Frontiers in Pharmacology

Einführung

Membranproteine sind an grundlegenden physiologischen Ereignissen in jedem biologischen System von Bakterien bis zum Menschen beteiligt. >50% der vermarkteten Medikamente zielen auf Membranproteine ab, während das pharmakologische Targeting vieler anderer Membranproteine in zahlreichen biomedizinischen Anwendungen als potenziell vorteilhaft angesehen wird (Overington et al., 2006; Yıldırım et al., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). Die molekularen Mechanismen, die ihrer Funktion und Regulation zugrunde liegen, sind jedoch aufgrund fehlender struktureller Informationen weitgehend unbekannt. Während Membranproteine ~ 26% des menschlichen Proteoms ausmachen, machen ihre Strukturen nur ∼2% der Strukturen in der Proteindatenbank aus (Fagerberg et al., 2010; Pandey et al., 2016). Mehrere Hindernisse behindern die strukturelle Untersuchung von Membranproteinen und erfordern die Entwicklung modernster Technologien zur Aufklärung ihrer molekularen Architekturen (Pandey et al., 2016; Masson et al., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula und Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). Die Haupthindernisse sind, dass ihre Überexpression und Reinigung und Strukturstudien durch die meisten Techniken (z. B. Röntgenkristallographie) in vielen Fällen begrenzt bleiben. Diese Hindernisse behindern folglich die rationale Entwicklung von Wirkstoffkandidaten, die auf krankheitsbezogene Membranproteine abzielen (Vinothkumar und Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).Sekundärtransporter sind membrangebundene Proteine, die selektiv die Bewegung schlecht permeabler gelöster Stoffe (z., ionen, neurotransmitter, drogen) über die zellmembran, unterstützung verschiedenen zellulären funktionen in gesundheit und krankheit. Sekundärtransporter entsprechen dem alternierenden Zugangsparadigma, wonach die Proteinligandenbindungstasche an gegenüberliegenden Seiten der Membran alternativ zugänglich wird, indem sie nacheinander die nach innen gerichteten (IF) und nach außen gerichteten (OF) Zustände annehmen (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Jüngste Durchbrüche in der Strukturbiologie von Membranproteinen lieferten eine Fülle von Strukturen membrangebundener Transporter in verschiedenen Konformationszuständen (Drew und Boudker, 2016; Bai et al., 2017), die Einblicke in ihre Transport- und Lösemittelerkennungsmechanismen geben. Sie liefern jedoch statische Momentaufnahmen eines inhärent mehrstufigen Prozesses (Seeger, 2018). Daher besteht ein wachsender Bedarf an der Entwicklung neuer Ansätze zur Untersuchung der Dynamik von Membranproteinen (Konermann et al., 2011; Schmidt et al., 2012; Sim et al., 2017; Mandala et al., 2018; Burke, 2019). Dazu gehört eine Kombination von Molekulardynamik (MD)-Simulationen (Roux et al., 2011; Zdravkovic et al., 2012; Zhekova et al., 2016; Zhekova et al., 2017; Harpole und Delemotte, 2018) mit fortgeschrittenen experimentellen Techniken, einschließlich spektroskopischer Techniken und kryogener Einzelteilchenelektronenmikroskopie (Smith et al., 2012; Pandey et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula und Ramamoorthy, 2019; Sonne und Gennis, 2019).Die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) hat in den letzten Jahren für die Untersuchung der Dynamik von Membranproteinen an Aufmerksamkeit gewonnen, obwohl sie seit Jahrzehnten zur Charakterisierung löslicher Proteine eingesetzt wird (Konermann et al., 2011; Vadas et al., 2017). HDX-MS überwacht den zeitabhängigen Austausch von Lösungsmittel D2O mit Proteinen und Amidwasserstoffen unter nativen Bedingungen. Die Deuteriumwechselrate hängt von der Lösungsmittelzugänglichkeit, der Sekundärstruktur und der strukturellen Steifigkeit ab (Konermann et al., 2011). In Verbindung mit proteolytischem Digestion und Peptidseparation ermöglicht HDX-MS die Quantifizierung von Austauschraten in kurzen Proteinsegmenten bis hin zur Auflösung von Einzelresten. Zwei Hauptvorteile von HDX-MS sind, dass kleine Proteinmengen (< 0,1 mg) für die Analyse benötigt werden und dass keine chemische Proteinmarkierung erforderlich ist, wodurch unerwünschte strukturelle Störungen vermieden werden. Hier fassen wir die jüngsten Fortschritte und Anwendungen bei der Verwendung von HDX-MS zur Untersuchung der Strukturdynamik von Transportern zusammen.

Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie-Prinzipien

HDX-MS-Prinzipien werden im Folgenden kurz und qualitativ beschrieben, um eine Diskussion ihrer Anwendungen für die Untersuchung von Transportern zu ermöglichen. Für ausführliche Erklärungen stehen mehrere ausgezeichnete Übersichtsartikel zur Verfügung (Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; Engen und Wales, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019).

In HDX-Experimenten tauscht Deuterium nach Proteinverdünnung in einem D2O-Puffer zeitabhängig mit labilen Proteinwasserstoffen aus (Masson et al., 2017) (Abbildung 1). HDX-MS überwacht hauptsächlich den Austausch von Rückgratamidwasserstoffen, da i) sie bei neutralem pH-Wert in Raten ausgetauscht werden, die mit HDX-MS (Sekunden bis Tage) nachgewiesen werden können, und ii) ihr Austausch effektiv abgeschreckt werden kann (Marcsisin und Engen, 2010; Gallagher und Hudgens, 2016). Die HDX-Rate hängt von mehreren Parametern ab. Amidwasserstoffe können einen „geschlossenen Zustand“ aufweisen, der sich aus der Beteiligung an stabilen Wasserstoffbrückenbindungen in Sekundärstrukturen oder aus der Unzugänglichkeit von Lösungsmitteln ergibt, die ihren Austausch mit Lösungsmitteldeuterium nicht zulassen, oder einen „offenen Zustand“, in dem die Protonenabstraktion, der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt von HDX, auftreten kann (Oganesyan et al., 2018). Darüber hinaus hat die Reaktion eine intrinsische chemische Geschwindigkeitskonstante, die vom pH-Wert, der Temperatur und der Rückstandsumgebung abhängt (Oganesyan et al., 2018).

Der Übergang zwischen dem geschlossenen und dem offenen Zustand erfolgt durch lokale Entfaltungsereignisse. Unter nativen Bedingungen, in denen Proteine gut gefaltet sind, hängt die HDX-Rate hauptsächlich von der Geschwindigkeit des Übergangs zurück in den geschlossenen Zustand ab (Weis et al., 2006). Wenn die entfaltete Proteinregion viel langsamer als die chemische Austauschrate in den geschlossenen Zustand zurückkehrt, wird eine EX1-Kinetik beobachtet, die zu einer korrelierten Deuteriumaufnahme in benachbarten Resten führt. Dies führt zu zwei Populationen: eine mit niedrigem m / z und eine mit hohem m / z, die Peptide aus Proteinmolekülen widerspiegeln, die keinen bzw. die einen Austausch erfahren haben. Mit der Zeit wird die hohe m / z-Population auf Kosten der niedrigen m / z-Population prominenter. EX1-Kinetik gilt in gefalteten Proteinen unter nativen Bedingungen als selten, kann aber beispielsweise durch den Zusatz von Denaturierungsmitteln induziert werden (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Wenn das Protein viel schneller als die chemische Austauschrate in den geschlossenen Zustand zurückkehrt, wird die EX2-Kinetik beobachtet. Dabei hängt der Austausch vom unkorreliert ablaufenden Übergang einzelner Reste zwischen offenem und geschlossenem Zustand ab. So wird mit der Zeit eine einzelne Population mit allmählich ansteigenden m/ z-Werten beobachtet (Weis et al., 2006).

