Fluoreszenzmarkierung

Definition

Fluoreszenzmarkierung ist der Prozess der Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen an funktionelle Gruppen in Biomolekülen, so dass sie durch Fluoreszenzbildgebung sichtbar gemacht werden können (nature.com ). Die Verfügbarkeit neuer Fluorophore hat die Möglichkeiten für den sensitiven Nachweis von Biomolekülen und die Analyse ihrer Wechselwirkungen dramatisch verändert. Verbesserte Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichen nun bisher unmögliche Untersuchungen zellulärer Strukturen und zellulärer Prozesse. Fluoreszenzmarkierungen bieten viele Vorteile, da sie bereits bei niedrigen Konzentrationen hochempfindlich sind, über lange Zeiträume stabil sind und die Funktion der Zielmoleküle nicht stören. Die gezielte Bildgebung von markierten Zellen ermöglicht es, sie in vitro und in vivo zu verfolgen. Die Verwendung verschiedener Fluorophore in derselben Probe kann auch die gleichzeitige Beobachtung mehrerer Moleküle gleichzeitig ermöglichen. Die am häufigsten verwendeten Fluorophore sind Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Derivate von Rhodamin (TRITC), Cumarin und Cyanin. Diese synthetischen organischen Farbstoffe werden verwendet, um Biomoleküle als Proteine, Peptide, Antikörper, Nukleinsäuren, Bakterien oder Hefen zu kennzeichnen. Natürlich vorkommende Fluorochrome, wie Grün fluoreszierendes Protein (GFP), können auch verwendet werden, um lebende Zellen genetisch zu markieren.

• Fluoreszierende Proteinmarkierung
  Fluoreszierende Markierung ermöglicht es Forschern, die Konformationsdynamik und molekularen Wechselwirkungen von Proteinen zu untersuchen oder ihre Bewegungen zu verfolgen, um ihre biologischen Funktionen besser zu verstehen (Modesti M, 2011). Um einen besseren Einblick in Rezeptor-Ligand-Bindung, Proteinstrukturen und Enzymaktivität zu erhalten, können auch einzelne Peptide markiert werden. Fluorochrom-markierte Antikörper werden in der biomedizinischen Forschung häufig zum Nachweis von Antigenen in Immunfluoreszenztests verwendet und sind auch wesentliche Instrumente in der Immundiagnostik. Um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten, sollte die Fluorophorkonjugation die Antigenbindungseigenschaften des Antikörpers nicht beeinträchtigen (Nath N et al., 2016).
• Fluoreszenzmarkierung von Nukleinsäuren
  Fluoreszenzbasierte Assays spielen eine wichtige Rolle bei biophysikalischen Untersuchungen der Struktur, Funktion und Dynamik von Nukleinsäuren. Jüngste Fortschritte bei Markierungsmethoden und Bildgebungssystemen haben die direkte In-vivo-Beobachtung von DNA und RNA und ihrer Wechselwirkungen mit anderen Zellkomponenten ermöglicht. Die Lebendzellbildgebung von Nukleinsäuren hat neue Wege für ein besseres Verständnis der Chromatinorganisation und der Regulation der Genexpression eröffnet. (Dirks RW et al, 2018).
• Fluoreszenzmarkierung von Polysacchariden
  Komplexe Polysaccharide wie Heparin sind strukturelle Bestandteile der extrazellulären Matrix. Diese Polysaccharide sind essentiell für zelluläre Adhäsion, Migration und Wachstum (Prigent-Richard S. et al, 1998). Einige Verbindungen sind auch für ihre gerinnungshemmenden, antithrombotischen, entzündungshemmenden, antiviralen und antiangiogenen Eigenschaften bekannt. Fluoreszenzbasierte Methoden erleichtern die Identifizierung neuer bioaktiver Polysaccharide und die Charakterisierung ihrer biologischen Funktionen (Roger O et al., 2002).
• Fluoreszenzmarkierung von Lipiden
  Zelluläre Lipide spielen in der Zelle eine entscheidende Rolle für die Energiespeicherung, für die Bildung von Zellmembranen und für intrazelluläre Signalprozesse (Maekawa M. und Fairn G., 2014). Der lipophile Farbstoff Nilrot wird häufig verwendet, um intrazelluläre Lipide zu färben, um ihre Position und Organisation zu analysieren (Greenspan P et al., 1985). Darüber hinaus ist zur Untersuchung der Lipiddynamik auch eine spezifische Markierung in lebenden Zellen möglich (Schultz C et al., 2010).

Fluoreszenzmarkierungstechniken

Häufig verwendete Fluoreszenzmarkierungsmethoden verwenden chemische, enzymatische, Peptid- / Protein-Tag- und genetische Markierungstechniken (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).

