9 Die Rolle von Proteinen im spleißosomalen katalytischen Kern
Der Vergleich der Größe von snRNAs mit den viel größeren Introns der Gruppe II wirft die Möglichkeit auf, dass mehrere Introndomänen der Gruppe II während der Evolution durch Proteine in den Spleißosomen ersetzt wurden, was zu den modernen Ribonukleoprotein (RNP) -eukaryotischen Spleißmaschinen führte. Obwohl es noch keine Eins-zu-Eins-Korrespondenz gibt, ist es leicht möglich, spleißosomale Proteine zu identifizieren, die eine durch RNA-Elemente vermittelte Funktion in Introns der Gruppe II erfüllen. Beispielsweise initiieren und stabilisieren eine Reihe von U2-assoziierten Proteinen die U2–snRNA-Verzweigungsstelleninteraktion (Abb. 6.3).5,85 In Introns der Gruppe II ist das U2-Äquivalent (Teil der Domäne VI) über eine hyperstable Haarnadelschleife kovalent mit der Verzweigungsstelle verbunden, was die Bildung und Stabilität ihrer Wechselwirkung gewährleistet (Abb. 6.2). Aus dieser evolutionären Perspektive ist es nicht verwunderlich, dass ein großer Teil der spliceosomalen Proteine direkt mit einer snRNA assoziiert ist und diese häufig in ihrer Funktion unterstützt.5,85 Viele spleißosomale Proteine sind jedoch an regulatorischen Funktionen beteiligt, die im Zusammenhang mit einem selbstspleißenden Intron nicht erforderlich sind, und sind wahrscheinlich neuere Ergänzungen des spleißosomalen Proteinkomplements.Wie oben erwähnt, wird angenommen, dass der letzte gemeinsame Vorfahr der Eukaryoten ein hochentwickeltes, voll funktionsfähiges Spleißosom hatte, das denen in modernen Eukaryoten ähnelte.1,2 Obwohl dieses Spleißosom im Vergleich zu den kleinsten modernen Spleißosomen wahrscheinlich deutlich weniger Komponenten enthielt, deuten die Daten darauf hin, dass die meisten Schlüsselkomponenten in den frühesten Versionen der Spleißosomen vorhanden waren.1-4 Tatsächlich zeigt eine Teilmenge des spleißosomalen Proteoms, die Proteine enthält, die mit dem katalytischen Kern assoziiert sind, ein signifikantes Maß an Konservierung bei verschiedenen eukaryotischen Spezies, wobei eine Reihe von spleißosomalen Proteinen zu den am besten konservierten zellulären Proteinen gehört.85,86
Wie oben erwähnt, sind viele gut charakterisierte Ribozyme in vivo mit Proteinen assoziiert, die ihre katalytische Aktivität durch mehrere bekannte Mechanismen verbessern.83 Dazu gehören die Stabilisierung der funktionellen Struktur der RNAs, die Unterstützung bei der Bindung und Positionierung der Substrate und die Unterstützung bei der Bindung funktionell wichtiger Metallionen. Eine direkte Beteiligung an der Katalyse wurde jedoch bisher für keines der untersuchten Ribozym-assoziierten Proteine beobachtet.83,87 Geht man davon aus, dass das Spleißosom ein RNA-Enzym ist, so sind die spleißosomalen snRNAs in vielerlei Hinsicht ungewöhnliche Ribozyme. Vielleicht am wichtigsten, Sie sind ungewöhnlich klein für ein Ribozym, das die Spaltung von Phosphodiesterbindungen über die Aktivierung eines nicht benachbarten Nukleophils katalysiert. Andere natürliche Ribozyme, die solche Reaktionen katalysieren, nämlich Introns der Gruppen I und II und RNase P, sind mindestens doppelt so lang wie die kombinierte Länge menschlicher U6- und U2-snRNAs. Diese Ribozyme sind auch viel größer als die nukleolytischen Ribozyme, die ein angrenzendes 2′-Hydroxylnukleophil für die Spaltung von Phosphodiesterbindungen aktivieren.24,88,89 Es wird angenommen, dass die größere Größe es diesen Ribozymen ermöglicht, sich zu komplexen Strukturen zu falten, die durch mehrere tertiäre Wechselwirkungen stabilisiert werden, was es ihnen wiederum ermöglicht, hochentwickelte aktive Stellen zu schaffen, die in der Lage sind, die Spaltstelle, die Metallionen der aktiven Stelle und das entfernte Nukleophil für den nukleophilen Inline-Angriff genau zu positionieren. Es ist denkbar, dass U6- und U2-snRNAs aufgrund ihrer kurzen Länge bestenfalls ein ineffizientes Spleißribozym bilden, das andere spleißosomale Faktoren zur stabilen Positionierung der aktiven Websitelemente und der reagierenden Gruppen benötigt.Es wird