Nach der Deuteration wird die Reaktion zu vordefinierten Zeitpunkten gequencht, indem der pH–Wert von neutral (7) auf pHmin (2,5-3) geändert wird, was zu einer ~ 10.000-fachen Reduktion von HDX führt (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); und durch Verringerung der Temperatur von 25 auf 0 ° C, was zu einer ~ 14-fachen Abnahme von HDX führt (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). Anschließend wird das Protein mit einer Protease verdaut und die Peptide mittels analytischer Reverse-Phase-Chromatographie getrennt. Derzeit liegt der größte technische Engpass von HDX-MS-Experimenten in der Erzielung einer hohen Sequenzabdeckung, die durch die Resistenz gegen Verdauungsenzyme und durch proteolytische Bedingungen begrenzt ist. Schließlich werden eluierte Peptide mittels MS identifiziert und der HDX-Grad anhand der erhaltenen m/z-Werte berechnet. Die experimentellen Details und Fallstricke der Proteinverdauung, Peptidtrennung und MS-Identifizierung gehen über den Rahmen dieser Überprüfung hinaus (Konermann et al., 2011; In: Masson et al., 2017; Masson et al., 2019).

Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie-Studien von Membranproteinen

Trotz der gemeinsamen Nutzung des alternierenden Zugangsparadigmas unterscheiden sich Ligand-induzierte Konformationsänderungen zwischen Transportern aufgrund von Unterschieden in Ligand-Protein-Wechselwirkungen. Zum Beispiel können Symporter (Co-Transport von zwei oder mehr Liganden) ohne gebundene Liganden zwischen den IF- und OF-Zuständen wechseln, während die Ligandenbindung für den Austausch zwischen den IF- und OF-Zuständen in Antiportern (Austausch von Liganden auf gegenüberliegenden Seiten der Membran) obligatorisch ist (Forrest et al., 2011; Drew und Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

Im Allgemeinen ist es schwierig, lokale ligandeninduzierte dynamische Veränderungen in Proteinen nachzuweisen. Zum Beispiel sind die Kristallstrukturen von Membranproteinen sowohl in der ligandenfreien als auch in der ligandengebundenen Form häufig nicht verfügbar, was den Nachweis von ligandeninduzierten Konformationsänderungen selbst für Proteine mit bekannten Strukturen ausschließt. Darüber hinaus lösen hochauflösende strukturelle Momentaufnahmen der Apo- und ligandengebundenen Zustände möglicherweise keine signifikanten Konformationsunterschiede auf. Kleine ligandeninduzierte Konformationsänderungen können jedoch mit HDX-MS an spezifischen Proteinsubdomänen unter nativen Bedingungen nachgewiesen werden, indem die differentielle Deuteriumaufnahme (ΔHDX) in Gegenwart und Abwesenheit von Liganden gemessen wird. Diese Fähigkeit von HDX-MS bietet einzigartige Möglichkeiten, die schwierigsten Probleme bei der Aufklärung der Mechanismen von Ligand-Protein- und Protein-Protein-Interaktionen anzugehen (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), wie hier für eine Reihe kürzlich untersuchter Transporterproteine beschrieben.

Konformationsübergänge, die dem alternierenden Zugang zugrunde liegen: Der Na + / H + -Antiporter

Nha-Proteine regulieren den zellulären pH-Wert und das Volumen während der gesamten Lebensdauer (Padan und Landau, 2016). Das Hauptstrukturmodell zur Untersuchung von Nha-Orthologen ist Escherichia coli NhaA, für das eine kristallographische Struktur des inaktiven Zustands bei saurem pH-Wert verfügbar ist (Hunte et al., 2005). Um die Strukturdynamik von NhaA unter physiologischem pH-Wert zu untersuchen, wurde kürzlich HDX-MS verwendet (Eisinger et al., 2017). Entscheidend für die in dieser Studie gewonnenen Erkenntnisse ist, dass HDX-MS globale dynamische Daten liefert, im Gegensatz zu Methoden, die auf ortsspezifischer Markierung basieren und nur Bewegungen vordefinierter Proteinregionen erfassen.

