RNasen sind wie die bösen Superhelden unter den Laborenzymen. Sie sind allmächtig, zerstörerisch und scheinbar unzerstörbar.Dies liegt daran, dass sie von bösen Oberherren geschaffen wurden, um den tapferen Wissenschaftlern, die jeden Tag darum kämpfen, qualitativ hochwertige, intakte RNA-Präparate herzustellen, das Leben schwer zu machen.
Ok, ich scherze über den Overlords-Teil. Aber warum haben RNases all diese Superkräfte überhaupt? Und was können Sie tun, um sie zu besiegen? Lass es uns herausfinden.
Die Superkräfte von RNasen, erklärt.
RNasen sind allmächtig
Das ist wahr. RNasen kommen in allen Zelltypen und Organismen von Prokaryoten bis Eukaryoten vor. d.h. sie sind überall. Dies ist einer der Hauptgründe, warum sie im Labor ein solches Problem darstellen. Sie schweben in der Luft, auf jeder Oberfläche Ihres Körpers. Was bedeutet, dass sie alles kontaminieren, was die Luft oder eine Oberfläche Ihres Körpers berührt hat. Was im Grunde alles ist. Außerdem adsorbiert insbesondere RNase A sehr stark an Glas, wodurch es noch schwieriger wird, es aus Ihren Flaschen usw. zu entfernen.
RNasen sind hoch destruktiv
RNasen haben im Allgemeinen eine sehr hohe spezifische Aktivität gegenüber ihrem Substrat (RNA). Dies bedeutet, dass die kleinste Menge an RNase Ihre wertvollen RNA-Vorbereitungen leicht durchbrechen kann. Dies ist übrigens auch einer der Gründe dafür, dass eine RNase (RNase A) als erstes Enzym ihren Katalysemechanismus ableiten ließ (Findlay et al 1962).
RNasen sind scheinbar unzerstörbar
Sie zeigen eine phönixartige Erholung nach dem Autoklavieren
Die konventionelle Weisheit besagt, dass RNasen, wenn Sie autoklaviert werden, denaturieren, aber dann renaturieren und nach dem Abkühlen eine Teilfunktion wiedererlangen. Diese erstaunliche, sagenumwobene Stärke wird durch eine Reihe intramolekularer Disulfidbindungen ermöglicht, die die Struktur intakt halten, selbst nachdem die Wasserstoffbrückenbindungen, die normalerweise die 3D-Proteinstruktur halten, gebrochen sind. Wie alle Fabeln ist dies bis zu einem gewissen Grad wahr. Aber lesen Sie weiter und wir werden herausfinden, dass diese besondere Supermacht von den Spin Doctors von RNase Baddies Inc. hochgespielt wurde.
Selbst EDTA kann sie nicht aufhalten!Im Gegensatz zu anderen Nukleasen benötigen viele RNasen keine Metallionen für die Katalyse, da sie die 2-Primhydroxylgruppe des RNA-Substrats als reaktive Spezies verwenden, so dass die einfache Zugabe von TE sie nicht hemmt, wie es bei DNA-kauenden Nukleasen der Fall wäre.
Wie man die bösen RNases besiegt
Ärgere dich nicht, Mitwissenschaftler. RNases können gewaltige Feinde sein, aber sie haben Schwächen, die wir ausnutzen können.
Kick sie in die H
RNasen verlassen sich auf Histidinreste in ihrem aktiven Zentrum für die Katalyse. So kann Diethylpyrocarbonat (DEPC), ein histidinspezifisches Alkylierungsmittel, sie inaktivieren. Durch Autoklavieren wird dann der DEPC entfernt, um zu verhindern, dass andere Proteine in Ihnen oder Ihren Proben alkalisiert werden.
Das Autoklavieren funktioniert bis zu einem gewissen Grad
Die sagenumwobene Unzerstörbarkeit von RNasen gegenüber dem Autoklavieren ist im Kern wahr, aber auch sehr übertrieben, wie ich oben erwähnt habe. Eine nette kleine Studie von Ambion zeigte, dass RNasen (oder zumindest RNase A) nicht vollständig autoklavierbeständig sind. Vielmehr wird ihre Aktivität durch Autoklavieren dezimiert, aber ein kleiner Teil der RNase-Aktivität bleibt nach dem Autoklavieren erhalten.
Aber natürlich hat eine kleine Menge RNase immer noch viel RNA-Kaukraft. Dies bedeutet, dass sich das routinemäßige Autoklavieren im Rahmen Ihrer RNase-Dekontaminationsverfahren auf jeden Fall lohnt – Sie können sich nur nicht darauf verlassen, dass alle Aktivitäten entfernt werden.
Sie können die (trockene) Hitze nicht ertragen
Während nasse Hitze (Autoklavieren) RNasen teilweise zerstört, gibt es keine Hoffnung, dass sie trockener Hitze standhalten. Trockene Hitze oxidiert RNasen – jedes andere Protein, egal wie robust sie sind. Also für die Reinigung Ihrer Glaswaren, ein paar Stunden bei 180 degC sollte es tun.
Chemische Kriegsführung
Für die Reinigung von Oberflächen können RNasen, so robust sie auch sind, Dinge wie Wasserstoffperoxid, starke Säuren / Basen, Trizol usw. nicht aushalten. Diese werden alle häufig verwendet, um selbst die härtesten RNases loszuwerden.
Kryptonit für RNasen: Inhibitoren
Vielleicht ist die beste Waffe, die wir in unserer Waffenkammer gegen RNasen haben, RNase-Inhibitoren. Am häufigsten sind kommerzielle RNase-Inhibitoren Versionen des plazentaren Ribonuklease-Inhibitors (RI). Als jemand, der ein Jahr damit verbringt, RNA-in-situ-Hybridisierungen ohne die Hilfe eines RNase-Inhibitors zu perfektionieren (aufgrund einer falschen Ökonomie durch meinen Chef!), ich weiß, wie gut dieses RNase-Kryptonit ist. Ein Mikroliter RI und plötzlich begannen meine Experimente zu funktionieren.
Ich sage, dass dies die beste Waffe in unserer Waffenkammer gegen RNasen ist, denn im Gegensatz zu allen anderen oben aufgeführten Lösungen sind RNase-Inhibitoren spezifisch, sodass Sie sie (im Allgemeinen) genau dort einsetzen können, wo es in Ihrem Workflow zählt und Erhalten Sie den Schutz, den Sie vor den Bösen benötigen. Seien Sie NICHT ohne dieses Zeug, wenn Sie mit RNA arbeiten.
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