Wirkungsmechanismen von Du-Huo-Ji-Sheng-Tang auf den Knorpelabbau in einem Kaninchenmodell der Osteoarthritis

Zusammenfassung

Du-Huo-Ji-Sheng-Tang (DHJST) ist eine traditionelle chinesische Kräutermedizin zur Behandlung von Osteoarthritis. In der vorliegenden Studie wurde die therapeutische Wirkung von DHJST auf den Knorpelabbau in einem Kaninchenmodell der Osteoarthritis untersucht. In den Kniegelenken von Kaninchen wurde eine vordere Kreuzbandtransektion (ACLT) durchgeführt, um experimentelle Osteoarthritis zu induzieren. Am Ende der sechsten Woche wurden 30 Kaninchen mit ACLT in sechs Gruppen eingeteilt, Kontrollgruppe, DHJST-Gruppe und Osaminethacin (OSA) -Gruppe, die weitere 4 Wochen lang verfolgt wurden. Die anderen drei Gruppen von Kaninchen mit ACLT wurden mit DHJST oder OSA unbehandelt, die nach 6 Wochen geopfert wurden und als 6-Wochen-Zeitpunktkontrollen dienten. Die Ergebnisse zeigten, dass am Ende der sechsten Woche nach der Operation eine signifikant histologische Degeneration in der Kontrollgruppe im Vergleich zur normalen Gruppe auftrat. In der Kontrollgruppe war der mittlere Wert für histologische Degeneration in der 10. Woche weiter erhöht, und es gab einen signifikant niedrigeren mittleren Wert für histologische Degeneration in der DHJST-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Um den potentiellen Mechanismus zu erforschen, wurde das Expressionsniveau von VEGF und HIF-1α nachgewiesen. Die Expression von VEGF-mRNA und HIF-1α-mRNA ist in der Normalgruppe gering, während die Aktivitäten in der Kontrollgruppe allmählich zunehmen. Im Vergleich zur gleichen Zeitpunktmodellgruppe nahm die Aktivität von VEGF und HIF-1α in der DHJST-Gruppe jedoch signifikant ab. Zusammenfassend übt DHJST eine signifikante therapeutische Wirkung auf Osteoarthritis-Kaninchen aus, und Mechanismen sind mit der Hemmung der VEGF- und HIF-1α-Expression verbunden.

1. Einleitung

Osteoarthritis (OA) ist eine fortschreitende und schwächende Erkrankung, deren klinische Manifestation bei betroffenen Personen Jahre dauern kann. Knorpelalterung und Chondrozytenseneszenz spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und Entwicklung von OA. Während der Entwicklung von OA kommt es häufig zu einem fokalen Anstieg des Zelltods. Viele Berichte zeigten, dass die Chondrozytenseneszenz zum Risiko einer Knorpeldegeneration beiträgt, indem sie die Fähigkeit der Chondrozyten verringert, das Gelenkknorpelgewebe zu erhalten und zu reparieren . Da angenommen wird, dass jeder Chondrozyt für die Aufrechterhaltung der ihn umgebenden extrazellulären Matrix verantwortlich ist und dass Matrixmoleküle, die in einer Region des Gewebes produziert werden, eine sehr begrenzte Fähigkeit haben, das Gewebe zu durchqueren, könnte der fokale Verlust lebensfähiger Zellen teilweise dafür verantwortlich sein die Unfähigkeit des Gewebes, kleinere Schäden zu reparieren .Derzeit gibt es keine Heilung für OA, und die verfügbaren Behandlungen verlangsamen nur das Fortschreiten der Krankheit . In den letzten 20 Jahren hat die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) erhebliche Fortschritte gegen OA erzielt, z. B. bei der Verbesserung der klinischen Befunde der Patienten, der Hemmung der Entzündungsreaktion und der Knorpeldegeneration . In vivo und in vitro Studie zeigte auch, dass chinesische Kräuter Formel von mehreren umfassenden Maßnahmen gegen OA ist. Du-Huo-Ji-Sheng-Tang, das aus Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi und Poria besteht, wurde häufig zur Behandlung von OA eingesetzt. Es kann die klinischen Symptome, die Kniefunktion und die Lebensqualität der Patienten verbessern. Basierend auf unserem Wissen über die OA-Pathogenese in der TCM untersuchten wir die Wirkung von DHJST auf die Verhinderung der Knorpeldegeneration von OA bei Kaninchen und beobachteten deren Mechanismen.