In dieser Studie wurde eine außergewöhnlich hohe Sequenzabdeckung von 88,5% für NhaA in Detergenz erhalten, was Einblicke in den Mechanismus liefert, der dem alternierenden Zugang bei Ligandenbindung zugrunde liegt. Durch den Vergleich der HDX-Muster zwischen apo- und substratgebundenem Nha wurde ein wiederkehrendes Muster der HDX-Veränderung in mehreren Helices beobachtet, wobei eine erhöhte Deuteriumaufnahme in einem Terminus von einer verringerten Deuteriumaufnahme am anderen Terminus begleitet wurde. Die Aufnahme in der Mitte der Helices war weitgehend unverändert.Basierend auf dem beobachteten Muster der HDX-Änderung, obwohl es keine direkte räumliche Information liefert, wurde vorgeschlagen, dass eine Translation der Transmembranhelices relativ zur Membran auftritt, was sich in den reziproken HDX-Änderungen widerspiegelt, die für die beiden Termini innerhalb spezifischer Transmembranhelices beobachtet wurden. Dieses Modell steht im Einklang mit dem „aufzugsartigen“ Mechanismus des abwechselnden Zugangs, der eine vertikale Translation von Transmembranhelices während des Transportzyklus impliziert (Ryan und Vandenberg, 2016). Zusammenfassend lieferte HDX-MS neuartige Einblicke in die strukturellen Übergänge bei alternierendem Zugang, die durch die zuvor aufgelösten Strukturen des inaktiven NhaA unerreichbar waren.

Wirkung von Protein-Lipid-Wechselwirkungen auf die Konformationslandschaften von Transportern

Die meisten sekundären Transporter gehören zur Major Facilitator Superfamilie (MFS) und teilen trotz ihrer vielfältigen Funktionen eine konservierte Architektur (Radestock und Forrest, 2011). Obwohl die Kristallstrukturen von MFS-Mitgliedern verfügbar sind, lieferten sie wenig Informationen über Protein-Lipid-Wechselwirkungen und deren Auswirkungen auf das Gleichgewicht zwischen den OF- und IF-Zuständen. So haben Martens et al. kombinierte MD-Simulationen mit HDX-MS, um die Auswirkungen der Lipidumgebung auf drei gut charakterisierte Transporter zu untersuchen: Lactose-Permease, Xylose-Transporter und Glycerin-3-Phosphat-Antiporter (Martens et al., 2018).

Zunächst wurde eine Mutation, von der bekannt ist, dass sie das Gleichgewicht in Richtung des OF-Zustands verschiebt, am extrazellulären Vestibulum aller Transporter eingeführt (Kumar et al., 2014). Der Vergleich der WT und mutierten Transporter unter Verwendung von HDX-MS ergab, dass die Methode die Konformationsänderung detektiert, wobei Regionen auf dem extrazellulären Vestibül mehr Deuterium in den Mutanten aufnehmen als das WT, während das Gegenteil für Rückstände am intrazellulären Vestibül auftritt. Als nächstes wurden die Transporter in Nanodisks rekonstituiert, die aus Phosphatidylglycerin, Tetraoleylcardiolipin und entweder Phosphatidylcholin oder Phosphatidylethanolamin bestanden. Interessanterweise verlagerte die Anwesenheit von Phosphatidylethanolamin das Gleichgewicht in Richtung des IF-Zustands. Anschließend sagten MD-Simulationen der Transporter in Lipiddoppelschichten, die mit der Zusammensetzung der Nanodisks identisch waren, direkte Wechselwirkungen zwischen der geladenen Phosphatidylethanolamin-Kopfgruppe und einem konservierten zytoplasmatischen Netzwerk geladener Reste voraus, wodurch der OF-Zustand stabilisiert wurde (Doki et al., 2013). Die Mutation der geladenen Reste hob die Wirkung von Phosphatidylethanolamin auf, was stark darauf hindeutet, dass spezifische Phosphatidylethanolamin-Protein-Wechselwirkungen das intrinsische Gleichgewicht der Transporter steuern. Diese Studie ist ein anschauliches Beispiel für die Kombination experimenteller und computergestützter Methoden, um subtile, aber funktionell signifikante Protein-Lipid-Wechselwirkungen zu identifizieren.

