiere

Insgesamt 20 gesunde spezifisch-pathogenfreie gradeBALB/c Mäuse (6-8 Wochen; mittleres Gewicht, 18 ± 2 g) wurden von gekauftdas Zentrum für Versuchstiere der Sun Yat-Sen University(Guangzhou, China). Experimente wurden gemäß durchgeführtprotokolle, die vom Animal Studies Committee der Sun Yat-Senuniversität genehmigt wurden.

Asthmamodelle

Insgesamt 20 Mäuse wurden zufällig zwei Gruppen zugeordnet: i) der asthmatischen Gruppe und ii) der normalen Kontrolle group.In in der asthmatischen Gruppe wurde jede Maus gegenüber Ovalbumin sensibilisiert (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) intraperitoneal an den Tagen 1, 14 und 21 mit 100 µg Eizellen, die in 20 mg Alaun (Guangzhou Chemical Reagent Co., Guangzhou, China). Anschließend wurden die Mäuse an den Tagen 28-34 in luftdichten Behältern (mit Abmessungen von 50 × 50 × 50 cm) 30 Minuten / Tag einer Aerosolbelastung von 5% Eizellen ausgesetzt. In der normalen Kontrollgruppe wurden Mäuse wie oben mit einer äquivalenten Menge Kochsalzlösung anstelle der Eizellproteinlösung sensibilisiert und herausgefordert. Bei 24 h nach der Lastchallenge wurden Mäuse durch ein zugelassenes zervikales Dislokationsverfahren getötet, das von qualifiziertem und voll ausgebildetem Personal durchgeführt wurde. Thelungen wurden entfernt und dann in 10% Ethanol für 24 h fixiert.Proben wurden dehydratisiert, in Paraffin eingebettet und wie zuvor beschrieben mit Chromatoxylin und Eosin gefärbt (11). Pathologische Veränderungen im Bronchial- und Lungengewebe wurden unter einem Nikon Eclipse Ti Lichtmikroskop (Nikon Corporation, Tokio, Japan) untersucht.

Trennung von Knochenmark-derivedDCs

Alle Mäuse wurden durch zervikale Dislokation 24h nach der letzten Herausforderung geopfert. Knochenmark wurde mit RPMI-1640-Kulturmedium (Gibco; ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Nach einer Zentrifugation bei 250×g für 5 min wurden die Zellen mit Erythrozyten-Lysepuffer (CWBio Co., Ltd., Peking, China), gewaschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), zentrifugiert bei 250 × gfür 5 min und kultiviert in RPMI-1640, ergänzt mit rekombinantem Maus-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (rmGM-CSF; Peprotech, Inc., Rocky Hill, NJ, USA; 10 ng/ml) und rmIL-4 (Peprotech; 10 ng/ml) verwendet. Nach 6 Tagen Kultur wurde 1µg/ml Lipopolysaccharid (LPS; Sigma-Aldrich) zugegeben und thenon-adhärente mDCs wurden am Tag 7 geerntet. DCs wurden bei 4 ° C angefärbtfür 30 min mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugiertem Hamster Anti-CD11c (5 µg / ml; 11-0114), Phycoerythrin (PE) -konjugiertem Hamster Anti-CD80 (5 µg / ml; 12-0801), FITC-konjugiertem Ratten Anti-CD86 (5 µg / ml; 11-0862) und PE-konjugierter Ratte Anti-majorhistocompatibility komplex (MHC) II (5 µg/ml; 12-5322; alleBioscience, Inc., San Diego, CA, USA) monoklonale Antikörper und wurden anschließend durchflusszytometrisch (BD FACS) analysiert.; BDBiosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), um die positive Expressionsrate der markierten Antigenexpression zu bestimmen.

