Die Aktivierung von T-Zellen induziert die Expression von CD25 und Foxp3 im Zusammenhang mit der Differenzierung von Effektor- und Gedächtnisphänotypen
PBMC wurden mit Bryostatin-1 (5 nM) stimuliert und ionomycin (1 µM) (B/I) in Gegenwart von 80 U/ml IL-2 (Peprotech) für 16 h. Die B / I-Aktivierung ahmt intrazelluläre Signale nach, die zu einer T-Zell-Aktivierung führen, indem die Proteinkinase C-Aktivität bzw. das intrazelluläre Calcium erhöht werden. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und bei 106 Zellen/ml in Komplettmedium mit 40 U/ml IL-2 (Peprotech) für 3 Tage kultiviert und die Expression von Foxp3 mittels durchflusszytometrischer Analyse bestimmt. Die Expression von FoxP3 wurde auch an frisch isolierten T-Zellen am Tag 0 bestimmt. Wie in Fig. 1A (obere Tafel), Anwesenheit von IL-2 allein für 3 Tage erhöhte die Expression von Foxp3 oder CD25 nicht signifikant über den Ausgangswerten an Tag 0 (Abb. 1C). Die B/I-Aktivierung induzierte jedoch die Foxp3- und CD25-Expression in CD4+ – und CD8+ -T-Zellen (Abb. 1A, mittlere Platte). Bei B / I-Aktivierung waren CD4 + CD25 + Foxp3 + T-Zellen von 1% auf 23% (P = 0,016) und CD8 + CD25 + Foxp3 + T-Zellen von 0,6% auf 9% (P = 0,013) erhöht. Die Verlängerung der Kultur in Gegenwart von IL-2 für 6 Tage ohne weitere Stimulation hielt CD4 + CD25 + Foxp3 + T-Zellen über den Ausgangswerten in nicht aktivierten T-Zellen (1% vs. 7%; P = 0,031), während CD8 + CD25 + Foxp3 + T-Zellen auf Ausgangswerte fielen (0,6%). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die aktivierungsinduzierte Expression von Foxp3 in CD4 + CD25 + T-Zellen stabiler ist als in CD8 + CD25 + T-Zellen. Die absolute Anzahl der T-Zellen erhöhte sich 3 und 6 Tage nach der B/I-Stimulation und Expansion in Gegenwart von IL-2 (Abb. 1B). Die Aktivierung von T-Zellen mittels Anti-CD3/CD28 Abs für 3 Tage ergab ähnliche Ergebnisse wie bei der B/I-Aktivierung durch Erhöhung von CD4 +CD25+ FoxP3+ T-Zellen von 0,4% auf 8,7% (Abb. 1C). Phänotypanalysen von T-Zellen ergaben CD44+ Effektor- und CD44+CD62L+ Memory-Phänotypen vor und 6 Tage nach der B/I-Aktivierung (Abb. 1D, obere Platte). Während Effektor-CD4 + – und CD8 + -T-Zellen nach Aktivierung reduziert waren (18% bis 9% bzw. 21% bis 13%), waren Speicher-CD4 + – und CD8 + -T-Zellen erhöht (82% bis 91% bzw. 79% bis 87%). Bei B / I-Aktivierung zeigten CD4 + T-Zellen einen 6-fachen Anstieg der FoxP3-Expression in CD44 +, CD62L + Phänotypen (CD44 +: 2,6% bis 15%; CD62L +: 2% bis 12%). Darüber hinaus zeigten sowohl CD4+- als auch CD8+ -T-Zellen nach Aktivierung eine FoxP3high-Expression im Vergleich zu einer FoxP3low-Expression am Tag 0 (Abb. 1D, Mittel- und Bodenplatte). Alle CD4+Foxp3+ T-Zellen exprimierten CD44, von denen 80% auch CD62L exprimierten (Abb. 1D, mittleres Feld, ganz rechts). Diese Daten zeigen, dass 20% der CD4 + Foxp3 + T-Zellen Effektor- und 80% Gedächtnisphänotypen sind. Ein ähnlicher phänotypischer Trend wurde für CD8 + Foxp3 + T-Zellen festgestellt, wobei 100% CD44 + zeigten, von denen 67% CD62L + T-Zellen waren (Abb. 1D, Bodenplatte, ganz rechts). Diese Ergebnisse zeigen, dass 33% der CD8 + Foxp3 + T-Zellen Effektor- und 67% Gedächtnisphänotypen sind. Die in den Fig. 1A-D legen nahe, dass eine erhöhte Expression von FoxP3high in Effektor-T-Zellen eher auf die Zelldifferenzierung als auf die Zellproliferation zurückzuführen ist, da der relative Prozentsatz der CD44 + CD62L- Effektor-T-Zellen nach B / I-Aktivierung abnahm. Ein ähnlicher Mechanismus kann in Gedächtnis-T-Zellen aufgrund der Expression von FoxP3high nach Aktivierung im Vergleich zu FoxP3low am Tag 0 bestehen.
