Die Aktivierung der Phoshorylase-Kinase erfordert die Phosphorylierung der β-Untereinheit durch die Proteinkinase A und das Binden von Ca2+ an die δ-Untereinheit.
Das Enzym wird durch zwei Prozesse reguliert: durch reversible Phosphorylierung und durch allosterische Regulation.
Bei ersterem spielt die Proteinkinase A (PKA) eine entscheidende Rolle. Diese überträgt eine Phosphatgruppe auf die β-Untereinheit der zunächst schwach aktiven Phophorylase-Kinase. Dies hat zur Folge, dass das Aktivitätslevel der Kinase gesteigert wird. Die PKA selbst wird von einer inaktiven Form durch einen second messenger, cAMP, aktiviert. Ein Grund für cAMP-Freisetzung ist das Vorhandensein von Hormonen wie Adrenalin und Glucagon.
Die Phoshorylase-Kinase kann aber auch in eine teilweise aktive Form durch einen erhöhten Ca2+-Spiegel aktiviert werden. Als Calciumsensor dient Calmodulin, das der δ-Untereinheit des Enzyms entspricht.
Wenn sowohl die β-Untereinheit der Phosphorylase-Kinase in einer phosphorylierten Form vorliegt als auch das Calmodulin in der δ-Untereinheit Calciumionen gebunden hat, ist das Enzym voll aktiv.