siRNA und Transfektion

Die spezifischen siRNA-Sequenzen (Tabelle I), die auf CD80 und CD86 abzielen, wurden nach den Methoden von Gu et al(12) entworfen und ausgewählt. Alle siRNA wurde von Shanghai GenePharma Co. gekauft., Ltd. (Shanghai, China). Der Transfektionsschritt wurde gemäß dem Herstellerprotokoll für Lipofectamin 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.).Kurz gesagt, DCs wurden am Tag vor der Transfektion in einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit einer Dichte von 1 × 105 Zellen / Well kultiviert. Zur Herstellung von Lipid-siRNA-Komplexen wurden 3 µl Lipofectamin 2000 in 50 µl Opti-MEM (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.)bei Raumtemperatur für 5 min, und 12 µl der angegebenen siRNA wurden gleichzeitig mit 50 µl Opti-MEM kombiniert. Das verdünnte Lipofectamin 2000 und siRNA wurden anschließend gemischt und zur Komplexbildung weitere 20 min bei Raumtemperatur inkubiert.Anschließend wurde der Komplex mit dem DCs in einer 24-Wellplate bei 37 °C in einer 5% igen befeuchteten CO2 in Luftatmosphäre für 6 h inkubiert. Bei der Cotransfektion wurden äquivalente Mengen an CD80 siRNA: Lipofectamine 2000 und CD86 siRNA: Lipofectamine 2000komplexen zu jeder Vertiefung gegeben. FAM-Scrambled-siRNA wurde als Negativkontrolle verwendet, um die Transfektionseffizienz zu bestimmen. Drei Gruppen transfizierter DCs wurden etabliert: In Der Nicht-siRNA-Gruppe wurde nur Lipofectamin 2000 hinzugefügt, ohne dass IRNA zu den DCs hinzugefügt wurde. In der siRNA-Gruppe wurden mDCs durch CD80- und CD86-spezifische siRNA übertragen. In der negativesiRNA-Gruppe wurden mDCs durch unspezifische Non-targetingFAM-siRNA transfiziert, die keine Homologie mit den Ziel-RNAs aufweist.Die Experimente wurden für jede Probe in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.Die Transfektionseffizienz wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (Nikon Eclipse Ti, Nikon Corporation) bestimmt und durch Fluoreszenzzytometrie nachgewiesen.

Reverse Transkription-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Zur Auswertung der CD80- und CD86-mRNA-Expressionsniveaunach Transfektion wurde RT-qPCR durchgeführt. Primersequenzen (Tabelle II) wurden nach GenBank entworfen und von DaAn Gene Co. synthetisiert., Ltd. der Sun Yat-Senuniversität (Guangzhou, China). Bei 24 h nach der Transfektion wurde die totalRNA von 1 × 106 DCs mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) und reverse transkribiert und mit QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) in einem Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) verstärkt. Die Amplifikationen wurden nach dem Herstellerprotokoll für das QuantiTect SYBR Green RT-PCRkit (Takala, Japan) durchgeführt. Amplifikationsbedingungen waren 40 Zyklen von 93 ° C für 3 Minuten, 93 ° C für 30 Sekunden, 55 ° C für 45 Sekunden und 72 ° C für 45 Sekunden. Jede Probe wurde in jede der drei Vertiefungen verabreicht. Relativegene expression levels were calculated using the quantificationcycle (Cq) method with normalization to glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) as the reference gene using 2−∆∆Cq(13).

Durchflusszytometrie

Zum Nachweis der positiven Expressionsraten von CD80 undCD86 auf dem DCs nach der Transfektion wurde eine Durchflusszytometrie am MHC II / CD11c-Gate für CD80 und CD86 durchgeführt. Sechs Stunden nach der Transfektion wurden DCs zweimal mit PBS gewaschen und mit fluoreszenzmarkiertem Antikörper bei 4°C für 30 min inkubiert.Anschließend wurden die Zellen erneut mit PBS gewaschen und mit 10 g/l Paraformaldehyd fixiert. Die folgenden monoklonalen Anti-Maus-Antikörper wurden verwendet: PE-anti-MHC II, FITC-anti-CD11c, PE-anti-CD80 und FITC-anti-CD86, wie oben erwähnt. Alle flowzytometrischen Analysen wurden mit isotypischen IgG-Kontrollen durchgeführt.

T-Zell-Separation

Milzen wurden entfernt, nachdem die Mäuse durch zervikale Dislokation eingeschläfert worden waren. T-Zellen wurden unter Verwendung eines Maus-Lymphozyten-Trennmediums gemäß dem Herstellerprotokoll (Dakewe Biotech Co., Ltd., Chinesisch). Die Zelldichte wurde vor der Weiterverarbeitung auf 1×109/l eingestellt.