Foxp3-Expression nach T-Zell-Aktivierung. T-Zellen wurden von gesunden Freiwilligen isoliert und in zwei Gruppen aufgeteilt. Eine Kontrollgruppe blieb unaktiviert und kultivierte in Gegenwart von IL-2 für 3 Tage (A; obere Platte) und eine andere Gruppe wurde mit B/I für 16 h aktiviert und kultivierte in Gegenwart von IL-2 für 3 Tage (A; mittlere Platte) oder 6 Tage (A; untere Platte). Die absolute Anzahl der CD4 + – und CD8 + -T-Zellen auf gepoolten Proben wurde an den Tagen 0, 3 und 6 nach der Kultur durch Durchflusszytometrieanalyse bestimmt (B). Die Expression von FoxP3 und CD25 wurde in frisch isolierten CD4+T-Zellen (Tag 0) und nach einer 3-tägigen Stimulation mit Anti-CD3/CD28 Abs (C) bestimmt. Frisch isolierte und B / I-aktivierte T-Zellen wurden einer Durchflusszytometrie unterzogen, um T-Zell-Phänotypen zu bestimmen (D; obere Platte); Foxp3 + -Effektor- und Speicher-T-Zellen wurden in Gated CD4 + Foxp3 + -Zellen oder Gated CD8 + Foxp3 + -Zellen (D; untere Platte) bestimmt. Repräsentative Daten werden von zwei Spendern in Doppelexperimenten gezeigt.
Die aktivierungsinduzierte FoxP3-Expression in CD4+ T-Zellen kann in vitro keine regulatorische Funktion vermitteln
T-Zellen wurden mit CFSE markiert und mit Anti-CD3 (1 ug/ml) und Anti-CD28 (1 ug/ml) Abs in Gegenwart oder Abwesenheit des B/I-aktivierten CD4+CD25+FoxP3+ T-Zellen (2: 1 und 20:1 Responder:Suppressor-Verhältnisse) für 3 Tage. Die Durchflusszytometrieanalyse zeigte ähnliche Proliferationsraten von gated CD8 + T-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von induzierbaren FoxP3 + T-Zellen (Abb. 2A, 60% vs. 61% und 65%). Die CD3 / CD28-Aktivierung induzierte auch die FoxP3-Expression in Responder-CD4 + -T-Zellen. Gated CD4 + FpxP3 + T-Zellen zeigten auch 70-75% Proliferation bei Aktivierung (Abb. 2A). Die Analyse der T-Zell-Apoptose ergab ähnliche Apoptoseraten bei Responder-T-Zellen in Abwesenheit oder Anwesenheit von CD4 + FoxP3 + T-Zellen (Abb. 2B, 57% vs. 57 und 59%). Die Mehrheit der B / I-aktivierten CD4 + FoxP3 + T-Zellen (74-76%) erwies sich während der Anti-CD3 / CD28-Aktivierung in Kokultur mit Responder-T-Zellen als apoptotisch.
T-Zell-Proliferation in Gegenwart von induzierbaren CD4+FoxP3+ T-Zellen. Zur Durchführung eines Co-Kultur-Suppression-Assays wurden Responder-T-Zellen mit CFSE markiert und in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Verhältnisse von induzierbaren FoxP3 + -T-Zellen (20: 1 und 2:1) für 3 Tage in Gegenwart von Anti-CD3/CD28-Abs kultiviert. Gated CD8 + T-Zellen zeigten CFSE-Verdünnung (A, linke Tafel). Responder-CD4 + -T-Zellen, die FoxP3 aufgrund einer 3-tägigen Aktivierung exprimierten, wurden ebenfalls gated und auf CFSE-Verdünnung analysiert (A, rechte Tafel). Zellen, die aus einem Co-Kultur-Suppression-Assay (A, linkes Panel) erhalten wurden, wurden ebenfalls für Annexin V gefärbt, um die Apoptose in Responder-CD8 + T-Zellen (B, linkes Panel) und den B / I-aktivierten CD4 + FoxP3 + T-Zellen (B, rechtes Panel) zu bestimmen.