angenommen, dass Prp8, das am besten konservierte spleißosomale Protein, eine solche Rolle im spleißosomalen aktiven Zentrum spielt. Prp8 ist wohl das interessanteste der spliceosomalen Proteine, da es mit 61% Identität zwischen Hefe und Mensch ungewöhnlich konserviert ist.86 Es hat jedoch nur wenige klar unterscheidbare funktionelle Motive in seiner Länge von ~ 2300 Aminosäuren, und die bisher erkannten funktionellen Domänen sind degeneriert und erfüllen wahrscheinlich Funktionen, die nichts mit der zellulären Rolle des ursprünglichen Gründungsmotivs zu tun haben.86 Andererseits spielt Prp8 eindeutig eine sehr kritische Rolle im spleißosomalen aktiven Zentrum. Es wurde zusätzlich zu U5- und U6-snRNAs mit den 5′- und 3′-Spleißstellen und der Verzweigungsstelle von Prämessenger-RNAs vernetzt, was darauf hinweist, dass es im spleißosomalen katalytischen Kern vorhanden ist und direkt mit den kritischen Akteuren in der Spleißreaktion in Kontakt steht.86,90 Ferner wurde gezeigt, dass Prp8 mit mehreren wichtigen spliceosomalen Proteinen wie Snu114 und Brr2 interagiert (siehe unten).86,91,92
Mutationen in Prp8 sind mit einem breiten Spektrum von spleißosomalen Defekten assoziiert, einschließlich Veränderungen in der Fähigkeit von Spleißosomen, suboptimale Spleißstellen abzustoßen, und Unterdrückung von Defekten, die durch Mutationen in anderen spleißosomalen Faktoren wie Prp28, Brr2, U4 und U6 snRNAs verursacht werden.86,93,94 Eine Teilmenge von Prp8-Mutanten moduliert selektiv die Effizienz entweder des ersten oder des zweiten Schritts des Spleißens, insbesondere in suboptimalen Substraten.58,86,95-97 Diese Beobachtungen lassen sich am besten durch eine Hypothese erklären, die besagt, dass Prp8 an der Stabilisierung alternativer, sich gegenseitig ausschließender Konformationen des aktiven Zentrums beteiligt ist, die entweder für die Katalyse des ersten oder des zweiten Schritts des Spleißens bereit sind, und dass bestimmte Prp8-Mutanten zu einer selektiven Hyperstabilisierung eines dieser Zustände führen können.58,96,98 Während signifikante Beweise darauf hindeuten, dass Prp8 wahrscheinlich an der Positionierung der Substrate und der Stabilisierung des aktiven Zentrums beteiligt ist, gibt es derzeit keine direkten Beweise, die seine zusätzliche Beteiligung an der Metallionenkoordination oder die direkte Beteiligung an der Spleißosomenkatalyse nahelegen oder widerlegen.
Diese Unsicherheit rührt daher, dass nur sehr wenig über die Funktionsweise von Prp8 bekannt ist. Ein innovativer Transposon-vermittelter Screening-Assay zeigte, dass große Regionen von Prp8 sehr empfindlich auf die Insertion von Transposons reagieren und wahrscheinlich als eine einzige strukturelle Einheit fungieren, obwohl es möglich war, Transposons einzufügen oder sogar Prp8 in zwei Fragmente an einer Reihe von anderen Positionen ohne den Verlust der Lebensfähigkeit zu teilen.90,92 Abgesehen von einem degenerierten nuklearen Lokalisierungssignal in der Nähe seines N-Terminus und einem degenerierten RRM-Motiv (RNA Recognition Motif) in der Mitte des Proteins wurden in diesem ~ 2300 Aminosäuren langen Protein nur zwei weitere funktionelle Domänen identifiziert.86
Eine degenerierte Variante der MPN / Jab1-Domäne, die mit deubiquitinierenden Enzymen assoziiert ist, befindet sich in der Nähe des C-Terminus von Prp8.86 Die Analyse der hochauflösenden Struktur eines Prp8-Fragments, das diese Domäne enthält, hat gezeigt, dass die Metallionenbindungsstelle des Isopeptidasezentrums beeinträchtigt ist und daher wahrscheinlich nicht als deubiquitinierendes Enzym fungiert.99.100 In vitro konnte ein Fragment von Prp8, das diese Domäne enthielt, direkt an Ubiquitin mit einer Affinität binden, die mit anderen bekannten Ubiquitin-bindenden Proteinen vergleichbar war.101 Mehrere bekannte Prp8-Mutationen, die das Spleißen störten, störten auch die In-vitro-Ubiquitinbindung, wodurch die Möglichkeit einer funktionellen Rolle der Ubiquitinierung bei der Spleißregulation erhöht wurde. Wichtig, proteomische Analysen haben gezeigt, dass mehrere spliceosomale