Gemischte Lymphozytenreaktion (MLR)

Die asthmatischen murinen Knochenmark-abgeleiteten DCs(1 ×104 / Well) und gesunden T-Zellen (1×105 / well) wurden in 96-Well-Platten im Verhältnis 1:10 kokultiviert. Die Co-Kultursysteme wurden in drei Gruppen eingeteilt: i) Die Nicht-siRNA-Gruppe, ii) die siRNA-Gruppe und iii) die negative siRNA-Gruppe mit DCs aus den entsprechenden Gruppen, wie oben beschrieben. Als nächstes wurden Eizellen zu jeder Vertiefung zu einer Endkonzentration von 10 mg / l in einem Gesamtvolumen von 200 µl gegeben. Die Zellen wurden bei 37°C in einer 5%igen befeuchteten CO2 Inluftatmosphäre für 72 h inkubiert.

Enzyme-linked immunosorbent Assays(ELISAs)

Nach 3 Tagen Co-Kultur wurde der Überstand gesammelt. Die IFN-γ- und IL-4-Spiegel wurden mit ELISA-Kits analysiert, die für IFN-γ und IL-4 spezifisch sind (Dakewe Biotech Co., Ltd.) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Extinktionswerte wurden bei 450 nm mit einem Multiskan MK3 (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Statistische Analyse

Statistische Analysen wurden mit SPSSsoftware, Version 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, ILLINOIS, Vereinigte Staaten). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Untersuchungen werecarried in dreifacher Ausfertigung für jede Maus. Statistische Vergleiche zwischen Gruppen wurden unter Verwendung einer Einweganalyse der Varianz durchgeführt, und Vergleiche innerhalb einer Gruppe wurden unter Verwendung des Student’st-Tests durchgeführt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden statistisch berücksichtigtsignifikant, wenn P<0.05.

Ergebnisse

Asthmatisches Modell

Die 20 gesunden SPF-Grade-BALB/c-Mäuse wurden asthmatischen und normalen Kontrollgruppen mit jeweils 10 Mäusen zugeordnet. Allmice wurden in der endgültigen Analyse ohne experimentellen bewertettierverlust. Entsprechend der Lungengewebepathologie, Lungenabschnittevon den OVA-immunisierten Mäusen zeigten klare Atemwegsentzündung mitperibronchiolaren und perivaskulären Infiltraten. Diese Infiltrate bestanden überwiegend aus Eosinophilen und Lymphozyten, und Abschnitte zeigten eine Verdickung der Bronchialschleimhaut und der glatten Muskulatur, eine erhöhte Schleimsekretion, eine Ausscheidung von Atemwegsepithelzellen, eine Atemwegstenose und im Lungeninterstitium verstreute Entzündungszellen. Es wurden keine signifikanten pathologischen Veränderungen beobachtetlängenabschnitte aus der normalen Kontrollgruppe. Repräsentativhistopathologische Daten sind in Abb.1.

Expression von Zelloberflächenmolekülen durch MDC

Die Expression von CD11c, CD80 und CD86 auf MDC-Oberflächen wurde durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) nachgewiesen. mDCs aus der asthmatischen Gruppe exprimierten CD11c auf einem Niveau, das mit dem der normalen Kontrollgruppe vergleichbar war; Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen gefunden (P >0,05). Im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe jedoch die asthmatische Gruppezeigte signifikant höhere CD80- und CD86-Expressionsniveaus(P<0,05; Abb. 2).

Transfektion von mDCs

Die CD80- und CD86-spezifischen siRNA-Konstrukte wurden erfolgreich in die mDCs transferiert. Die transfizierten mDCs wurden 6 h nach der Transfektion unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet.Die Transfektionseffizienz der von FACS detektierten siRNA betrug ~ 75% (Abb. 3).

