Polymere aus natürlichen Quellen oder Monomeren
Aminosäuren und Materialien auf Saccharidbasis wurden ausführlich für die Nukleinsäurelieferung untersucht, wie an anderer Stelle eingehender überprüft wurde . Diese natürlichen Bausteine haben das Potenzial, die Zytotoxizität zu reduzieren und, wenn sie optimiert werden, eine überlegene Gesamtfunktion im Vergleich zu vollsynthetischen Biomaterialien zu erzielen. Hier werden peptidbasierte und kohlenhydratbasierte Nukleinsäureabgabepolymere untersucht (Abb. 29.7B).Das erste Aminosäure-basierte Polymer, das verfolgt wurde, war Poly (Lys) , und viele Iterationen dieses kationischen Polymers wurden in ähnlicher Weise wie PEI und die anderen oben beschriebenen synthetischen Polykationen eingehend untersucht. Poly (Lys) kann Nukleinsäuren effizient komplexieren, aber seine Transfektionseffizienz ist gering und erfordert eine Zellbehandlung mit Endosomolytika wie Chloroquin, um die Genexpression zu verbessern. Nichtsdestotrotz lieferten die frühen Studien zu Poly (Lys) wichtige mechanistische Erkenntnisse in Bezug auf Polyplexformulierung, intrazellulären Handel und Endosomenflucht . Während das klinische Versprechen von Poly (Lys) begrenzt ist, hatten diese frühen Studien einen signifikanten Einfluss auf das Feld.
Poly(Histidin) (Poly(His)) ist ein weiteres Polymer auf Aminosäurebasis, das einen gewissen Nutzen für die Gentherapie gezeigt hat. Die Aminosäure His weist eine Imidazol-R-Gruppe auf, die ein sekundäres Amin enthält, das Poly (His) eine Protonenschwamm-Aktivität für die endosomale Flucht verleiht. Polymere, die sowohl Lys als auch His enthalten, wurden ebenfalls erfolgreich in Kombinationen eingesetzt. In diesen Hybridpolymeren sind die primären Amine auf Lys bei physiologischem pH-Wert vollständig protoniert und kationisch, was eine effiziente elektrostatische Komplexierung mit DNA ermöglicht. Die unteren pKb der sekundären Amine aus His liefern komplementäre Protonenschwamm Aktivität für Endosom Flucht . Die Transfektionseffizienz von Polymeren mit Poly (His), die auf Poly (Lys) gepfropft sind, wird durch die Zugabe des endosomalen Aufschlussmittels Chloroquin signifikant verbessert, was darauf hindeutet, dass die Polymere allein noch teilweise anfällig für endosomalen Einschluss sind . Es wurde auch festgestellt, dass hochverzweigte Architekturen von His / Lys-Polymeren und His-haltigen reduzierbaren Polykationen siRNA effizient liefern . Es gibt auch einen Präzedenzfall für den Einbau von Untereinheiten auf Aminosäurebasis in andere Gentherapiesysteme, um „Hybride“ mit verbesserter Verabreichungsfunktionalität herzustellen. Zum Beispiel wurde His auch verwendet, um Chitosan zu modifizieren (weiter unten diskutiert), um seine endosomale Flucht- und Transfektionseffizienz zu verbessern .Cell-Penetrating Peptides (CPPs) und pH-responsive, fusogene Peptide sind zwei weitere Klassen von Peptiden, die rigoros erforscht wurden, um die Zellaufnahme bzw. die endosomale Flucht auszulösen. Diese Peptidklassen wurden sowohl in Kombination als auch als Komponenten von multifunktionalen Polymer- und liposomalen Verabreichungssystemen verwendet. Die meisten CPP und fusogenic Peptide werden von den bakteriellen Giftstoffen und von den Virenvektoren abgeleitet, oder sie sind synthetische Analoga der natürlich vorkommenden Peptide. Der trans-aktivierende Transkriptionsfaktor von HIV-1 und das von Drosophila abgeleitete Antennapedia-Peptid sind zwei Beispiele für gut untersuchte CPPs. Diese Peptide sind typischerweise reich an kationischen Aminosäuren, und als Ergebnis wurden auch synthetische, argininreiche CPPs verschiedener Typen gefunden, die die Aufnahme biomakromolekularer Ladungszellen vermitteln. Die Fusion eines CPP mit einer dsRNA-bindenden Domäne wurde verwendet, um siRNA in Primärzellen zu liefern, die als schwierig zu transfizieren gelten . Andere CPPs, die von Transportan 10 (bezeichnet als PepFect) und CADY abgeleitet sind, wurden für eine effiziente intrazelluläre Abgabe entwickelt. Fusionen von Tumor-durchdringenden und CPPs wurden erzeugt, die gezeigt haben, dass die Stummschaltung eines Onkogens das Überleben bei Mäusen verbessert hat Die Fähigkeit von CPPs, die Zell-Internalisierung auszulösen, wurde für die Abgabe mehrerer Klassen therapeutischer Fracht einschließlich Plasmid-DNA und siRNA genutzt (siehe CPP-Reviews für zusätzliche Informationen).
