Discussion
Die in dieser Arbeit vorgeschlagene Image cytometry-Methode zeigt die Fähigkeit, Autophagie in lebenden Zellen schnell und effizient zu analysieren, um potenzielle Arzneimittel zu untersuchen, die autophagische Aktivitäten induzieren oder hemmen können, z. B. die Clearance falsch gefalteter Proteine im Zusammenhang mit Neurodegeneration oder die Hemmung von Arzneimittelresistenzen im Zusammenhang mit Krebs. Einschränkungen in den aktuellen Methoden können durch Bildzytometrie und einzigartige Reagenzien überwunden werden, um eine neuartige Methode zum Nachweis der Autophagie zu entwickeln. Das Cellometer Vision wurde bisher für fluoreszierende zellbasierte Assays verwendet (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), und es wurde gezeigt, dass der Cyto-ID-Autophagiefarbstoff Autophagosomen in lebenden Zellen spezifisch färbt. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Cyto-ID-Farbstoff mit RFP-LC3 in ausgehungerten HeLa-Zellen kolokalisiert, was die Spezifität des Farbstoffs weiter validiert. Die entwickelte bildbasierte Autophagie-Detektionsmethode wird durch Vergleich der Autophagie-Aktivitätsergebnisse in nährstoffhungrigen Jurkat-Zellen mit der Standard-Durchflusszytometrie verglichen. Die Ergebnisse zeigten eine Zunahme der Fluoreszenzintensität in nährstoffhungrigen Zellen und eine Abnahme für wiederhergestellte Jurkat-Zellen. Die gemessenen AAF-Werte der Bildzytometrie sind jedoch erheblich höher als die der Durchflusszytometrie, was auf Unterschiede zwischen Instrumentierung und Methoden zurückzuführen sein könnte. Das Cellometer Vision Image Cytometer verwendet ein ladungsgekoppeltes Gerät zur Fluoreszenzmessung, während das FACS Calibur Flow Cytometer eine Photo-Multiplier Tube (PMT) verwendet. Darüber hinaus unterschied sich auch die Methode zur Analyse der Fluoreszenzintensitäten zwischen den beiden Systemen. Das Durchflusszytometer misst die Gesamtfluoreszenzsignale von jeder Zelle, während das bildbasierte System Bilder erfasst und fluoreszenzgefärbte Autophagosomen in den Zellen analysiert, wodurch genauere Messungen der Autophagieaktivität möglich sind. Die Cellometer-Software kann die Fluoreszenz von Zellen analysieren, indem sie die gesamten fluoreszierenden Pixel in jeder Zelle summiert oder nur die Pixel mit hoher Fluoreszenzintensität von Autophagosomen in jeder Zelle misst. Ein weiterer Unterschied könnte durch Scherspannung der Durchflusszytometrie verursacht werden, die die Lebensfähigkeit der Zielzellen beeinflusst (Robey et al., 2011).
Autophagischer Fluss ist auch ein wichtiger Assay für die Entwicklung einer neuartigen Nachweismethode. CQ wird eingesetzt, um den lysosomalen Abbau von Autophagosomen zu hemmen, wobei die autophagische Aktivität für nährstoffhungrige Jurkat-Zellen in Gegenwart von CQ aufgrund der synergistischen Wechselwirkung zwischen den Behandlungen am höchsten wäre. Die nächsthöchste wäre Jurkat Zellen in Hunger ohne CQ. Jurkat-Zellen mit CQ würden aufgrund der Akkumulation von basalen Autophagolysosomen nur einen geringen Anstieg der autophagischen Aktivität im Vergleich zur Kontrolle zeigen. Die Ergebnisse des autophagischen Flusses, die von beiden Instrumenten erhalten wurden, zeigten ähnliche Trends, aber die AAF-Werte, die in der Bildzytometrie gemessen wurden, sind signifikant höher. Diese Ergebnisse zeigten, dass die bildzytometrische Nachweismethode trotz der potenziell instrumentenspezifischen quantitativen Unterschiede in den AAF-Werten leicht zur Untersuchung der Autophagieaktivität implementiert werden konnte.
