4.3 BBB-crossing bsAbs engineered with single-domain antibodies
sdAbs sind kleine (15 kDa), monomere Antigen-bindende Fragmente von Antikörpern, die verschiedene Vorteile gegenüber anderen Antikörperfragmenten als „Bausteine“ für bsAbs bieten. Sie kommen in der Natur als antigenbindender Anteil von schwerkettigen Antikörpern in Kamelidenarten (VHH genannt) und Knorpelfischen (VNAR genannt) vor oder können aus herkömmlichen IgGs durch Gewinnung oder Engineering monomerer, stabiler VH- oder VL-Domänen erzeugt werden (Hamers-Casterman et al., 1993; Hussack et al., 2012; Kim et al., 2014; Nuttall, 2012; Ward, Güssow, Griffiths, Jones, & Winter, 1989). sdAbs sind hochstabil und kompakt und können auf vertiefte Epitope in Proteinen zugreifen, wie Rezeptorhohlräume oder die aktiven Stellen von Enzymen, die häufig vor herkömmlichen IgGs „verborgen“ sind und Zielbindungsaffinitäten erreichen können, die mit denen herkömmlicher Antikörper vergleichbar sind (Lauwereys et al., 1998; Staus et al., 2014). Diese monomeren Antigen-bindenden Einheiten paaren sich nicht mit leichten Ketten, was sie zu hervorragenden Bausteinen für heterodimerisierte bsAbs macht, da sie Schwierigkeiten bei der unsachgemäßen Paarung von leichten Ketten vermeiden (Hamers-Casterman et al., 1993; Saerens, Ghassabeh, & Muyldermans, 2008). Heterodimere bsAbs können mit einem oder beiden „Armen“ als sdAb erzeugt werden, wobei letztere in ihrer Struktur kameliden schwerkettigen Antikörpern ähnlich sind (Abb. 3E). sdAbs können auch in verschiedenen mono-, bi- oder tetravalenten Fusionen mit herkömmlichen therapeutischen Antikörpern oder Fabs verwendet werden (Abb. 3E), was im Allgemeinen zu kleineren, weniger komplexen Molekülen führt, verglichen mit solchen, die mit scFvs oder Fabs als Bausteinen erzeugt werden, die sich biophysikalisch gut verhalten und leicht herzustellen sind (Holliger & Hudson, 2005). Die Humanisierung von VHHs sowie das Engineering von sdAbs sind gut beschrieben, so dass humane (isierte) sdAbs mit optimaler Zielaffinität und außergewöhnlichen biophysikalischen Eigenschaften leicht erzeugt werden können (Vincke et al., 2009).
Um die mögliche Verwendung des Camelid VHH FC5 als BBB-Träger innerhalb bispezifischer ZNS-Targeting-Antikörper zu evaluieren, wurden monovalente und bivalente Fusionen (N- und C-Terminus) von FC5 mit humanem Fc entworfen und in vitro und in vivo evaluiert (Farrington et al., 2014). Die scheinbare Bindungsaffinität (Kdapp) zum BEC der bivalenten FC5Fc-Fusion betrug 75 nM, während die monovalente FC5Fc-Bindung im mikromolaren Bereich lag. Die Analysen der scheinbaren Transmigrationsraten (Papp) in einem In-vitro-BBB-Modell, der scheinbaren ZNS-Exposition, die aus der Serum / LIQUOR-Pharmakokinetik systemisch verabreichter Antikörperkonstrukte abgeleitet wurde, und der pharmakologischen Reaktionen, die durch chemisch konjugierte BBB-undurchlässige neuroaktive Peptide im Hargreaves-Schmerzmodell hervorgerufen wurden, lieferten den Nachweis eines verstärkten BBB-Transports dieser großen (75 kDa) Antikörpermoleküle vermittelt durch FC5: (1) Die In-vitro-Papp-Werte betrugen ~ 200 cm / min für mono- und bivalente FC5Fc) im Vergleich zu 4-8 cm/min für Control VHH A20.1Fc- oder EG2Fc-Fusionen; (2) Die scheinbare ZNS-Exposition der FC5Fc–Fusion war im Vergleich zu Antikörper-Fc–Fusionen der Kontrolldomäne 30-fach höher; (3) Die systemische