mRNA- und Proteinexpression von cd80 und CD86 durch mDCs nach Transfektion

Die mRNA- und Proteinexpressionsspiegel von CD80 und CD86 in den transfizierten mDCs wurden durch RT-qPCR- und FACSANALYSE bei 24 bzw. 72 h nach Transfektion nachgewiesen. Die cd80- und CD86-mRNA-Expressionsniveaus, die durch RT-qPCR nachgewiesen wurden, zeigten an, dass die CD80-mRNA-Expressionsniveaus in den Nicht-siRNA-, siRNA- und negativen IRNA-Gruppen 2,09 ± 0,46, 0,60 ± 0,17 bzw. 2,04 ± 0,93 und die CD86-mRNA-Expressionsniveaus 3,58 ± 0,20, 0,91 ± 0,48 bzw. 2,83 ± 0,83 betrugen. Die von FACSindicated bereitgestellten Daten zeigten, dass die CD80-proteinpositiven Expressionsraten in der Nicht-siRNA-, siRNA- und negativen siRNA-Gruppe 82,45 ± 15,80, 30,79 ± 7,07 bzw. 81,83 ± 10,07% und die CD86-proteinpositiven Expressionsraten 89,45 ± 10,22, 27,29 ± 6,99 und 87,66 ± 11 betrugen.74%, beziehungsweise. Das mRNA-Expressionsniveau und die proteinpositiven Expressionsraten zeigten vergleichbare Ergebnisse. Es gab keine signifikante Signifikanz zwischen der Nicht-siRNA-Gruppe und der negativen siRNA-Gruppe (P>0.05). Die CD80- und CD86-Expression an den RNA- und Proteinspiegeln in der siRNA-Gruppe nahm im Vergleich zu der in den Nicht-siRNA- und negativen siRNA-Gruppen signifikant ab (P<0,05; Abb. 4 und 5). Dieses zeigt, dass siRNA-targetedinterference CD80 und CD86 mRNA andprotein Ausdrucksniveaus erheblich unterdrücken kann.

IFN-γ- und IL-4-Sekretion durch mit mDCs kokultivierte T-Zellen

Nach 72 h Co-Kultur wurden die IFN-γ- und IL-4-Spiegel im Überstand des mDC- und T-Zell-Co-Kultursystems durch ELISA nachgewiesen. Die IFN-γ-Expression war in der siRNA-Gruppe signifikant erhöht (132,73±25,04 pg/ml), verglichen mit der Nicht-siRNA- und der negativen siRNA-Gruppe (72,56±26,30 bzw. 80,21±24,42pg/ml; P<0,05), während keine signifikanten Unterschiede zwischen der Nicht-siRNA- und der negativen siRNA-Gruppe (P>0.05). Die IL-4-Expressionsniveaus waren in der siRNA-Gruppe signifikant erniedrigt (93,04 ± 23,13 pg/ml), verglichen mit den Nicht-siRNA- und negativen siRNA-Gruppen (150,69±29,50 bzw. 163,19±25,36 pg/ml; P<0,05), während keine signifikanten Unterschiede zwischen den Nicht-siRNA- und negativen siRNA-Gruppen (P >0.05; Abb. 6).

Diskussion

Bronchialasthma ist eine chronisch entzündliche Atemwegserkrankung, an der verschiedene Entzündungszellen beteiligt sind, darunter Mastzellen, Eosinophile, Lymphozyten und andere Zellbestandteile (14-17).Das Th1 / Th2-Ungleichgewicht ist ein Schlüsselfaktor für den Schweregrad von Asthma(18). APCs, einschließlich DCs, Makrophagen und B-Zellen (19), spielen eine entscheidende Rolle bei der Stimulation von T-Zellen (3). Unter diesen ist das DC am stärkstenapc, Beitrag zu primären und sekundären Immunantworten,einschließlich allergischer Immunität. Reife DCs (mDCs) mit hoher Expression der co-stimulierenden Moleküle CD80 und CD86 könnenaktivieren T-Zellen, während unreife dendritische Zellen (IDCs) mit niedriger Expression von CD80 und CD86 unterdrücken die T-Zell-Antwortund induzieren Immuntoleranz (20,21). Es wurde gezeigt, dass DCsin-Patienten mit Asthma hyperaktiv sind (22).