2. Methoden

2.1. Materialien

Das Dead End Colorimetric apoptosis Detection System (TUNEL Assay) wurde von der Nanjing Jiancheng Biotech Company (China) bezogen. Trizol Total RNA extraction Kit, DNA molecular Marker, SYBR Premix EX TaqTM und Perfect Real Time Kit wurden von der Invitrogen Co. (USA). Kräuter in DJST (bestehend aus Radix Angelicae Pubescentis, Herba Taxilli, Herba Taxilli, Radix Acanthopanacis Bidentatae, Herba Asari, Radix Gentianae Macrophyllae, Cortex Cinnamomi und Poria, zur Verfügung gestellt von Shanghai Huayu Chinese Herbs Co. Ltd., China) wurden von einem Pharmakognosisten nach Standardprotokollen akkreditiert, die vom Shanghai Municipal Hospital für traditionelle chinesische Medizin erstellt wurden. Die Komponenten wurden in der Reihenfolge des Verhältnisses von gemischt 2 : 1 : 1 : 1 : 0.2 : 1 : 0.3 : 1 ( trockengewicht) wurden die Arzneimittel mit Standardmethoden nach chinesischem Arzneibuch extrahiert (China Pharmacopoeia and Committee, 2000). Diese rohen Arzneimittel wurden in destilliertem Wasser eingeweicht und zweimal 30 min gekocht, und die Arzneimittellösung wurde durch ein Netz filtriert, dann wurde das Filtrat mit einer Vakuumpumpe auf 4 g mL−1 eingeengt und dann bis zur Verwendung bei -20 ° C gelagert. Osaminethacin (OSA), jede Tablette enthält 25 mg Indomethacin und 75 mg Aminoglucose (geliefert von Hebei Jizhong Pharmaceutical Co. Ltd., China), wurde als Positivkontrollarzneimittel eingesetzt.

2.2. Kaninchen und Gewebepräparation

Achtundvierzig Monate alte neuseeländische weiße Kaninchen wurden vom Versuchstierzentrum an die Chinesische Akademie der Wissenschaften geliefert. Dreißig Kaninchen wurden unter Vollnarkose einer einseitigen vorderen Kreuzbandtransektion (ACLT) unterzogen. Die normalen Kaninchen wurden keiner Prozedur unterzogen.

Am Ende der sechsten Woche wurden die 30 Kaninchen mit ACLT in sechs Gruppen eingeteilt, Kontrollgruppe, DHJST-Gruppe und OSA-Gruppe, die weitere 4 Wochen lang verfolgt wurden. Die anderen drei Gruppen von Kaninchen mit ACLT wurden mit DHJST oder OSA unbehandelt, die nach 6 Wochen geopfert wurden und als 6-Wochen-Zeitpunktkontrollen dienten. Die Dekokte wurden in Dosierung 0 oral verabreicht.923 g (kg−1 · d−1) für 4 Wochen, Kaninchen in der OSA−Gruppe erhielten OSA 0,09 g (kg−1 · d-1) für einen Zeitraum von 4 Wochen, Modellkontrollgruppe und Normalgruppe wurden oral verabreicht mit dem gleichen Volumen physiologischer Kochsalzlösung.

Kaninchen wurden zur Probenahme geopfert. Das Protokoll erhielt die Genehmigung des Ausschusses für Tierversuche des Universitätsklinikums, Shanghai, China. Kaninchen Tibiae wurde entfernt und Tibia Gelenkknorpel wurde sofort bei -80 ° C gelagert. Die Tibiae wurden sorgfältig seziert und vom angrenzenden Muskel befreit und sofort in 10% Formalin für 24 Stunden fixiert. Tibien wurden anschließend 4 Wochen lang in 100 g / L Ethylendiamintetraessigsäure entkalkt, in PBS gewaschen, durch eine Reihe von Ethanol dehydratisiert und in Paraffin standardisiert eingebettet, um die richtige Orientierung zu gewährleisten. Paraffingewebeschnitte (7 µm) wurden standardisiert geschnitten. Die Schnitte wurden für histochemische Analysen deparaffiniert.