Helixabwickeln während des Transports: Studien zu LeuT

LeuT ist ein prokaryotisches Homolog der Neurotransmitter / Na + -Symporter (NSS) -Familie, zu der wichtige Wirkstoffziele wie die Serotonin-, Dopamin- und Noradrenalintransporter gehören (Kristensen et al., 2011). LeuT wurde ausführlich untersucht und seine kristallographischen Strukturen entlang des Transportzyklus sind verfügbar (Focke et al., 2013). Diese Strukturen deuteten darauf hin, dass während des wechselnden Zugangs großflächige strukturelle Umlagerungen erforderlich sind (Krishnamurthy und Gouaux, 2012). Die Konformationslandschaft, die den Übergang zwischen den IF- und OF-Staaten ermöglicht, bleibt jedoch schwer fassbar und umstritten.

Um den Übergang zwischen verschiedenen Zuständen zu untersuchen, wurde Detergens-solubilisiertes LeuT unter Bedingungen untersucht, die das IF oder VON Zuständen begünstigen (Merkle et al., 2018). Überraschenderweise zeigten viele Peptide, hauptsächlich auf der intrazellulären Seite des Transporters, eine EX1-Kinetik. Dies ist bei gefalteten Proteinen unter nativen Bedingungen eher ungewöhnlich und spiegelt eine langlebige Entfaltung von Sekundärstrukturelementen wider. Basierend auf der räumlichen Verteilung von Peptiden mit EX1-Kinetik und den verfügbaren kristallographischen Strukturen wurde vorgeschlagen, dass bestimmte Helices während des alternierenden Zugangs teilweise abgewickelt werden und dass diese Konformationsänderungen auch zur Substratfreisetzung beitragen. Diese Studie hebt die funktionelle Bedeutung von langsamen (Sekunden-Zeitskala) Konformationsänderungen hervor, die mit HDX-MS im Gegensatz zu anderen experimentellen oder rechnerischen (z. B. MD) Methoden gut aufgelöst werden können.

Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie von Membranproteinen in Lipid-Nanodisks

Die Wechselwirkungen von Membranproteinen mit umgebenden Lipiden können ihre Funktion dramatisch modulieren (Vadas et al., 2017). Tatsächlich hängt die Aktivität eukaryotischer NSS-Mitglieder signifikant von spezifischen Lipid-Protein-Wechselwirkungen ab, die die Proteindynamik und folglich die Substratinteraktionen modulieren (Divito und Amara, 2009). Daher haben Adhikary et al. untersuchte LeuT rekonstituiert in Phospholipid-Doppelschicht-Nanodisks (Adhikary et al., 2017). Mit diesem Ansatz wurde LeuT unter Bedingungen untersucht, die die IF und VON Konformationen begünstigen. Der Vergleich der HDX-Muster zwischen diesen Zuständen ergab spezifische Veränderungen in Regionen, die zuvor am Transportzyklus beteiligt waren und funktionell signifikante strukturelle Veränderungen widerspiegelten. Interessanterweise unterstützten die HDX-MS-Daten, die mit früheren biophysikalischen und computergestützten Studien übereinstimmten, einen kleineren Neigungswinkel für die erste Transmembranhelix in der IF-Konformation im Vergleich zu dem in den Kristallstrukturen beobachteten. Dieser Unterschied wurde der Lipidumgebung zugeschrieben, da die Kristallstruktur in Detergenz mit geringer Lipidmenge erhalten wurde. Zusammenfassend bietet HDX-MS eine flexible Plattform zur Untersuchung von Membranproteinen in verschiedenen hydrophoben Umgebungen und unter Bedingungen, die spezifische Konformationszustände begünstigen, ohne dass eine ortsspezifische Markierung erforderlich ist.