Um zu zeigen, dass die Bildzytometrie eine potenzielle Screening-Technologie für die Wirkstoffentdeckung sein kann, muss die Fähigkeit zur Analyse von Proben unter mehreren Bedingungen getestet werden. Die Bildzytometrie wird verwendet, um die autophagische Aktivität von Jurkat-Zellen zu messen, die mit Rapamycin in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden, um die Fähigkeit der Bildzytometrie zur Messung von Dosis–Wirkungs-Effekten über einen Zeitraum zu demonstrieren Studie. Als Ergebnis ist die bildbasierte Zytometrie in der Lage, die Unterschiede in der autophagischen Aktivität unter verschiedenen experimentellen Bedingungen zu erkennen. In Fig. 8.6 ist die autophagische Aktivität (gemessen an AAF-Werten) nach 18 h Inkubation am höchsten. Eine leichte Abnahme der AAF-Werte wird zwischen 8 und 4 h Inkubation gezeigt, was darauf zurückzuführen sein kann, dass sich die Zellen nach der anfänglichen medikamentösen Behandlung nicht vollständig erholen können. Darüber hinaus können auch adhärente Zellen wie die humane Prostatakrebszelllinie (PC-3) mit der Bildzytometrie-Methode gemessen werden. Die Bildauflösung von Cellometer Vision kann fluoreszenzmarkierte Autophagosomen (Puncta) analysieren, die sowohl in Fluoreszenzbildern als auch in Fluoreszenzintensitätshistogrammen beobachtet werden.
Es ist auch wichtig, die Fähigkeit zu demonstrieren, verschiedene Arzneimittelverbindungen zu charakterisieren, indem ihr autophagischer Dosis–Wirkungs-Effekt für Arzneimittelentdeckungskampagnen verglichen wird. Dosis-Wirkungs-Effekte von Tamoxifen und Rapamycin werden direkt unter Verwendung der Bildzytometrie verglichen. Die Ergebnisse nach 18-stündiger Inkubation zeigten, dass Rapamycin eine höhere Autophagieaktivität induzierte als Tamoxifen. Es ist wichtig zu beachten, dass Tamoxifen bei 100 µM stark zytotoxisch ist, was nach 18 h Inkubation zum Jurkat-Zelltod und -zerfall führt. Die bildbasierte Überprüfung des Zytotoxizitätseffekts in Tamoxifen bei hoher Konzentration kann sehr nützlich sein, um Unsicherheiten nur aus Streudiagramm- und Histogrammergebnissen zu eliminieren.
Die Bildzytometrie hat vergleichbare Ergebnisse wie die Standarddurchflusszytometrie für die fluoreszenzzellbasierte Analyse gezeigt (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). Die bildbasierte Zytometriemethode kann gegenüber der Durchflusszytometrie mehrere Vorteile bieten. Beispielsweise ist die Anzahl der für jede Probe benötigten Zellen (10-20 µL) deutlich geringer als bei einem herkömmlichen Durchflusszytometer (300-500 µL). Bei der Ersteinrichtung des Durchflusszytometers müssen einige der Zielzellproben für die PMT-Spannungen und die Kompensationseinstellung verwendet werden. Auf der anderen Seite pipettieren viele Bildzytometer Zellen in eine Zählkammer, die mehrmals neu gescannt werden kann. Daher werden Zielzellproben während der anfänglichen Optimierung der Belichtungszeiteinstellung und Fokussierung nicht verschwendet. Noch wichtiger ist, dass der Vorteil der Erfassung von BR- und Fluoreszenzbildern es den Forschern ermöglicht, die erfassten Fluoreszenzdaten visuell zu überprüfen. Dies kann bei der Identifizierung von Zytotoxizität als komplizierende Nebenwirkung eines medikamentösen Behandlungstests helfen, der Autophagie induziert.Die Software kann jedoch das Hintergrundsignal automatisch entfernen, um die tatsächliche Zielfluoreszenz zu erhalten, ohne die AAF-Berechnung zu ändern. Darüber hinaus wird das Photobleaching von Fluoreszenzsonden in zellbasierten Assays minimiert, da Cellometer Vision im Vergleich zu den in anderen Instrumenten verwendeten Hochleistungslasern LEDs mit geringerer Leistung verwendet. Eine zukünftige Verbesserung des Cellometer-Bildzytometers wäre die Entwicklung eines automatisierten Systems mit höherem Durchsatz, das mehr Zellen für eine verbesserte statistische Analyse analysieren kann, sowie die Fähigkeit, mehrere Proben gleichzeitig zu analysieren, was ein zellbasiertes Wirkstoffscreening mit höherem Durchsatz von Inhibitoren und Aktivatoren von Autophagie, Apoptose, Nekrose und anderen physiologischen Phänomenen von Interesse erleichtert.