Fusogene Peptide sind pH-reaktive Peptide, die mit der endosomalen Membran verschmelzen oder Poren bilden können. Ein Beispiel ist das Diphtherietoxin, das eine Untereinheit aufweist, die Transmembranporen in Endosomen bildet, die den Eintritt eines disulfidgebundenen Toxinfragments in das Cytosol ermöglichen . Ein anderes Beispiel ist Hämagglutinin, ein Influenzaprotein, das eine pH-abhängige endosomale Membranfusion erzeugt, um das virale genetische Material in das Zytoplasma zu liefern . Das Peptid GALA ist ein synthetisches, pH-abhängiges, fusogenes Peptid, das umfassend charakterisiert wurde. GALA baut sich selbst zusammen und fügt sich bei saurem pH-Wert in Lipiddoppelschichten ein, wodurch eine Pore gebildet wird, die den Membrantransit ermöglicht . GALA wurde beispielsweise erfolgreich angewendet, um die Effizienz der zytosolischen Abgabe von Nukleinsäureladung, die in PAMAM und Liposomen verpackt ist, zu verbessern .Das Polysaccharid Chitosan, oligosaccharidähnliche Cyclodextrine und eine Vielzahl anderer saccharidhaltiger Glycopolymere stellen eine weitere Polymerklasse für die Nukleinsäurelieferung dar. Beispielsweise können natürliche anionische Polymere auf Saccharidbasis durch spontane Assoziation, die durch Mischen von Polyelektrolyten entgegengesetzter Ladung ausgelöst wird, zu thermodynamisch stabilen Polyelektrolytkomplex (PEC) -NPs hergestellt werden, wie von Prokop et al. . Typischerweise werden PEC-NPs durch Mischen von polyanionischen Kernpolymeren wie Alginat oder Chondroitinsulfat mit Corona-Polykationen wie Sperminhydrochlorid oder Poly (Methylen-co-Guanidin) -hydrochlorid hergestellt. Dieser multipolymere nanoparticulate Ansatz hat sich für den Gentransfer in vitro als wirksam erwiesen, insbesondere in Zellsystemen, die normalerweise für den Gentransfer refraktär sind, wie Pankreasinseln und Antigen-präsentierende Zellen. Darüber hinaus können PEC-koronale Oberflächen mit PEG-Ligand-Komplexen dekoriert werden, um das Zell-Targeting zu erhöhen und die unspezifische Aufnahme zu reduzieren.
Chitosan, ein Polysaccharid, das aus Glucosamin- und N-Acetylglucosamin-Einheiten besteht, die über β (1 → 4) glykosidische Bindungen gebunden sind, ist eines der am gründlichsten untersuchten Saccharidpolymere. Chitosan profitiert von einem „grünen“ Ansatz, da es sich um eine erneuerbare Ressource handelt, die aus Chitin gewonnen wird. Dieses natürliche Polymer ist auch biologisch abbaubar und ungiftig. Das Alonso-Labor führte Chitosan-basierte NPs ein, die durch ionotrope Gelierung hergestellt wurden, basierend auf der Wechselwirkung zwischen den negativen Gruppen von Pentanatriumtripolyphosphat und den positiv geladenen Aminogruppen auf Chitosan. Die Chemie von Chitosan ist auch an die nichtvirale Gentherapie anpassbar, da es mehrere primäre und sekundäre Amine enthält, die über den Protonenschwamm-Effekt zur Endosomolyse fähig sind. Daher wurde Chitosan als pH-responsives Polymer für die Nukleinsäurelieferung untersucht. Howard et al. eingesetztes Chitosan-NPs, das siRNA enthält, um verstärktes grün fluoreszierendes Protein (eGFP) sowohl in humanen H1299-Lungenkarzinomzellen als auch in murinen Peritonealmakrophagen abzubauen (77,9% bzw. 89,3% Reduktion der eGFP-Fluoreszenz) . Das Chitosan NP hat ein hohes Potenzial für die transmukosale Abgabe. Eine effektive in vivo RNAi wurde in bronchiolären Epithelzellen von transgenen eGFP-Mäusen nach nasaler Verabreichung von Chitosan / siRNA-Formulierungen erreicht (37% bzw. 43% Reduktion im Vergleich zu Mismatch bzw. unbehandelter Kontrolle). Die Hauptnachteile von Chitosan sind eine schlechte Löslichkeit in physiologischen Puffern und eine geringere endosomolytische Aktivität im Vergleich zu einigen stärkeren Protonenschwamm-Polymeren. Infolgedessen wurden mehrere Varianten von Chitosan mit Modifikationen hergestellt, um die endosomale Flucht und Löslichkeit zu erhöhen. Zum Beispiel wurden PEI und Imidazole beide an Chitosan konjugiert, um seine Leistung in Gentherapien zu verbessern .