Die allogene Aktivierung von T-Zellen während der MLR induziert die Foxp3-Expression in CD4 + CD25+ -T-Zellen, die mit dem Effektor / Gedächtnis-Phänotyp assoziiert sind
Wir führten eine 8-tägige allogene MLR durch, um festzustellen, ob die Induktion der Foxp3-Expression in T-Zellen während der MLR stabil war und ob eine solche induzierte Foxp3 + -Expression die T-Zellproliferation hemmen könnte. Responder- und Stimulatorzellen wurden von verschiedenen gesunden Spendern erhalten. Stimulatorzellen wurden bestrahlt (5000 rad) und mit Responderzellen für 8 Tage in Gegenwart von 10 µM BrdU (BD Pharmingen) kultiviert. Die Zellen wurden dann mit relevantem Abs angefärbt und einer durchflusszytometrischen Analyse unterzogen. Wie in Fig. 3A (obere Platte) 86% der CD4 + CD25 + T-Zellen und 93% der CD8 + CD25+ T-Zellen zeigten einen BrdU-Einbau als Folge der Zellproliferation. In den Responder- oder Stimulatorzellen allein wurde keine Proliferation nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Eine solche allogene Proliferation fand in Gegenwart einer aktivierungsinduzierten Foxp3-Expression in CD4+T-Zellen statt, so dass 8% der CD4+ T-Zellen CD25+Foxp3+ waren (Fig. 3A, Bodenplatte). CD8 + CD25 + T-Zellen hingegen zeigten keine stabile Expression von Foxp3. Diese Ergebnisse stimmen mit unserer Beobachtung in Fig. 1 zeigt, dass die Expression von Foxp3 in CD4 + T-Zellen 6-8 Tage nach der T-Zell-Aktivierung stabiler ist als in CD8 + T-Zellen. In früheren Berichten wurden suppressive Assays in vitro in Gegenwart von hohen Verhältnissen von CD4 + CD25 + T-Zellen (Tregs) zu Responderzellen durchgeführt, um die suppressive Funktion der T-Zellaktivierung und -proliferation zu bestimmen. Eine solche künstliche Erhöhung des Verhältnisses von CD4 + CD25 + T-Zellen zu Responderzellen würde die In-vivo-Validität der Beobachtung verringern. Die Häufigkeit von CD4 + CD25 + Foxp3 + T-Zellen, die während der MLR induziert wurden, betrug 8%, was als innerhalb des physiologisch relevanten Bereichs angesehen wird, wie von anderen Gruppen berichtet . Die Häufigkeit natürlich vorkommender Tregs in Mäusen liegt ebenfalls in diesem Bereich, hat jedoch regulatorische Auswirkungen auf die Hemmung der Autoimmunität. Wenn Foxp3, das CD4 + T-Zellen exprimiert, eine regulatorische Funktion hatte, sollte es die Zellproliferation während der Kultur in vitro gehemmt haben. Ähnlich wie bei der B / I-induzierten T-Zell-Aktivierung umfassten die T-Zell-Phänotypen in einer MLR CD44 + -Effektor (16%) und CD44 + CD62L + -Speicher-T-Zellen (84%) (Abb. 3B). Wiederum exprimierten alle CD4 + Foxp3+ T-Zellen CD44, von denen 90% auch CD62L exprimierten (Fig. 2B). Diese Daten zeigen, dass 10% der CD4 + Foxp3 + T-Zellen Effektor- und 90% Gedächtnisphänotypen sind. Ein ähnlicher phänotypischer Trend wurde für CD8 + Foxp3 + T-Zellen festgestellt und zeigte 100% CD44 +, von denen 76% CD62L + T-Zellen waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass 24% der CD8 + Foxp3 + T-Zellen Effektor- und 76% Gedächtnisphänotypen sind. Das Fehlen einer regulatorischen Funktion in diesen Foxp3 + T-Zellen kann auf ihren Effektor / Gedächtnis-Phänotyp zurückzuführen sein, da berichtet wurde, dass die Expression von Foxp3 in menschlichen Gedächtnis-T-Zellen zu einer verminderten Suppressoraktivität führte . Darüber hinaus verleihen Treg-Typ-1-Zellen (Tr1) Suppressorfunktion in Abwesenheit von FoxP3-Expression . Angesichts der Rolle von Foxp3 als Hauptregulator für das Engagement und die Aufrechterhaltung der Treg-Linie in der Maus scheint es keine so gute regulatorische Funktion für das Engagement der Treg-Linie in menschlichen T-Zellen zu haben.
Foxp3-Ausdruck nach allogener MLR. Die Zellen wurden nach einer 8-tägigen MLR durchflusszytometrisch analysiert. Der BrdU-Einbau wurde an gated CD4+CD25+ oder CD8+CD25+ T-Zellen (A; obere Platte) bestimmt. Gated CD4 + oder CD8 + T-Zellen wurden zum Nachweis von CD25 + Foxp3 + -Zellen analysiert (A; Bodenplatte). Gated CD4 + T-Zellen (B; obere Platte) oder CD8 + T-Zellen (B; untere Platte) wurden auf die Expression von CD44, CD62L, Foxp3 analysiert. Die CD44+ und CD62L+ T-Zellen wurden durch Gating auf CD4+Foxp3+ oder CD8+Foxp3+ T-Zellen bestimmt. Repräsentative Daten werden von zwei Spendern in Doppelexperimenten gezeigt.