• Chemische Markierungstechniken: Fluorophore docken durch chemische Modifikation (kovalente oder nicht-kovalente Bindung) an die Zielmoleküle an. Chemische Kennzeichnungsmethoden haben mehrere Vorteile, da sie robust, einfach durchzuführen und mit einer Vielzahl von Fluorophoren sehr effizient sind. Sie eignen sich eher für In-vitro-Studien als für In-vivo-Studien.
• Enzymatische Markierungstechniken: Enzymatische Reaktionen ermöglichen eine schnelle, hocheffiziente und selektive Markierung in vivo und in vitro und können zum Targeting von Proteinen oder ganzen Zellen verwendet werden. Aufgrund der großen Größe der Markierungen kann es jedoch zu Interferenzen mit der Funktion der Zielmoleküle kommen.
• Peptid / Protein-Tag: Eine kürzlich entwickelte und sehr vielversprechende Technik ermöglicht die spezifische und selektive Markierung von Proteinen durch den Einbau kurzer fluoreszierender Tags, die die Faltung oder Funktion des Moleküls nicht stören. Diese Technik ist ebenfalls einfach durchzuführen und kann verwendet werden, um verschiedene Stellen einzelner Proteine in Abhängigkeit von der Peptid-Tag-Spezifität zu untersuchen.
• Genetische Markierung: Die genetische Markierung kann mit Proteindomänen, kleinen Peptiden oder einzelnen Aminosäuren erreicht werden, die mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind und sich in vivo spezifisch an Stellen entlang der Chromosomen anlagern können. Dieser Ansatz ermöglicht den Nachweis von Chromosomenanomalien wie Deletionen oder Duplikationen.
• Mehrfarbige Beschriftung: Eine häufige Anforderung für die Lebendzellbildgebung und für Durchflusszytometrieanwendungen ist die Fähigkeit, mehrere fluoreszenzmarkierte Proteine gleichzeitig zu verfolgen oder nachzuweisen. Zu diesem Zweck können speziell entwickelte Farbstoffe mit einer sehr großen Stokes-Verschiebung verwendet werden, die die gleichzeitige Überwachung verschiedener biochemischer Prozesse ermöglichen.

Fluoreszenzbasierte Assays

Fluoreszenzbasierte Assays beruhen auf der Fähigkeit von Fluorophoren, Licht nach der Exposition gegenüber Lichtpartikeln oder Photonen erneut zu emittieren. Der Wellenlängenunterschied zwischen Anregungs- und Emissionslicht, die sogenannte Stokes-Verschiebung, kann in Mikroskopen und bildgebenden Systemen nachgewiesen werden. Jeder Fluorophor hat eine spezifische Stokes-Verschiebung. Verschiedene Assays ermöglichen es Forschern, Biomoleküle zu lokalisieren, in Echtzeit zu beobachten, ihre Wechselwirkungen zu untersuchen und enzymatische Aktivitäten zu untersuchen.

• Fluoreszenzmikroskopie
  Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Identifizierung von Zellen und zellulären Komponenten und die Überwachung der Zellphysiologie mit hoher Spezifität. Die Fluoreszenzmikroskopie trennt emittiertes Licht mit optischen Filtern vom Anregungslicht. Die Verwendung von zwei Indikatoren ermöglicht auch die gleichzeitige Beobachtung verschiedener Biomoleküle zur gleichen Zeit. Während herkömmliche Bildgebungssysteme aufgrund physikalischer Beugungsgrenzen eine Auflösung von 200 bis 300 nm erlauben, überwinden neue superauflösende Fluoreszenzmikroskope wie STED (Stimulated Emission Depletion) diese Grenzen und geben Einblicke in die nanoskalige Welt der Moleküle (Sanderson MJ et al, 2014).
• Durchflusszytometrie
  Die Durchflusszytometrie wird in der Grundlagenforschung und in der klinischen Praxis häufig eingesetzt, um das Signal bestimmter Fluorophore zu messen. Zellen und Partikel werden analysiert und schließlich in „Echtzeit“ sortiert, während sie den Lichtstrahl von Detektoren passieren, die die Fluoreszenz quantifizieren, die von markierten Antikörpern oder Liganden erzeugt wird. Diese Marker binden an spezifische Moleküle auf der Zelloberfläche oder im Inneren der Zelle und ermöglichen deren Nachweis und Quantifizierung. Verschiedene Parameter wie Größe und Volumen können an einzelnen Zellen gemessen und verschiedene Zelltypen isoliert und charakterisiert werden (Nolan JT und Condello D, 2013). Die Durchflusszytometrie findet breite Anwendung in Bereichen wie Immunologie, Hämatologie, Transplantationsmedizin, Onkologie und Genetik.
• Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
  Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ermöglicht die Lokalisierung spezifischer DNA-Sequenzen auf Chromosomen. Fluoreszierende DNA- oder RNA-Sonden werden verwendet, um komplementäre Ziel-DNA-Sequenzen zu hybridisieren und zu identifizieren. FISCH wurde traditionell verwendet, um Gene auf Chromosomen abzubilden, beispielsweise während des Humangenomprojekts. Heute wird die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung hauptsächlich für diagnostische Zwecke beim Nachweis von Chromosomenanomalien oder bei der Analyse von Krebszellen verwendet (O’Connor C, 2008).
• Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS)
  Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) erlaubt die Analyse von zeitlichen Veränderungen der Fluoreszenzintensität von Fluorochromen, die durch chemische, biologische oder physikalische Einflüsse hervorgerufen werden. FCS wurde zuerst eingeführt, um die Wechselwirkung zwischen Arzneimitteln und DNA zu untersuchen, und stellt heute ein empfindliches Instrument zur Bestimmung der Konzentration und Aggregation von Proteinen sowie zur Beobachtung molekularer Wechselwirkungen dar (Tian Y et al., 2011).
• Microarrays
  Microarrays ermöglichen die Untersuchung der Genexpression unter verschiedenen Bedingungen. Tausende von Genen können gleichzeitig auf DNA-Chips untersucht werden. Dies sind mikroskopische Objektträger, die mit winzigen Flecken bedruckt sind, die bekannte DNA-Sequenzen enthalten, die selektiv an fluoreszenzmarkierte mRNA / cDNA-Moleküle binden können. Nach der Hybridisierung wird der DNA-Chip ausgelesen und aus den Daten werden Genexpressionsprofile erstellt (Hoen PAC et al, 2003).

