Biotin und sein Bindungspartner Avidin werden heute in der Molekularbiologie häufig für eine Reihe verschiedener Techniken und Protokolle verwendet. In diesem Beitrag werden wir die natürliche Rolle von Biotin, Biotinylierung, die Entdeckung der Biotin-Avidin-Wechselwirkung und die Verwendung von Biotinylierung in der Molekularbiologie diskutieren!
Erfahren Sie mehr über die In vivo Biotinylierung von bakteriellen Fusionsproteinen
Biotin ist ein essentielles Vitamin für das Leben
Obwohl Biotin am häufigsten für seine Rolle in der Molekularbiologie bekannt ist, ist Biotin (Vitamin H oder Vitamin B7) zunächst ein essentielles Coenzym, das von allen Organismen für das Leben benötigt wird. Biotin wird nur von Pflanzen, den meisten Bakterien und einigen Pilzen synthetisiert, daher müssen Säugetiere das Vitamin aus externen Quellen beziehen. Der Mensch absorbiert den größten Teil des Biotins, das er im Dünndarm benötigt, aus der dort lebenden Mikroflora.
Biotin ist ein Cofaktor, der in seiner aktiven Form kovalent an das aktive Zentrum wichtiger Stoffwechselenzyme wie Biotincarboxylase und Decarboxylasen gebunden ist. Diese Enzyme katalysieren den Transfer von Carboxylgruppen zu organischen Säuren, um wichtige zelluläre Metaboliten zu produzieren. Biotin wirkt als Carboxylträger von einer Verbindung zur anderen. Diese biotinabhängigen Enzyme sind essentiell für Prozesse wie Glukoneogenese, Lipogenese, Aminosäurestoffwechsel und Energietransduktion.Biotinylierung ist der allgemeine Prozess, durch den Biotin zu einem Protein oder Makromolekül hinzugefügt wird. Biotin kann enzymatisch oder chemisch zugesetzt werden. Enzymatische Biotinylierung tritt natürlich in den Zellen auf und ist der Prozess, durch den Biotin zu einem spezifischen Lysin am aktiven Standort eines eben synthetisierten Enzyms kovalent verpfändet wird. Biotin-Proteinligase (BPL) ist für diese hochspezifische posttranslationale Proteinmodifikation verantwortlich. Die meisten Organismen haben weniger als fünf Enzyme im gesamten Proteom, die biotinyliert sind. In E.coli zum Beispiel ist die BPL, BirA, dafür verantwortlich, dass nur ein Lysin im gesamten Organismus auf dem Biotin Carboxyl Carrier Protein (BCCP) biotinyliert wird.
Entdeckung der Biotin-Avidin-Wechselwirkung
In den späten 1930er Jahren wurde beobachtet, dass Tiere, die hauptsächlich mit Eiweiß gefüttert wurden, Hautläsionen und andere schreckliche Gesundheitsprobleme entwickelten. Diese Krankheit wurde als „Eiweißverletzung“ bezeichnet und es wurde festgestellt, dass sie auf einen Mangel an Vitamin H zurückzuführen war, der später in Vitamin B7 / Biotin umbenannt wurde. Eiweißverletzungen würden diese Tiere plagen, selbst wenn ihre Ernährung mit Biotin ergänzt würde. So wurde etwas im Eiweiß Sequestrierung Biotin absorbiert werden. 1940 konnte Esmond E. Snell das für die Bindung von Biotin verantwortliche Protein Avidin reinigen. Avidin wurde treffend nach dem Huhn „Avian“ benannt, aus dem es gereinigt wurde. Snell bestätigte später, dass Avidin tatsächlich der Schuldige an der Eiweißverletzung war, indem er Ratten gereinigtes Avidin fütterte (Kresege et al., 2004). Avidin ist ein Glykoprotein, das aus vier identischen Untereinheiten besteht, die jeweils ein Molekül Biotin binden können.
Biotin und Avidin haben eine extrem starke Affinität zueinander. Tatsächlich ist die Bindung zwischen ihnen eine der stärksten nichtkovalenten Protein-Ligand-Wechselwirkungen, die in der Natur vorkommen. Sobald die Bindung gebildet ist, bleibt sie von Änderungen des pH-Werts, der Temperatur oder organischer Lösungsmittel unberührt.
Verwendung von Biotin in der Molekularbiologie
Biotin ist ein relativ kleines, wasserlösliches Molekül, das die Makromoleküle, denen es zugesetzt wird, nicht stört. Biotin hat auch eine freiliegende Seitenkette, die leicht manipuliert werden kann, um reaktive Spezies zu bilden, ohne die Avidin-Bindungsstelle zu beeinflussen. Mit all diesen Eigenschaften ist es nicht verwunderlich, dass Wissenschaftler begannen, Biotin und seine starke Wechselwirkung mit Avidin für molekularbiologische und biotechnologische Zwecke zu nutzen. Sobald ein Polypeptid biotinyliert ist (mehr dazu weiter unten), kann es mit Avidin oder einem strukturell ähnlichen Protein, das in den 1960er Jahren entdeckt wurde, Strepavidin, inkubiert oder coexprimiert werden. Der Biotin-Avidin-Komplex kann dann für den beabsichtigten Zweck eines Wissenschaftlers verwendet und / oder manipuliert werden. Zwei der häufigsten Anwendungen der Biotinylierung im Labor sind Proteinreinigung und Immunpräzipitationsexperimente. Biotinylierte Proteine oder Komplexe können leicht unter Verwendung von Säulen oder Perlen gereinigt werden, die mit Avidin beschichtet sind.