CD80 und CD86 sind zwei Arten von Proteinen, die auf der APC-Oberfläche exprimiert werden und die zusammenwirken, um ökostimulatorische Signale bereitzustellen, die für die Aktivierung und das Überleben von T-Zellen erforderlich sind. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Expressionsniveaus der co-stimulierenden Moleküle CD80 und CD86 auf der mDC-Oberfläche eng mit der Th2-Zellreaktion und Atemwegsentzündung assoziiert sind (23,24). Bei Asthmatikern können mDCs, die CD80 und CD86 hoch exprimieren, die Aktivierung naïver CD4 + -Helfer-T-Zellen stimulieren, um sich in Richtung Th2-Zellen zu differenzieren, was zu einem Th1 / Th2-Ungleichgewicht führt. Anschließend verursacht die unzureichende Sekretion von Th1-Zytokinen wie IFN-γ zusammen mit der erhöhten Sekretion von Th2-Zytokinen wie IL-4 und IL-5 eine eosinophile Entzündung und allergische Atemwegsentzündung (10,24,25). Für die Förderung der Th2-Zellaktivierung sind zwei Signale erforderlich (26-28). Das erste Signal ist die Bildung von Antigen-MHC-Komplexen auf der mDC-Oberfläche, die spezifisch an den T-Zell-Rezeptor-CD3-Rezeptor-Komplex auf T-Zell-Oberflächen binden, und das zweite Signal ist die kostimulatorische Molekülexpression und funktionelle Aktivierung auf den mDC-Oberflächen, die spezifisch an Rezeptoren auf naïven T-Zellen binden; Die beiden Signale bilden einen kostimulatorischen Pfad (29). Es wurde auch vorgeschlagen, dass es ein drittes Signal gibt (30), da bestimmte zelluläre Moleküle, die von DCs produziert werden, wie Thymus-Stromal-Lymphopoietin (TSLP), die Richtung der Th-Zell-Differenzierung beeinflussen. Unter allen oben genannten Signalen ist jedoch der CD80 / CD86-CD28-Kostimulationspfad der klassischste und wichtigste. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass der CD80 / CD86-CD28-Kostimulationsweg ein wirksames Ziel für die Asthmabehandlung sein kann, indem gezeigt wird, dass die Blockierung des CD80 / CD86-Kostimulationsweges durch monoklonale Antikörperansätze die Entzündung bei asthmatischen Mäusen hemmen kann (25). Darüber hinaus kann die Unterdrückung des CD80 / CD86co-stimulierenden Signalwegs unter Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden die Hyperaktivität der Atemwege unterdrücken (31).

RNAi ist ein Gen-Silencing-Phänomen, bei dem endogene oder exogene spezifische doppelsträngige RNAs den Abbau homologer mRNA auslösen und den Verlust korrespondierender funktioneller Phänotypen induzieren. Seit der Entdeckung der Technik im Jahr 1998 durch Fire et al. (32) wurde die Technik weiterentwickelt, um einen hohen Grad an Spezifität und Effizienz zu erreichen. Die therapeutische Anwendung der RNA-Technologie ist ein Thema, das in den letzten Jahren ein hohes Maß an Interesse in der medizinischen und klinischen Grundlagenforschung geweckt hat.Die Fähigkeit von RNAi, die virulente Genexpression zu hemmen, wurde häufig zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt (33-35).Auch eine Reihe von Studien haben berichtet, dass RNAi verwendet werden KANNDCS zur Diagnose und Behandlung von Bronchialasthma (36-39).Darcan-Nicolaisen et al. (40) entdeckten, dass die beiden wichtigsten Anzeichen von allergischem Asthma im HIV-induzierten Asthma-Mausmodell, die Atemwegsentzündung und Hyperaktivität sind, durch Signaltransducer und Aktivator der Transkription 6 (STAT6), die in Atemwegepithelzellen unter Verwendung der Verabreichung von siRNA-Nasentropfen zum Schweigen gebracht wurden, signifikant verbessert wurden.(41) zeigten, dass siRNA-vermittelter Suppressor von Cytokine Signaling 3 (SOCS3) Gen-Silencing könnte die Atemwegsreaktivität und eosinophile Infiltration unterdrücken, die durch Allergenstimulation bei asthmatischen Mäusen induziert wurde. (42) fanden heraus, dass die Anwendung von siRNA in der Lage war, die Tyrosinproteinkinase (TPK) -Genexpression in den DCs asthmatischer Mäuse zu hemmen, die Funktionsfähigkeit von DCS als Antigen-präsentierende Zellen zu unterdrücken und dadurch die T-Zell-Aktivierung und -Differenzierung zu hemmen. Es fehlen jedoch Studien zu den Auswirkungen des siRNA-vermittelten CD80- und CD86-Knockdowns in DCs auf die T-Zelldifferenzierung bei asthmatischen Mäusen. In der vorliegenden Studie wurde die CD80- und CD86-mRNA- und Proteinexpression in murinen Knochenmarrow-abgeleiteten DCs erfolgreich mit CD80- und CD86-Targeting-siRNA verringert, was die Effizienz von RNAi verifizierte.