Faktoren, einschließlich Sad1, Snu114, Rse1, und Prp8 selbst, sind in vivo ubiquitiniert, und darüber hinaus zeigt das spliceosomale Kernprotein Prp19 E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität in vitro.101-105 Ferner spielt Ubiquitin eine Rolle bei der Bildung und Aufrechterhaltung von Tri-snRNP, möglicherweise durch Modulation der Prp8-vermittelten Regulation der Funktion von Brr2.102 Alternativ ist es auch möglich, dass die MPN / Jab1–Domäne als Protein-Protein-Interaktionsplattform fungiert. Eine Reihe von Mutationen in Prp8, die in diese Domäne fallen, führen zur erblichen Erblindung Retinitis pigmentosa,86 und diese Mutationen schwächten die Wechselwirkung von Prp8 mit Brr2 und Snu114.99
Die hochauflösende Struktur eines weiteren Fragments von Prp8 wurde bestimmt, das eine hochkonservierte Region (69% Aminosäureidentität zwischen Hefe und Mensch) in der Nähe seiner C-terminalen Domäne umfasst. Die Analyse der Struktur ergab das Vorhandensein eines β-Haarnadelfingers, der denen in ribosomalen Proteinen ähnelt, und einer degenerierten RNase-H-ähnlichen Domäne.106-108 Während die Gesamtgeometrie des RNase H-ähnlichen Motivs auf der Ebene der Sekundär- und Tertiärstruktur gut konserviert war, zeigte die Primärsequenz einen viel geringeren Konservierungsgrad und nur einer der drei katalytischen Reste ist am aktiven Zentrum vorhanden. Der konservierte Rest, ein Aspartat, ist an der Koordination zweier katalytischer Metallionen im aktiven Zentrum kanonischer RNase-H-Domänen beteiligt. In einer Studie führte die Mutation dieses Rückstands in Prp8 in Hefe zu keinem nachweisbaren Wachstumsdefekt, was auf Redundanz oder das Fehlen einer kritischen Funktion hindeuten könnte.108 In einer anderen Studie konnte seine Wirkung nicht untersucht werden, da die Mutation eine Fehlfaltung des Proteinfragments induzierte.107 Es wurde keine Metallionenbindung durch die Region beobachtet, die dem aktiven Zentrum der RNase-H-Domäne entspricht, wenn die Kristalle in bis zu 200 mM MgCl2 gezüchtet wurden, was darauf hinweist, dass dem degenerierten aktiven Zentrum die Metallionenbindungsfähigkeit fehlt. Ferner zeigte das diese Domäne enthaltende Fragment von Prp8 eine sehr schwache RNA-Bindungsfähigkeit mit einer Kd von 20 µM bis über 200 µM in Abhängigkeit von der getesteten RNA-Spezies.106-108 Obwohl das Fragment eine sehr geringe Affinität zur Bindung von RNAs zeigte, zeigte es eine Präferenz für die Bindung von Duplex-RNAs mit Vier-Wege-Übergängen.108 In aktivierten menschlichen Spleißosomen wird vorausgesagt, dass U2- und U6-snRNAs eine solche Struktur bilden.53,69 Was diese RNase H-ähnliche Domäne besonders interessant machte, war, dass die Aminosäuren, die ihrem aktiven Zentrum entsprechen, neben Resten in Prp8 positioniert sind, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie in präkatalytischen Spleißosomen mit der 5′-Spleißstelle vernetzen.109 Die Effizienz der Bildung dieser Vernetzung wurde jedoch verringert, als die präkatalytischen Spleißosomen fortschritten, um katalytisch aktive Spleißosomenkomplexe zu werden.109 Die beobachtete Abnahme der Vernetzungseffizienz könnte dahingehend interpretiert werden, dass diese Wechselwirkung in aktivierten Spleißosomen gestört ist. Alternativ kann die Wechselwirkung bestehen bleiben, aber die Bildung der Vernetzung selbst wird aufgrund einer geringfügigen Änderung der Umgebung der vernetzten Reste aufgehoben. Wenn diese degenerierte RNase H-ähnliche Domäne tatsächlich in der Nähe der 5′-Spleißstelle in katalytisch aktiven Spleißosomen positioniert ist, ist es möglich, dass sie an der Stabilisierung der aktiven Konformation der snRNAs, der Positionierung der Substrate im aktiven Zentrum und / oder der Koordination katalytischer Metallionen beteiligt ist. Während die Domäne selbst keine RNA oder Metallionen binden kann, ist es möglich, dass sie in Gegenwart anderer Elemente des aktiven Zentrums Teil des Substrats oder der Metallionenbindungstaschen bildet. Trotz dieser faszinierenden Möglichkeiten bleibt die Rolle von Prp8 bei der Spleißosomenkatalyse ungewiss.