Die Biotin-Avidin-Wechselwirkung wurde auch für die Verwendung in der Immunhistochemie und Antikörpermarkierung angepasst. In diesen Experimenten wird Biotin zu einem primären oder sekundären Antikörper hinzugefügt, der auf Ihr interessierendes Protein bzw. Ihren primären Antikörper abzielt. Avidin, das an einen Reporter gebunden ist, wird dann zur einfachen Detektion zur Reaktion gegeben. Die mehrfachen Biotinbindungsstellen, die auf avidin gefunden werden, sind auch für Signalverstärkung während dieser Experimente ideal. Während des Nachweises kann Ihrer Probe ein biotinyliertes Reporterenzym zugesetzt werden, das mit freiem Avidin vorinkubiert ist. Alle freien Biotinbindungsstellen auf diesem Komplex können an Ihren biotinylierten Antikörper binden. Dadurch entsteht ein großes Geflecht von Biotin-Avidin-Komplexen, die an Ihr interessierendes Protein gebunden sind, was zu einer Verstärkung des Reportersignals und einer leichteren Erkennung führt. Diese Strategie wird als Avidin-Biotin-Komplex (ABC) Immunhistochemie (IHC) bezeichnet. Weitere Informationen zu ABC und IHC finden Sie im Handbuch von Thermo Fisher Scientific.
Es gibt eine Reihe anderer molekularbiologischer Anwendungen für Biotin und Avidin. Eine kurze Liste einiger anderer gängiger Anwendungen und Links zu relevanten Papieren und Webseiten sind unten aufgeführt.
- EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays)
- ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
- Southern/Northern Blotting
- Cell surface labelling
- Attaching polypeptides to a substrate
- Flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS)
- In situ hybridization
Methods for biotinylating your macromolecule of interest
To utilize the natural binding of biotin und Avidin, Makromoleküle von Interesse, müssen zuerst biotinyliert werden. Wissenschaftler haben mehrere Methoden entwickelt, um sowohl in vitro als auch in vivo interessierende Makromoleküle chemisch zu biotinylieren.
Biotinylierungsreagenzien:
Die exponierte Seitenkette von Biotin kann in vivo über spezielle Chemikalien (Biotinylierungsreagenzien) mit funktionellen Aminosäuregruppen vernetzt werden. Es gibt eine Vielzahl von Biotinylierungsreagenzien, die sich in den funktionellen Gruppen oder Resten, auf die sie abzielen, sowie in ihrer Löslichkeit unterscheiden, und daher sind verschiedene Reagenzien für die Biotinylierung in verschiedenen Mikroumgebungen nützlich. Es gibt auch reversible und spaltbare Biotinylierungsreagenzien, die bei der spezifischen Elution von biotinylierten Proteinen helfen. Um zu bestimmen, welches Biotinylierungsreagenz verwendet werden soll, lesen Sie das Biotinylierungsreagenz-Auswahltool von Thermo Fisher Scientific.
AviTag und BirA:
Proteine können auch biotinyliert werden, indem die Spezifität des E ausgenutzt wird.coli BPL, BirA. Wenn Sie sich erinnern, biotinyliert BirA nur ein Lysin im gesamten E.coli-Proteom. Mit diesem Wissen identifizierten die Wissenschaftler die 13 Aminosäuresequenz, die für die BirA-Erkennung und Biotinylierung erforderlich ist. Diese 13 Aminosäuresequenz wird als AviTag bezeichnet. Mit AviTag kann man ein Protein von Interesse mit Biotin markieren, indem man einfach eine Fusion erzeugt, in der AviTag entweder an den N- oder C-Terminus des Proteins gegeben wird. Es wurde gezeigt, dass BirA Avitagin-Proteine in Bakterien, Hefen, Insekten- und Säugetierzellen effektiv biotinyliert. Schauen Sie sich Kay et al., 2009 für Methoden zur Biotinylierung von Proteinen mit BirA.
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Oligonukleotidmarkierung:
Biotin kann während einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung eines biotinylierten Primers an jeden Terminus einer DNA-Sequenz gegeben werden. Biotin kann auch enzymatisch während der PCR unter Verwendung eines Biotin-markierten dUTP eingebaut werden. Es gibt mehrere Arten von Biotin-Etiketten, die einem Oligonukleotid hinzugefügt werden können, abhängig von Ihrer nachgelagerten Anwendung. Biotin-markierte Oligonukleotide können in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf In-situ-Hybridisierung, Blotting (Nord und Süd) und Affinitätsbindung.
Photobiotinylierung:
Photobiotin kann zur nichtselektiven Markierung von DNA und RNA verwendet werden. Photobiotinacetat besteht aus einem Biotinmolekül, das an eine photoreaktive Arylazidgruppe gebunden ist. Unter starkem sichtbarem Licht wird die Arylazidgruppe reaktiv und bildet eine Verbindung mit nahe gelegenen Nukleinsäuren (McInnes et al., 1990). Die Photobiotinylierung ist manchmal einfacher und kostengünstiger als andere enzymatische Methoden. Wissenschaftler haben diese Methode häufig verwendet, um Proteine oder Polypeptide an ein festes Substrat zu binden (Holden und Cremer, 2003).
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