In der vorliegenden Studie wurde ein asthmatisches Mausmodell verwendet, das nach zuvor berichteten Methoden etabliert wurde(43). Die Ergebnisse zeigten, dassdie aus der asthmatischen Gruppe erhaltenen mDCs erhöhte cd80- und CD86-Expressionsniveaus aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die CD80 / cd86-Kapazität bei asthmatischen Patienten erhöht sein kann. Nach der Transfektion der mDCs mit CD80- und CD86-gezielter siRNA waren die RNA-Expressionsniveaus und die proteinpositiven Expressionsraten von CD80 und CD86 signifikant erniedrigt, was die hemmende Wirkung des siRNA-Ansatzes auf die costimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 auf Transkriptions- und Translationsebene bestätigte. Im Überstand aus der Co-Kultur von mDCs und T-Zellen induzierte RNAi eine Zunahme der IFN-γ-Expression und eine Verringerung der CD-4-Spiegel, was darauf hindeutet, dass eine Verringerung der Expression der co-stimulierenden Moleküle CD80 und CD86 in mDCs den co-stimulierenden Weg ECD80 / CD86-CD28 bei asthmatischen Mäusen schwächte. RNAi beeinflusste auchdie Expression von Th1 / Th2-Zytokinen, was darauf hindeutet, dass das ursprüngliche Th1 / Th2-Ungleichgewicht verändert wurde und folglich eine Immuntoleranz induziert wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CD80 und cd86 potenzielle Ziele für die RNAi-Anwendung in der Asthmabehandlung sein könnten und einen neuen Weg für die Gentherapie von Asthma darstellen.

Danksagung

Diese Studie wurde durch ein Open Projects Grant des State Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou, China) unterstützt (grant no. 2007DA80154F1107).