Kationische Polymere, die Beta-Cyclodextrine (β-CD) enthielten, zeigten frühe vielversprechende Ergebnisse für die klinische RNAi. Kationische β-CD-basierte Polymere (ßCDPs), die durch Kondensation eines Diamino-Cyclodextrin-Monomers mit einem Diimidat-Comonomer synthetisiert werden, können Polyplexe mit Nukleinsäuren bilden, und ihre Transfektionsleistung hängt von der ßCDP-Struktur ab . Die β-CD-haltigen Polykationen sind besonders einzigartig, da Cyclodextrine einen inneren Hohlraum enthalten, aus dem Einschlusskomplexe mit hydrophoben Resten gebildet werden können. Zum Beispiel bindet β-CD fest an das hydrophobe Molekül Adamantine, und dies bietet einen bequemen „Griff“, von dem aus die Oberflächenpolyplexe aus ßCDPs mit PEG oder Targeting-Liganden funktionalisiert werden können . Das Davis Laboratory übersetzte dieses Konzept vom Tisch in klinische Studien . Dieser Träger war die Grundlage für einen Bericht, der das erste Beispiel menschlicher RNAi unter Verwendung gezielter polymerer NPs demonstrierte. Dieser Träger bestand aus ßCDPs, die sowohl mit PEG als auch mit dem gegen Krebs gerichteten Liganden Transferrin funktionalisiert waren . Nach diesem wegweisenden Befund wurde die klinische Studie hauptsächlich aufgrund dosislimitierender toxischer Ereignisse ohne Folgestudien beendet. Arrowhead Pharmaceuticals konzentrierte sich anschließend auf Konjugate, und es wurden keine klinischen Folgestudien der Phase III eingeleitet.Eine Vielzahl weiterer neuartiger, synthetischer kationischer Glycopolymere befindet sich ebenfalls in der Entwicklungspipeline für klinische Anwendungen der Nukleinsäurelieferung. Das Reineke-Labor hat in diesem Bereich wichtige Beiträge geleistet (siehe aktuelle Übersicht Ref. ), und eine von dieser Gruppe entwickelte Beispielklasse von Glycopolycationen sind die Poly(glycoamidoamine)s (PGAAs). Eine Bibliothek von PGAAs wurde durch die Kondensationsreaktion zwischen Kohlenhydrat- und Oligoamin-Comonomeren hergestellt. Diese PGAAs wurden basierend auf einer Vielzahl von Parametern variiert, einschließlich der Kohlenhydratgröße, der Hydroxylzahl und Stereochemie, der Aminzahl und ob heterocyclische Gruppen vorhanden waren oder nicht. Diese Polymere wurden für die Genabgabe gescreent und optimierte Formulierungen identifiziert, die eine effiziente DNA-Verpackung und intrazelluläre Abgabeeigenschaften ermöglichen. Die Reineke-Gruppe hat auch eine Vielzahl von Trehalose-basierten Polymeren gesucht, und vielversprechende Ergebnisse deuten weiterhin auf das Potenzial für die klinische Translationsfähigkeit dieser sicheren und effizienten Klasse von Polymeren hin . Dieses Glycopolymer wurde auch angepasst, um CRISPR-basierten Transkriptionsaktivator zu liefern .
Exosomen sind von Zellen abgeleitete extrazelluläre Vesikel, die eine Vielzahl von Nukleinsäuretypen enthalten. Diese natürlichen Vehikel sind an der Zellkommunikation beteiligt und werden zunehmend bei der Arzneimittel- und Genabgabe eingesetzt . Eine große Herausforderung bei der Nutzung von Exosomen für die Genübertragung ist die Beladung der Vehikel mit Nukleinsäuren. Während Elektroporation die gebräuchlichere Methode zum Laden von DNA ist, sind Ultraschall, Extrusion und Gefrier-Tau-Zyklen andere Methoden zum Laden von Exosomen . Die Beladung von exogener siRNA oder DNA bleibt aufgrund der geringen Effizienz und Aggregation während der Elektroporation eine Herausforderung. Für die regenerative Medizin können Exosomen, die aus Stamm- oder Vorläuferzellen gewonnen werden, die Geweberegeneration selbst ohne exogen zugeführte DNA fördern, einschließlich Muskelregeneration , Wundheilung , Angiogenese und Knorpelreparatur .