2.3. Histologische Beurteilung des Knorpels

Die histologische Beurteilung wurde an den Femorotibialgelenken von Kaninchen in der DHJST-Gruppe, der OSA-Gruppe und den Kontrollgruppen durchgeführt. Die Schnitte wurden mit Safranin O-fast green angefärbt. Diese histologischen Schnitte von jeder Stelle wurden mit einem modifizierten Mankin-Bewertungssystem (Tabelle 1) von zwei unabhängigen, vom Board zertifizierten Veterinärpathologen bewertet.

2.4. TUNEL-Assay

H2O2-induzierte Apoptose wurde durch Durchführung des terminalen Desoxynukleotidedyltransferase-vermittelten dUTP-Nick-Endmarkierungs-Assays (TUNEL) unter Verwendung eines Apo-DirectTM-Kits (CalBiochem, San Diego, CA) nachgewiesen. TUNEL wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz nach Vorbehandlungen und Exposition gegenüber H2O2 wurden Zellen geerntet, gewaschen, fixiert, permeabilisiert und auf DNA-Strangbrüche markiert, dann auf einem Coulter Epics Elite Durchflusszytometer (Beckman-Coulter, Miami, USA) analysiert. Alle Assays wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

2.5. Fluoreszierende quantitative PCR

Gesamt-RNA wurde aus 50 mg Knorpel in Tibiae articular mit Trizol-Reagenz extrahiert. Die Synthese von cDNA wurde unter Verwendung von 4 µg Gesamt-RNA pro Probe mit zufälligen Primern und Reagenzien durchgeführt, die im Revert Aid First Strang cDNA Synthesis Kit enthalten waren. Zwei Mikroliter (2 µL) jeder Probe wurden für die Echtzeit-PCR in einem Rotor-Gene 2000 System (Australien) verwendet. Die relative Quantifizierung wurde unter Verwendung der Delta Cycle threshold () relative Quantifizierung berechnet. Der Schwellenzyklus () für die endogene Kontroll-CAPDH-mRNA und die Zielsignale wurden bestimmt, und die relative RNA-Quantifizierung wurde unter Verwendung einer Vergleichsmethode berechnet, wobei

Sequenzen von Primern, die für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) verwendet werden, sind: 5′-TGCCCACCGAGGAGTTCA-3 (vorwärts) und 5′-GGCCCTGGTGAGGTTTGAT-3 (rückwärts) (Produktlänge: 75 bp).Sequenzen von Primern, die für Hypoxie-induzierbaren Faktor-1α (HIF-1α) verwendet werden, sind: 5′-CAGTGCAAAAGACAGGTGGAAG-3 (vorwärts) und 5′-CCCTGTATGGTGGTGATGTTGT-3 (rückwärts) (Produktlänge: 107 bp).Sequenzen von Primern, die für GAPDH verwendet werden, sind: 5′-CCGAGGGCCCACTAAAGG-3 (vorwärts) und 5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA-3 (rückwärts) (Produktlänge: 88 bp).

2.6. Statistische Analyse

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert und Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Analyse der Messdaten erfolgte mittels einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA, SPSS 11.0). Rank-Daten wurden mit ridit analysiert. Das Ergebnis von P < .05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

3. Ergebnisse

3.1. Die ACLT-induzierte histologische Degeneration bei Kaninchen wurde durch DHJST reduziert

Repräsentative histologische Schnitte sind in Abbildung 1 dargestellt. Am Ende der 10. Woche beobachteten wir eine normale Integrität der Gelenkfläche in der Normalgruppe (Abbildung 1(a)). In der Kontrollgruppe mit erhöhter Degeneration kam es zu einem Verlust der Safranin-O-Fast-Grünfärbung, die mit einer Spaltbildung einherging, die sich in die mittleren und tiefen Zonen erstreckte (Abbildung 1 (b)), und in der DHJST-Gruppe ging es mit frühem leichtem Flimmern verloren, und ein Verlust der Safranin-O-Fast-Grünfärbung wurde zusammen mit Chondrozytenclustering beobachtet (Abbildung 1 (c)). OSA-Gruppe mit Verlust der Safranin-O-Fast-Grünfärbung Diese Veränderungen waren ähnlich wie in der DHJST-Gruppe (Abbildung 1 (d)). Am Ende der sechsten Woche nach der Operation gab es signifikant histologische Unterschiede in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Normalgruppe (P < .01). In der Kontrollgruppe war der mittlere Wert für die Safranin O-fast Green-Färbung in der 10. Woche im Vergleich zu dem in der 6. Woche weiter erhöht (P < .01) (Abbildung 2(a)). Am 10. Wochenende gab es signifikante Unterschiede im Mankin-Score zwischen Kontrollgruppe und DHJST-Gruppe, es gab einen signifikant niedrigeren mittleren Score für Safranin O-fast Green-Färbung in der DHJST-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (P < .01) (Abbildung 2(b)) und keine statistisch signifikanten Unterschiede im Mankin-Score zwischen DHJST-Gruppe und OSA-Gruppe (P >.05).