	Locksley RM: Asthma und allergische Entzündung. Zelle. 140:777–783. 2010. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holgate ST: Angeborene und adaptive Immunantworten bei Asthma. Nat Med. 18:673–683. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Larché M, Robinson DS und Kay AB: Die Rolle von T-Lymphozyten in der Pathogenese von Asthma. J Allergie ClinImmunol. 111:450–464. 2003. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN und Hammad H: Die Rolle von dendritischen und Epithelzellen als Hauptregulatoren allergischer Atemwegsentzündungen. Lancet. 376:835–843. 2010. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Holt PG und Upham JW: Die Rolle der dendritischen Zellen bei Asthma. In : Curr Opin Allergy Clin Immunol. 4:39–44.2004. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lim TS, Goh JK, Mortellaro A, Lim CT, Hämmerling GJ und Ricciardi-Castagnoli P: CD80 und cd86 regulieren differentiell die mechanischen Wechselwirkungen von T-Zellen mit Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen und B-Zellen. Plus Eins.7:. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS und Lam CW: Erhöhte Expression von Plasma- und zelloberflächenstimulierenden Molekülen CTLA-4, CD28 und CD86 bei erwachsenen Patienten mit allergischem Asthma. In: Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/ NCBI
	Shi HZ, Xie ZF, Deng JM, Chen YQ und XiaoCQ: Lösliches CD86-Protein in Serumproben von Patienten mit Asthma.Thorax. 59:870–875. 2004. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Rijt LS und Lambrecht BN: Dendritische Zellen bei Asthma: eine Funktion jenseits der Sensibilisierung. Clin Exp Allergie.35:1125–34. 2005. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Rijt LS, Vos N, Willart M, Kleinjan A, Coyle AJ, Hoogsteden HC und Lambrecht BN: Wesentliche Rolle der dendritischen Zelle CD80 /CD86 Costimulation in der Induktion, aber notreactivation, von TH2 Effektorantworten in einem Mausmodell von Asthma.In: J Allergy Clin Immunol. 114:166–173. 2004. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wu SG, Wang GL, Li LY und Ji J: Auswirkungen von microRNA-21 auf den Interleukin 12 / Signalwandler und Aktivator des Transkriptions-4-Signalwegs bei asthmatischen Mäusen. In : Cent Eur JImmunol. 39:40–45. 2014. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Gu X, Xiang J, Yao Y und Chen Z: Effectsof RNA-Interferenz auf CD80 und CD86-Expression in Knochenmark-abgeleiteten murinen dendritischen Zellen. In: Scand J Immunol. 64:588–594.2006. Artikel anzeigen : Google Scholar: PubMed/ NCBI
	Livak KJ und Schmittgen TD: Analyse von relativen Genexpressionsdaten unter Verwendung quantitativer Echtzeit-PCR und der 2−∆∆Ct-Methode. Methoden. 25:402–408. 2001. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Fanta CH: Asthma. In: N Engl J Med.360:1002–1014. 2009. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lambrecht BN und Hammad H: Lung dendriticcells in respiratory viral infection and asthma: From protection to immunopathology. In: Annu Rev Immunol. 30:243–270. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Wenzel SE: Asthma-Phänotypen: Die Entwicklung von klinischen zu molekularen Ansätzen. Nat Med.18:716–725. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hansel TT, Johnston SL und Openshaw PJ:Mikroben und Schleimhautimmunantworten bei Asthma. Lancet.381:861–873. 2013. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed / NCBI
	Compalati E, Braido F und Canonica GW: Ein Update zur Allergen-Immuntherapie und Asthma. In: Curr Opin Pulm Med.20:109–117. 2014. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Goyvaerts C, Dingemans J, De Groeve K,Heirman C, Van Gulck E, Vanham G, De Baetselier P, Thielemans K,Raes G und Breckpot K: Targeting von humanen Antigen-präsentierenden Zellsubstraten. J Virol. 87:11304–11308. 2013. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Reise Sousa C: Dendritische Zellen in einem Reifenalter. Nat Rev Immunol. 6:476–483. 2006. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Gill MA: Die Rolle der dendritischen Zellen inasthma. In: J Allergy Clin Immunol. 129:889–901. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Shi JH, LI YG und LI TS: Die Rolle dendritischer Zellen bei der Antigenpräsentation und der Pathogenese von Asthma. Zhonghua Jie Er Er Hu Xi Za Zhi. 28:22–27. 2005.(Auf Chinesisch). PubMed/NCBI
	Wong CK, Lun SW, Ko FW, Ip WK, Hui DS andLam CW: Erhöhte Expression von Plasma- und zelloberflächenstimulierenden Molekülen CTLA-4, CD28 und CD86 bei erwachsenen Patienten mit allergischem Asthma. In: Clin Exp Immunol. 141:122–129. 2005.Artikel anzeigen : Google Scholar: PubMed / NCBI
