Principal Investigator: Zuben E. Sauna, PhD
Büro / Abteilung / Labor: OTAT / DPPT / HB
Allgemeiner Überblick
Ein Hauptproblem bei proteinbasierten Therapeutika ist ihre Immunogenität, dh ihre Tendenz, eine unerwünschte Immunantwort gegen sich selbst auszulösen. Eine Form der Immunantwort ist die Aktivierung von B-Zellen, die Antikörper produzieren, die an die Proteine binden und deren therapeutische Wirkung reduzieren oder eliminieren. Solche Antikörper können auch Komplikationen verursachen, die lebensbedrohlich sein können. Daher ist ein kritischer Teil der Bestimmung der klinischen Sicherheit und Wirksamkeit von proteinbasierten Therapeutika die Messung ihrer Tendenz, die Antikörperbildung auszulösen.Die Immunantwort auf proteinbasierte Therapeutika umfasst auch T-Zellen, die helfen, B-Zellen zu aktivieren, so dass sie Antikörper produzieren, einschließlich solcher, die Proteintherapeutika blockieren. Dies geschieht, wenn das vom Körper hergestellte natürliche Protein in irgendeiner Weise defekt ist. In diesem Fall reagieren die T-Zellen auf ein normales, künstliches Protein, als wäre es fremd, da es sich von dem defekten, natürlichen Protein unterscheidet. Eine solche T-Zell-Antwort-Fehlanpassung tritt manchmal im Fall des Proteins FVIII auf, eines Proteins, das für die Fähigkeit des Körpers, Blutgerinnsel zu bilden, um Blutungen zu stoppen, entscheidend ist. Menschen, die nicht über ausreichende Mengen an FVIII verfügen oder deren FVIII in irgendeiner Weise defekt ist, leiden an Hämophilie A, einer Krankheit, bei der die Blutgerinnung defekt ist und zu übermäßigen Blutungen führt. Das Problem des defekten FVIII ist genetisch bedingt. Obwohl es keine Heilung für Hämophilie A gibt, war die Infusion des therapeutischen Proteins FVIII eines der erfolgreichsten Beispiele für die Behandlung einer chronischen Krankheit. Leider ist die Entwicklung von Anti-Drug-Antikörpern gegen das infundierte FVIII ein erhebliches Hindernis für diese Strategie. Die Behandlung von Patienten, die eine Immunantwort entwickeln, ist komplexer, weniger effektiv und äußerst teuer. Es scheint nun, dass individuelle Variationen in der Entwicklungsneigung von Anti-Arzneimittel-Antikörpern auch auf genetischen Unterschieden beruhen können. Dies spiegelt sich in der klinischen Beobachtung wider, dass Personen mit Hämophilie A schwarzafrikanischer Abstammung doppelt so häufig Antikörper gegen Faktor VIII-Proteine produzieren wie Patienten europäischer kaukasischer Abstammung, die als Ersatztherapie verabreicht werden.Eine Strategie zur Verhinderung von Fehlanpassungen zwischen natürlichem FVIII und Ersatz-FVIII besteht darin, gentechnisch veränderte FVIII-Proteine so zu gestalten, dass sie keine Immunreaktionen auslösen. Aber es gibt so viele Unterschiede zwischen den Immunsystemen der Menschen, dass es unwahrscheinlich ist, dass Forscher in der Lage sein werden, ein FVIII-Protein zu entwerfen, das für alle von ihnen sicher ist. Daher schlagen wir vor, einen personalisierten Ansatz zur Vorhersage und Vermeidung von Immunantworten auf FVIII-Proteine zu verfolgen. Unser langfristiges Ziel ist es, einen genbasierten Ansatz zur Identifizierung von Personen zu entwickeln, deren Immunsystem wahrscheinlich auf bestimmte Versionen gentechnisch veränderter therapeutischer Proteine reagiert, damit diese Patienten mit Versionen dieser Proteine behandelt werden können, bei denen die Wahrscheinlichkeit einer Immunantwort geringer ist.