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Figure 1

Histological examination of cartilage (Safranin O-fast green staining, ×100).

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Figure 2

The influence of DHJST on histological parameters and apoptotic of chondrocytes. Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SD (n = 5 pro Gruppe) in jeder Spalte dargestellt. *P < .01 gegenüber der Osteoarthritis-Kontrollgruppe in der 6. Woche, **P < .01, verglichen mit denen in der Osteoarthritis-Kontrollgruppe.

3.2. DHJST gehemmt Knorpelzellen Apoptose

Am Ende der sechsten Woche nach der Operation, der Index der Apoptose-Zelle in der Kontrollgruppe im Vergleich zu dem in der normalen Gruppe waren signifikant Unterschiede (P < .01). In der Kontrollgruppe war der Index der Apoptose-Zelle immer noch stark erhöht (von durchschnittlich ± SD 0,35 ± 0,13 in der sechsten Woche auf 0,62 ± 0,10 in der 10. Woche; P < .01) (Abbildung 2(c)). Am Ende der 10. Woche, im Vergleich zur DHJST-Gruppe, steigt der Index der Apoptose-Zelle in der Kontrollgruppe bemerkenswert an (P < .01) (Abbildung 2(d)). Es gab keine signifikanten Unterschiede im Apoptose-Zellindex zwischen der OSA-Gruppe und der DHJST-Gruppe (P >.05).

3.3. Die Hemmung der VEGF- und HIF-1α-Expression in Knorpelzellen ist mit DHJST verbunden Übt eine therapeutische Wirkung aus

Fluoreszierende quantitative PCR zeigte, dass die Expression von VEGF-mRNA und HIF-1α-mRNA in der normalen Gruppe gering ist; während die Aktivitäten in der Kontrollgruppe im Vergleich zur normalen Gruppe allmählich und signifikant zunehmen (P < .01); In der Kontrollgruppe beginnt HIF-1α in Gelenkchondrozyten in der sechsten Woche nach der Operation zuzunehmen, steigt in der 10.12 in der sechsten Woche und 160,35 ± 72,27 in der 10.05) (Tabelle 2). Am 10. Wochenende war die Expression von VEGF-mRNA und HIF-1α-mRNA in der DHJST-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe nach Verabreichung signifikant verringert (P < .01). Obwohl der VEGF-mRNA- und HIF-1α-mRNA-Spiegel in der OSA-Gruppe tendenziell um 4 Wochen der OSA-Behandlung im Vergleich zu dem in der Kontrollgruppe reduziert wurde, gab es keinen signifikanten Unterschied (Tabelle 3).

4. Diskussion

Das ACLT-Modell ist eines der am weitesten verbreiteten experimentellen OA-Modelle. Kaninchen-ACLT wird zunehmend in OA-Studien eingesetzt, da der Krankheitsbeginn schnell ist. Die Verwendung experimenteller ACLT-Modelle ist von besonderer klinischer Relevanz, da eine Ruptur der ACL beim Menschen auftritt und auch zur Entwicklung von OA führt. Die Studie zeigt, dass eine große Menge an Chondrozyten-Apoptose während des fortschreitenden Stadiums der OA bei Kaninchen vorliegt, das durch eine Operation induziert wird. Die Chondrozytenapoptose ist eine der charakteristischen Veränderungen des OA-Knorpels. Pathologische Apoptose unter der Bedingung einer schädlichen Stimulation könnte zur Freisetzung von Chemotaxis oder Entzündungsfaktoren führen, was wiederum Knorpelverletzungen verschlimmert und Schmerzen aktiviert . Daher könnte die Hemmung der Chondrozytenapoptose eine wichtige Strategie gegen degenerative Veränderungen der Kniegelenke sein. Der Chondrozyten-Apoptose-Index in der DHJST-Gruppe nimmt im Vergleich zu dem in der Modellgruppe signifikant ab, was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Chondrozyten-Apoptose einer der wichtigen Mechanismen von DHJST gegen degenerative Veränderungen sein könnte.

