Experimentell
Kennzeichnung von RuBisCO:
Aedans(454): Donor F(58): Akzeptor
Bindungsstudien:
Begriffe:
ADP bullet: GroEL-Komplex gebunden an GroES und ADP
ApoGroEL: Nur GroEL comlex (verwendet in früheren Bindungsstudien von RuBisCO-Substrat)
Lin et al. bestimmt, dass:
1. Es gab einen Unterschied im BUND bei Substratbindung an den Trans-Ring von ADP-Bullet vs. apoGroEL-Ring.
– Dies wurde durch Quenchen der Donorfluoreszenz (B.)
– Dies zeigte einen Unterschied in der Konformation des Proteinsubstrats an.
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2. Fand eine „passive“ Entfaltung von Substratproteinen, die an den Apogroelring gebunden sind.
– Diese Entfaltung erfolgte jedoch viel langsamer als der funktionelle Reaktionszyklus von GroEL.
3. Es kommt zu einer geringeren „passiven“ Entfaltung des an ADP-Trans-Ring gebundenen Substrats.
– Bestätigt dies mit Protease-Verdauung Studien.
– Dies ist jedoch der physiologisch relevantere Komplex.
– Ist dies also ein maximal wirksames Niveau oder nur der erste Schritt im Reaktionszyklus?
Um die physiologische Relevanz zu testen, fügten sie der ADP-Bullet-Reaktion ATP hinzu und überwachten FRET
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Bei Zugabe von ATP fanden sie: – Eine anfängliche schnelle, erzwungene Konformationsausdehnung des Substrats – und dann eine langsamere Verdichtungsphase – Deutlich in Abbildung b |
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-Abbildung c zeigt an, dass die Kinetik der Verdichtungsphase isdependent auf GroES Konzentration, dh es ist abhängig von
thesequestration Mechanismus des Komplexes.
– Während die Expansionsphase ist unabhängig von GroES Konzentration.
– Es gibt zwei Phasen der Entfaltung:
– Langsame passive Entfaltung aufgrund der Substratbindung an den Transring der GroEL-Kammer (aus dem ersten Bindungsexperiment)
– Schnelle, ATP-gesteuerte Entfaltung aufgrund der Konformationsänderung der GroEL-Kammer.
Die schnelle Entfaltung ist nicht GroES-abhängig:
– Ein Überschuss einer einringigen GroEL-Variante, SR1, wurde als GroES-Falle verwendet.
-SR1 ist nicht in der lage zu binden substrat und katalysieren eine entfaltung reaktion, aber ist in der lage zu binden und sequester GroES zu bestimmen die abhängigkeit ofthe reaktion auf die sequestrierung der substrat.
– Sie stellten fest, dass die durch BUND überwachte schnelle Entfaltung ohne die vorhandene GroES-Kappe auftrat und die anschließende Verdichtungsphase nicht.
– Dies deutet darauf hin, dass die schnelle Expansionsphase von der Konformationsänderung von GroEL abhängt, die durch ATP-Bindung induziert wird.
So .. ist das Entfalten des Substrats für das produktive Falten notwendig?
– Ist dies ein wesentlicher Schritt, und wichtig, GroEL/GroES Klappmechanismus?
– Sie fanden heraus, dass der Anteil der nicht-native RuBisCO, die in auftauchtder native Zustand ist proportional zum Ausmaß der Entfaltung.
– Um dies zu untersuchen, wollten sie die langsame, passive Entfaltung des Substrats aufgrund der GroEL-Bindung allein (nicht ATP
abhängig) messen
– Sie nutzten erneut die SR1-Bindung an das Substrat, diesmal nicht als Atrap, sondern als passiv entfaltende Bindungsstelle für das Substrat.
– Die Inkubationszeit mit SR1 korreliert mit der Entfaltungsmenge, da die Entfaltung NUR auf die Bindung des Substrats zurückzuführen ist.
– Sie stellten fest, dass es eine Korrelation zwischen der Menge der Entfaltung zu nativem Protein gibt.
– Die erzwungene Entfaltung von GroEL / GroES ist also ein effizienter Weg, um den Entfaltungsmechanismus
zu fördern, der für eine ordnungsgemäße Proteinfaltung erforderlich ist.
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