Wir befassen uns auch mit dem Problem der Unterschiede in den dreidimensionalen Strukturen von Protein-Medikamenten und natürlichen Proteinen, die B-Zellen dazu veranlassen, Antikörper gegen therapeutische Proteine zu produzieren. Die derzeitige Methode zur Vorhersage, ob bestimmte Teile solcher Proteine die Antikörperbildung auslösen, ist herausfordernd und teuer. Daher verwenden wir winzige DNA-ähnliche Moleküle, sogenannte Aptamere, um die Proteine zu untersuchen und ihre genaue Form zu bestimmen. Aptamere bestehen aus Molekülketten, die als Nukleinsäuren bezeichnet werden und sich zu bestimmten Formen zusammenfalten, die davon abhängen, welche Nukleinsäuren vorhanden sind und in welcher Reihenfolge sie im Aptamer vorkommen. Indem wir also identifizieren, welches Aptamer fest an einen bestimmten Teil eines Moleküls bindet, können wir die Form dieses Teils des Moleküls vorhersagen, ähnlich wie wir die Form eines Schlosses vorhersagen, indem wir die Form des Schlüssels kennen, der hineinpasst.Wir verwenden nun diese Technik, um die Formen sowohl von FVIII als auch des Teils des Anthraxtoxins namens Protective Antigen zu bestimmen. Wenn ein Aptamer beispielsweise seine Fähigkeit verliert, an FVIII zu binden, würde dies darauf hindeuten, dass ein Teil dieses Blutgerinnungsproteins seine Form verändert hat, was die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass es eine Immunreaktion auslöst, die seine therapeutische Aktivität verringert. Wir verwenden diesen Ansatz, um festzustellen, ob therapeutische Proteine Formen haben, die die Antikörperproduktion auslösen. Und wir arbeiten mit dem Center for Drug Evaluation and Research zusammen, um diese Technologie anzupassen, um neue Proteinprodukte zu analysieren, die als Kopien bestehender, zugelassener Proteinarzneimittel (Biosimilars) entwickelt wurden, um sicherzustellen, dass sie sicher und wirksam sind.
Wissenschaftlicher Überblick
1) Vorhersage der Interaktion von T-Zell-Epitopen mit spezifischen MHC-Klasse-II-Antigenen.
Faktor VIII (FVIII) ist ein wesentlicher Bestandteil der Gerinnungskaskade und Personen mit einem Mangel an Gerinnungsfaktoren weisen lebenslange Blutungsstörungen auf. Die Entwicklung einer Immunogenität gegen therapeutische (infundierte) Versionen von FVIII ist ein signifikantes Hindernis für die erfolgreiche Behandlung von Hämophilen.Etwa 50% der Fälle von Hämophilie A werden durch eine Inversion der Exons 1-22 des F-Gens verursacht, was zur Produktion eines Polypeptids führt, das diese Exons repräsentiert, aber nicht 23-26. Es gibt jedoch ein verschachteltes Gen innerhalb des F8-Promotors, das die Exons 23-26 übersetzt. Die 1-22-Inversion bedeutet jedoch, dass die aus diesem Protein erzeugten überlappenden Peptide die Verbindung zwischen 1-22 und 23-26 nicht enthalten. Während die Peptide aus dem infundierten Arzneimittelprotein FVIII, die diesen Übergang abdecken, dem Immunsystem des Patienten fremd wären, sind sie im Allgemeinen nicht immunogen. Vielmehr ist die Immunogenität aufgrund der Unterschiede zwischen endogenem und infundiertem FVIII wahrscheinlich auf eine Vielzahl von Fakten zurückzuführen, insbesondere auf Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs), aber auch auf Missense-Mutationen und -deletionen und Nonsense-Mutationen sowie auf Inversionen. Während das Entwerfen solcher Biologika, um jedem Patienten zu entsprechen, nicht praktisch ist, könnte es in Fällen möglich sein, in denen es klare und signifikante Unterschiede zwischen bestimmten Populationen gibt (z. B. zwischen denen europäischer kaukasischer und schwarzafrikanischer Abstammung). In solchen Fällen wäre es wünschenswert, die Designs der endogenen FVIII an jede Gruppe anzupassen, um sicherzustellen, dass eine Population nicht einen unverhältnismäßigen Anteil der Vorteile einer einzigen Version von FVIII erhält, während die andere Population einen unverhältnismäßigen Anteil der Risiken derselben infundierten FVIII trägt.Die derzeitige Technologie ermöglicht die Identifizierung von Haplotyp-Hintergründen für FVIII sowie die Entwicklung zumindest einer begrenzten Anzahl personalisierter Faktor VIII-Arzneimittel. Daher ist es unser kurzfristiges Ziel, die 1) quantitative Verteilung verschiedener Haplotypen (SNPs) bei Personen europäisch-kaukasischer und schwarzafrikanischer Abstammung zu bestimmen; 2) Verteilung von MHC-Klasse-II-Antigenen in diesen Populationen; 3) Zusammensetzung von FVIII als Arzneimittel verwendet; und 4) krankheitsverursachende Mutation, Deletion oder Inversion im F8-Gen (FVIII) einzelner Patienten. Wir werden diese Daten verwenden, um die Immunogenität einzelner FVIII-Produkte in verschiedenen Populationen und / oder einzelnen Patienten vorherzusagen.