Frühere Studien haben die hypoxische Natur der Mikroumgebung der Gelenkchondrozyten gezeigt. Interessanterweise zeigten osteoarthritische Gelenke einen weiter verringerten Sauerstoffgehalt, eine Rolle der Hypoxie während der Pathogenese von OA . Eine kürzlich durchgeführte Studie beschrieb, dass in Gelenkchondrozyten katabolischer und hypoxischer Stress starke Induktoren des Transkriptionsfaktors HIF-1 sind, der der Hauptregulator der zellulären Anpassung an niedrige Sauerstoffwerte ist. HIF-1 ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben und den Wachstumsstillstand von Chondrozyten während der Knorpelentwicklung sowie für die Energieerzeugung und Matrixsynthese von Chondrozyten in gesundem sowie osteoarthritischem Knorpel. Im osteoarthritischen Knorpel sind die Proteinspiegel von HIF-1 signifikant erhöht und seine Aktivität korreliert mit der Schwere degenerativer Knorpelveränderungen . Die vorliegende Arbeit dokumentiert die Bedeutung des Transkriptionsfaktors HIF-1α für die Aufrechterhaltung der Integrität von hypoxischem Gelenkknorpel. Der Überschuss an HIF-1α fiel mit einer erhöhten Apoptose der Gelenkchondrozyten zusammen und führte zu degenerativen Veränderungen der Kniegelenke. Nach Verabreichung von DHJST nimmt die HIF-1α-Expression im Vergleich zur Modellgruppe ab. Die Ergebnisse zeigen, dass die Wirkung von DHJST auf die Regulationsfunktion von Chondrozyten, möglicherweise durch Hemmung der Aktivität von HIF-1α.

Es ist interessant, dass der Unterschied der Expression von VEGF und HIF-1α zwischen DHJST-Gruppe und OSA-Gruppe nach Verabreichung signifikant ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass bestimmte nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente, wie Indomethacin, entzündungshemmende Wirkungen unabhängig von der HIF-1α-Aktivität verursachen, da Indomethacin die Phosphatidylinositol-3-Kinase oder den extrazellulären signalregulierten Kinase / Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Weg sowie die Erk-Aktivität nicht hemmen konnte . Im Gegensatz dazu ist Indomethacin in der Lage, den Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor-γ zu aktivieren, der gegenüber Natriumsalicylat oder Aspirin nicht empfindlich ist. Die Hemmung der Phosphatidylinositol-3-Kinase oder des Erk-Signalwegs hängt mit der Hemmung von HIF-1α und angiogenen Faktoren zusammen .Hypoxie und verschiedene Wachstumsfaktoren/Zytokine verstärken die VEGF-Expression . VEGF ist nicht nur einer der wichtigsten Angiogenesefaktoren, sondern auch an entzündlichen Prozessen in OA beteiligt und trägt zu Symptomen wie Schmerzen und Schwellungen bei, indem es auf die Synovialmembranen abzielt , chronische Entzündungsreaktionen sind häufig mit der Produktion angiogener Faktoren verbunden, die die Gefäßproliferation induzieren, und bei rheumatoider Arthritis wird VEGF stark in Synovialzellen exprimiert . Da mechanische Überlastung einer der ursächlichen Faktoren für OA ist, untersuchten wir seine Wirkung auf die VEGF-Expression auf Kaninchenknorpel dass die Expression von VEGF nach Verabreichung von DHJST abnimmt, zeigt das Ergebnis, dass DHJST den Gelenkknorpel durch Unterdrückung der VEGF-Expression in Chondrozyten schützen kann (Abbildung 3).

Abbildung 3

Hypothetische Schutzmechanismen von DHJST beim Knorpelabbau.

5. Schlussfolgerungen

Bis jetzt sind die bioaktiven Inhaltsstoffe in DHJST unbekannt, aber unsere Studie zeigt, dass DHJST eine signifikante therapeutische Wirkung auf OA bei Kaninchen ausübt, durch Mechanismen zur Hemmung der Apoptose von Chondrozyten und zur Regulierung der Expression von VEGF, HIF-1α in Chondrozyten. Dies liefert wissenschaftliche Beweise für die Klinik, DHJST bei der Behandlung von OA anzuwenden.

Finanzierung

Die Naturwissenschaftliche Stiftung von Shanghai (Fördernummer: 08JC1418800).