pharmakologische Wirksamkeit von FC5Fc-Konjugaten mit den Neuropeptiden Dalargin oder Galanin im Modell für entzündliche Schmerzen von Hargreaves war im Vergleich zu monomeren FC5-Neuropeptid-Konjugaten bis zu 60-fach höher. Dieses Ergebnis wurde der langen Kreislaufhalbwertszeit (~ 96 h) von FC5Fc im Vergleich zu FC5-Neuropeptidkonjugaten zugeschrieben; (4) Verschiedene Kontroll-VHH-Fc-Neuropeptidkonjugate zeigten keine systemische Wirksamkeit; (5) die Fusion von FC5 mit dem C-Terminus von Fc führte zu einer abgeschwächten BBB-Kreuzungskapazität. Im Gegensatz zu TfR-Targeting-BBB-Carrier-Antikörpern zeigten sowohl mono- als auch bivalente FC5Fc-Fusionsproteine eine ähnliche Transzytoserate in vitro, ähnliche Plasma / CSF-pharmakokinetische Profile und ähnliche systemische Potenz im pharmakodynamischen Modell in vivo, trotz Unterschieden in scheinbarer Bindungsaffinität und Wertigkeit (Farrington et al., 2014). Diese Studien zeigten, dass der BBB-kreuzende Single-Domain-Antikörper FC5 als Plattform-BBB-Träger sowohl in heterodimerisierten „Halb-Antikörpern“ als auch als leichter skalierbare bi- oder tetravalente Fusion zu konventionellen IgGs verwendet werden kann (Farrington et al., 2014).
Ein weiterer potenzieller Vorteil von VHHs als BBB-Träger ist ihre natürliche Resistenz gegen extreme biophysikalische Herausforderungen wie Temperatur und pH-Wert sowie gegen Proteaseabbau (Kim et al., 2014), häufig in verschiedenen endozytischen Kompartimenten während der Transzytose anzutreffen. Sowohl FC5- als auch FC5Fc-Fusionen werden über clathrinbeschichtete Vesikel in BEC internalisiert und zu frühen Endosomen sortiert. Interessanterweise stimulierte FC5 auch die Ausscheidung extrazellulärer Mikrovesikel (Exosomen) aus BEC (Haqqani, Caram-Salas, et al., 2013; Haqqani, Delaney, et al., 2013), in denen sowohl FC5 als auch erhöhte Spiegel seines mutmaßlichen Rezeptors Cdc50A durch Western Blot und gezielte Massenspektrometrie nachgewiesen wurden. Diese Studie legte nahe, dass die Exosomen das letzte Vesikel des RMT-Signalwegs sein könnten, das von der abluminalen Oberfläche freigesetzt wird, die den Rezeptor-Antikörper-Komplex trägt (schematisch in Abb. 4). Der RMT-Signalweg und die Exosomenbildung weisen einige bemerkenswerte Ähnlichkeiten auf. Wie in der ersten Entdeckung von Exosomen beschrieben, wurde ein Anti-TfR-Antikörper elektronenmikroskopisch in Retikulozyten (Théry, 2011) von der Oberfläche der Zellen in Clathrin-beschichtete Gruben innerhalb früher Endosomen, auf der Oberfläche innerer Vesikel multivesikulärer Endosomen und schließlich auf den freigesetzten Exosomen nach Fusion der multivesikulären Endosomen mit der Plasmamembran verfolgt (Abb. 4). RMT scheint sich auf ähnliche Weise zu entfalten, und es wurde gezeigt, dass die BEC-extrazellulären Mikrovesikel mehrere Rezeptoren enthalten, von denen bekannt ist, dass sie Makromoleküle über RMT über die BBB transportieren, einschließlich TfR, LRPs, LDLR und IR (Haqqani, Delaney, et al., 2013).
Aus den beschriebenen Studien sollte ersichtlich sein, dass der BBB-Trägerarm von ZNS-Targeting-BsaB eine sorgfältige Optimierung für jeden RMT-Rezeptor erfordert. Wichtige Überlegungen beim Design von ZNS-Targeting-bsAbs werden im Folgenden im Hinblick auf „Lessons-learned“ aus der TfR-BACE1-Bsabentwicklung und aus unserer eigenen Arbeit mit FC5 als BBB-Carrier-Antikörper diskutiert.