Fluorescent Label: Live-Cell Imaging

Die kinetische Beobachtung zellulärer Prozesse mittels Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie hat sich zu einer grundlegenden Technik in der Zellbiologie entwickelt, da die Lebendzellbildgebung sehr wertvolle Einblicke in zelluläre Wachstums- und Transportmechanismen liefern kann. Eine große Herausforderung in der Zeitraffermikroskopie ist die Minimierung phototoxischer Effekte durch Photobleaching. Die Belichtung zerstört zunehmend fluoreszierende Moleküle, was zu einer Verringerung des Fluoreszenzsignals und zur Bildung von freien Radikalen führt, die die Zellen schädigen können. Daher ist es für die Methode der Lebendzell-Bildgebung entscheidend, ein Gleichgewicht zwischen der Reduzierung der Lichtexposition so weit wie möglich und der Gewinnung nützlicher Signale zur Beobachtung der Zellen zu finden. Wissenschaftler müssen auch eine physiologische Umgebung schaffen, die es ermöglicht, die In-vivo-Dynamik genau nachzubilden. (Ettinger und Wittmann T, 2014).

PromoCell Fluoreszierende Markierung

Die Verfügbarkeit neuer Fluorophore hat die Möglichkeiten für den sensitiven Nachweis von Biomolekülen und die Analyse ihrer Wechselwirkungen dramatisch verändert. Verbesserte Fluoreszenzfarbstoffe ermöglichen nun bisher unmögliche Untersuchungen zellulärer Strukturen und zellulärer Prozesse. PromoCell bietet eine breite Palette hochwertiger Fluorophore für die Fluoreszenzmarkierung verschiedener Biomoleküle: proteinmarkierung, Antikörpermarkierung, Nukleinsäuremarkierung (DNA-Markierung, RNA-Markierung) sowie komplette Markierungskits und gebrauchsfertige Fluoreszenzkonjugate.

Unsere PromoFluor-Farbstoffe sind kostengünstige Alternativen zu bekannten, führenden Fluorophoren und umfassen das Wellenlängenspektrum von blau bis weit rot. Sie zeigen eine hervorragende Fluoreszenzintensität und Photostabilität, eine starke Lichtabsorption, eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute und eine gute Wasserlöslichkeit und können für Fluoreszenzmikroskopie, fluoreszierende in situ Hybridisierung (FISH), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und Microarrays (Protein, DNA) eingesetzt werden. Einige von ihnen bieten eine extra große Stokes-Verschiebung, wodurch sie sich ideal für Mehrfarbenmarkierungs- oder Durchflusszytometrieanwendungen eignen. Promofluorfarbstoffe sind z.B. als kovalent kopplungsfertige NHS-Ester, Maleinimide und aminomodifizierte Marker oder als Konjugate mit Biotin, Phalloidin und Desoxynukleotiden (dUTPs). Darüber hinaus bieten wir auch hochwertige Protein & Antikörper-Markierungskits mit verschiedenen PromoFluor-Farbstoffen an.