2) Entwicklung von Aptameren als Werkzeug zur Untersuchung von Protein-Wirkstoff-Konformationsepitopen.Aptamere, Nukleinsäuren, die komplexe Konformationen bilden können, sind potenzielle Werkzeuge zur Kartierung der Proteinkonformation, Identifizierung und Vorhersage immunogener Stellen und zur Umgehung der Immunogenität. Unser Labor entwickelt einzelsträngige DNA-Aptamere für den rekombinanten humanen Faktor VIII.
Wir haben eine naive DNA-Bibliothek entwickelt, um Aptamere unter Verwendung definierter 5â € ™ und 3â € ™ Regionen für die PCR zu erzeugen, die eine randomisierte 60-Basen-Region flankieren. Die naÃve-DNA-Bibliothek wurde denaturiert und die ssDNA-Segmente durften sich zu einzigartigen 3-dimensionalen Formen falten. (Die 60 zufälligen Basen würden theoretisch zu 460 eindeutigen Konformern führen.) Wir inkubierten den Pool gefalteter ssDNA mit FVIII und konnten durch iterative SELEX-Zyklen (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) proteinbindende Aptamere auswählen.
Unser Labor wählte eine Stichprobe einzelner Aptamere in den Zyklen 3, 5 und 8 aus und klonierte und sequenzierte sie. Wir verwenden diese Klone, um die Aptamere durch Analyse der vorhergesagten 3D-Struktur, der Bindungseigenschaften und der Wirkung auf die FVIII-Aktivität zu charakterisieren. Darüber hinaus führen wir In-Silico-Vergleiche dieser Klone durch, um die Entwicklung der Aptamere zu verfolgen.
3) Verwendung verschiedener Analysetechniken zur Bewertung von Proteineigenschaften, die mit der Immunogenität korrelieren können.
In Zusammenarbeit mit Drs. Mansoor Khan und Rakhi Shah (Abteilung für Produktqualität, CDER) Wir werden Arzneimittel-Hilfsstoff-Wechselwirkungen mit thermischen Methoden (Differential-Scanning-Kalorimetrie, Mikrokalorimetrie, thermogravimetrische Analyse), spektroskopischen Techniken (Fourier-Transformation Infrarot, Nahinfrarot, Raman), Kristallographie (Röntgenbeugung) und Kernspinresonanz analysieren.
4) Charakterisierung von konformationsempfindlichen Antikörpern.Eine alternative Methode zur Untersuchung von Konformationsepitopen therapeutisch wichtiger Proteine ist die Entwicklung und Charakterisierung von Antikörpern, die empfindlich auf Konformationsänderungen reagieren. In Zusammenarbeit mit Dr. Chava Kimchi-Sarfaty (CBER) charakterisierten wir mehrere Antikörper, die empfindlich auf die Konformation der Zink-Metalloprotease ADAMTS13 reagieren, einem Multidomänen-Protein, das den von Willebrand-Faktor spaltet und an der thrombotischen thrombozytopenischen Purpura beteiligt ist. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass diese Antikörper nützliche Reagenzien für die Unterscheidung von funktionellen und nicht-funktionellen ADAMTS13 und für die Analyse von Konformationsübergängen während des katalytischen Zyklus sein könnten.
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