Ioneninteraktionen mit mehreren Stellen: Der Na + / Ca2+ -Austauscher

NCX beteiligt sich an der zellulären Ca2 + -Homöostase, indem es Ca2 + aus den Zellen gegen seinen elektrochemischen Gradienten extrudiert (Blaustein und Lederer, 1999). NCX tauscht 3Na +: 1Ca2 + aus, wobei Na + und Ca2 + in getrennten Schritten transportiert werden (Khananshvili, 1990). Überraschenderweise zeigte die Kristallstruktur von NCX aus Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) vier Ionenbindungsstellen, die gleichzeitig von drei Na + -Ionen an als Sint, Smid, Sext bezeichneten Stellen und einem Ca2 + -Ion an einer als SCa bezeichneten Stelle besetzt waren (Liao et al., 2012). Da dieser Bindungsmodus nicht mit früheren Studien übereinstimmte, wurden MD-Simulationen und Ionenflussanalysen von Mutanten durchgeführt, was darauf hindeutet, dass Na + -Ionen Sint, SCa und Sext besetzen, während Ca2 + SCa besetzt (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Somit sind die Na + – und Ca2+ -Ionen entlang des Transportzyklus gegenseitig ausschließend gebunden.

Um die Zuordnung von Ionenbindungsstellen experimentell zu ermitteln, verglichen wir den Apo-Zustand mit den ionengebundenen Zuständen von NCX_Mj unter Verwendung von HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). Trotz geringer Sequenzabdeckung umfasste unsere Analyse 10 von 12 ionenkoordinierenden Resten. Wir fanden eine Na + -abhängige Abnahme der Deuteriumaufnahme bei Sint, SCa und Sext, aber nicht bei Smid, während in Gegenwart von Ca2 + die Abnahme der Deuteriumaufnahme hauptsächlich bei SCa beobachtet wurde. Dies steht im Einklang mit den Vorhersagen der MD-Simulationen und Mutationsanalysen, die die Besetzung von Smid durch ein Wassermolekül, aber nicht durch Na + oder Ca2 + im Grundzustand vorsehen (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Insbesondere nachfolgende kristallographische Studien haben die Zuordnung unserer Bindungsstellen bestätigt (Liao et al., 2016). Somit bestätigte HDX-MS den Ionenbindungsmodus, der durch die rechnerischen und funktionellen Studien vorgeschlagen wurde.

Ionenselektivität einer Li+ -transportierenden NCX-Mutante

Der mitochondriale Na + /Ca2+ -Austauscher (NCLX) weist eine außergewöhnliche Ionenselektivität auf und tauscht Ca2+ entweder mit Na + oder Li+ aus, während NCXs kein Li + transportieren (Palty et al., 2010). Obwohl die physiologische Relevanz dieser Ionenselektivität rätselhaft bleibt, ist bemerkenswert, dass sich 9 (von 12) ionenkoordinierenden Resten in NCLX von denen in NCXS und anderen Mitgliedern der Ca2 + / Kation-Antiporter-Superfamilie unterscheiden. Um zu verstehen, wie sich diese Unterschiede auf die Erkennung und den Transport von Ionenbindungen auswirken, führten wir einen strukturbasierten Ersatz von ionenkoordinierenden Resten in NCX_Mj durch, um die NCLX-Bindungsstellen nachzuahmen (Refaeli et al., 2016). Auffallend ist, dass das neu konzipierte Konstrukt (NCLX_Mj genannt) Na+/Ca2+ und Li+/Ca2+ mit vergleichbaren Km-Werten vermittelt (Refaeli et al., 2016).