	Bellou A und Finn PW: Costimulation:Kritische Wege in der immunologischen Regulation von Asthma. CurrAllergy Asthma Rep. 5:149-154. 2005. Artikel ansehen : Google Scholar : PubMed / NCBI
	Chen YQ und Shi HZ: CD28 / CTLA-4-CD80 / CD86und ICOS-B7RP-1 costimulatorischer Weg bei Asthma bronchiale. Allergikerzimmer.61:15–26. 2006. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/ NCBI
	Bieber T, Novak N, Herrmann N und Koch S:Rolle der dendritischen Zellen bei atopischer Dermatitis: Ein Update. In: Clin RevAllergy Immunol. 41:254–258. 2011. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hespel C und Moser M: Rolle entzündlicher dendritischer Zellen bei angeborener und adaptiver Immunität. In: Eur J Immunol.42:2535–2543. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Novak N: Ein Update zur Rolle humaner dendritischer Zellen bei Patienten mit atopischer Dermatitis. J Allergie ClinImmunol. 129:879–886. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lombardi V, Singh AK und Akbari O: Therole von costimulatorischen Molekülen bei allergischen Erkrankungen und Asthma. In: IntArch Allergy Immunol. 151:179–189. 2010. Artikel anzeigen : Google Scholar: PubMed / NCBI
	Zhang Y, Zhou X und Zhou B: DC-derivedTSLP fördert die Th2-Polarisation bei LPS-grundierten allergischen Atemwegsentzündungen. In: Eur J Immunol. 42:1735–1743. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed / NCBI
	Crosby JR, Guha M, Tung D, Miller DA, Bender B, Condon TP, York-DeFalco C, Geary RS, Monia BP, Karras JGund Gregory SA: Inhaliertes CD86-Antisense-Oligonukleotid unterdrückt Lungenentzündungen und hyperreagibilität der Atemwege bei allergischenmäuse. In: J Pharmacol Exp Ther. 321:938–946. 2007. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE und Mello CC: Potente und spezifische genetische Interferenz durchdoppelsträngige RNA in Caenorhabditis elegans. Natur.391:806–811. 1998. ViewArticle : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Ghafouri-Fard S: siRNA und cancerimmunotherapy. Immuntherapie. 4:907–917. 2012. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Gavrilov K und Saltzman WM: TherapeuticsiRNA: Prinzipien, Herausforderungen und Strategien. In: Yale J Biol Med.85:187–200. 2012.PubMed/NCBI
	Yan WJ, Xu SJ, Xie MM und Wu BL: Auswirkungen von exogenem cyclischem dimerem Guanosinmonophosphat auf die Genexpression von Streptococcus mutans. Zhongguo Zu Zhi GongCheng Yan Jiu. 16:1451–1454. 2012.(Chinesisch).
	Lee CC, Huang HY und Chiang BL:Lentiviral-vermittelte Interleukin-4- und Interleukin-13-RNAINTERFERENZ verringern Atemwegsentzündungen und Überempfindlichkeit.Hum Gen Ther. 22:577–686. 2011. Artikel ansehen : Google Scholar : PubMed / NCBI
	Li Y, Sun M, Cheng H, Li S, Liu L, Qiao H, Hua S und Lu J: Stummschaltung der IL-23-Expression durch eine kleine Haarnadel schützt vor Asthma bei Mäusen. Verwendbar bis Med. 43:197–204. 2011.Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Woska JJ und Gillespie ME:Small-interfering RNA-mediated identification and regulation of theternary SNARE complex mediating RBL-2H3 mast cell degranulation.In: Scand J Immunol. 73:8–17. 2011. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Lu XX, McCoy KS, Xu JL, Hu WK und Chen HB:Small interfering RNA targeting T-cell Ig mucin-3 decreasesallergic airway inflammation and hyperresponsiveness. Entzündung.36:582–591. 2013. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Darcan-Nicolaisen Y, Meinicke H, Fels G,Hegend O, Haberland A, Kühl A, Loddenkemper C, Witzenrath M, KubeS, Henke W und Hamelmann E: Small interfering RNA againsttranscription factor STAT6 hemmt allergische Atemwegsentzündungen und Hyperreaktivität bei Mäusen. In: J Immunol. 182:7501–7508. 2009.Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Moriwaki A, Inoue H, Nakano T, MatsunagaY, Matsuno Y, Matsumoto T, Fukuyama S, Kan-O K, Matsumoto K,Tsuda-Eguchi M, et al: T die Zellbehandlung mit einem kleinen störenden RNAfor-Suppressor der Zytokinsignalisierung 3 moduliert allergische Atemwegsreaktionen in einem Mausmodell von Asthma. In: Am J Respir Cell Mol Biol.44:448–455. 2011. Artikel anzeigen : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Zheng YH, Lu JJ, Guo ZL, Ren T und LiangYJ: Small interfering RNAs specific for mille tyrosine kinaseinhibit maturation of dendritic cells of asthmatic mice in vitro.Zhongguo Hu Xi Yu Wei Zhong Jian Hu Za Zhi. 8:487–491. 2009.(Auf Chinesisch).
	Li JG, Zhuansun YX, Lief PX, Zhang W, MoXN, Wu H und Li YQ: Auswirkungen von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks auf CD4 + CD25 + regulatorische T-Zellen und Atemwegsentzündung bei asthmatischen Mäusen. In: Zhongguo Zu Zhi Gong Cheng Yan Jiu.12:9302–9305. 2008.(Chinesisch).