Als nächstes wollten wir herausfinden, ob die Ionenbindungsstellen in NCLX_Mj an die von NCX_Mj erinnern (Giladi et al., 2019). HDX-MS-Analysen ioneninduzierter Konformationsänderungen ergaben, dass SCa Na +, Li + oder Ca2 + bindet, während eine oder mehrere zusätzliche Na + / Li + -Stellen von NCLX_Mj mit den ursprünglichen Na + -Stellen (Sext und Sint), die NCX_Mj zugewiesen sind, nicht kompatibel sind. Diese Ergebnisse legen nahe, dass NCLX_Mj Ionen mit einer elektroneutralen Stöchiometrie von 2Na +: 1CA2 + oder 2Li +: 1CA2 + transportieren kann. In Übereinstimmung mit den HDX-MS-Daten beschleunigt das Spannungsklemmen die Na + / Ca2 + -Wechselkurse in NCX_Mj-rekonstituierten Proteoliposomen (aufgrund einer Stöchiometrie von 3Na +:1Ca2+), während es keinen nennenswerten Einfluss auf die Na + /Ca2+ – oder Li+/Ca2+ -Wechselkurse in NCLX_Mj hat (Giladi et al., 2019).Unsere Studien haben den Nutzen von HDX-MS bei der Identifizierung und Validierung von Bindungsstellen in Ionentransportern gezeigt, wo relativ kleine Unterschiede in den ioneninduzierten ΔHDX-Signalen wichtige Informationen über die Ionenselektivität und Konformationsänderungen liefern, die bei der Ionenbindung an verschiedenen Stellen auftreten. In Kombination mit MD-Simulationen und Röntgenkristallographie ist HDX-MS daher besonders attraktiv für die Aufklärung der strukturellen Determinanten der Ionenselektivität und ioneninduzierter Konformationsänderungen in Ionentransportsystemen mit mehreren Ionenbindungsstellen.

Schlussfolgerungen

In den letzten Jahrzehnten hat die Strukturbiologie enorm zu unserem Verständnis der Membranproteinfunktion beigetragen, vor allem durch statische Momentaufnahmen diskreter Zustände in hoher Auflösung. Um die Struktur-Funktions-Beziehungen, die dem komplexen Prozess des gelösten Stofftransports zugrunde liegen, vollständig zu entschlüsseln, wurde eine wachsende Anzahl experimenteller und rechnerischer Methoden entwickelt, um die Lücke zwischen diesen statischen Momentaufnahmen zu schließen und die zugrunde liegenden Konformationslandschaften zu bestimmen. HDX-MS wird zunehmend zur Untersuchung intakter Membranproteine unter verschiedenen nahezu nativen Bedingungen eingesetzt und bietet neuartige Möglichkeiten zur Untersuchung von Membran-Protein-Wechselwirkungen, Substraterkennung und transportbezogenen Konformationsübergängen. Zukünftige Entwicklungen in der Instrumentierung und Datenanalyseautomatisierung können den Einsatz von HDX-MS im Hochdurchsatz ermöglichen und sein Potenzial für die Grundlagenforschung und biomedizinische Anwendungen wie das Arzneimitteldesign voll ausschöpfen.

Autorenbeiträge

MG und DK überprüften die Literatur und schrieben das Manuskript.

Finanzierung

Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (Grant #1351/18) (D.K) und von der Israel Cancer Research Foundation (Grant #19202) (MG) unterstützt. Die finanzielle Unterstützung durch den Shmuel Shalit Award für DK wird dankbar anerkannt.

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.