9 El papel de las proteínas en el Núcleo Catalítico del Spliceosoma
Comparar el tamaño de los ARNNS con los intrones mucho más grandes del grupo II plantea la posibilidad de que varios dominios de intrones del grupo II hayan sido reemplazados por proteínas en los spliceosomas durante la evolución, dando lugar a las modernas máquinas de empalme eucariótico de ribonucleoproteínas (RNP). Aunque todavía no existe correspondencia uno a uno, es fácilmente posible identificar proteínas spliceosomales que realizan una función mediada por elementos de ARN en intrones del grupo II. Por ejemplo, una serie de proteínas asociadas a U2 funcionan iniciando y estabilizando la interacción del sitio de la rama del snRNA U2 (Fig. 6.3).5,85 En los intrones del grupo II, el equivalente U2 (parte del dominio VI) está covalentemente unido al sitio de ramificación a través de un bucle de horquilla hiperestable en una disposición que garantiza la formación y estabilidad de su interacción (Fig. 6.2). Desde esta perspectiva evolutiva, no es sorprendente que una gran fracción de proteínas spliceosómicas se asocie directamente con un ARNN, a menudo ayudándolo en su función.5,85 Sin embargo, muchas proteínas spliceosómicas están involucradas en la realización de funciones reguladoras que no se requieren en el contexto de un intrón auto-empalme y es probable que sean adiciones más recientes al complemento de proteínas spliceosómicas.
Como se mencionó anteriormente, se cree que el último ancestro común de los eucariotas tenía un spliceosoma altamente evolucionado y completamente funcional que se parecía a los que se encuentran en los eucariotas modernos.1,2 Aunque este spliceosoma probablemente contenía significativamente menos componentes en comparación con incluso el más pequeño de los spliceosomas modernos, los datos indican que la mayoría de los componentes clave estaban presentes en las primeras versiones de los spliceosomas.1-4 De hecho, un subconjunto del proteoma spliceosómico que incluye proteínas asociadas con el núcleo catalítico muestra un nivel significativo de conservación entre diferentes especies eucariotas, con un número de proteínas spliceosómicas entre las proteínas celulares más conservadas.85,86
Como se mencionó anteriormente, muchas ribozimas bien caracterizadas están asociadas con proteínas in vivo que mejoran su actividad catalítica por varios mecanismos conocidos.83 Estos incluyen estabilizar la estructura funcional de los ARN, ayudar en la unión y posicionamiento de los sustratos, y ayudar en la unión de iones metálicos funcionalmente importantes. Sin embargo, hasta ahora no se ha observado la participación directa en la catálisis de ninguna de las proteínas asociadas a ribozimas estudiadas.83,87 Si se asume que el spliceosoma es una enzima ARN, los ARNNS spliceosómicos son ribozimas inusuales en muchos aspectos. Quizás lo más importante, son inusualmente pequeños para una ruptura de enlace fosfodiéster catalizadora de ribozimas a través de la activación de un nucleófilo no adyacente. Otras ribozimas naturales que catalizan tales reacciones, a saber, los intrones de los grupos I y II y la RNasa P, son al menos dos veces más largas que la longitud combinada de los ARNNS U6 y U2 humanos. Estas ribozimas también son mucho más grandes que las ribozimas nucleolíticas que activan un nucleófilo 2′-hidroxilo adyacente para la escisión del enlace fosfodiéster.24,88,89 Se cree que el tamaño más grande permite que estas ribozimas se plieguen en estructuras complejas estabilizadas por múltiples interacciones terciarias, lo que a su vez les permite crear sitios activos sofisticados capaces de posicionar con precisión el sitio de escisión, los iones metálicos del sitio activo y el nucleófilo remoto para un ataque nucleofílico en línea. Es concebible que los ARNNS U6 y U2, debido a su corta longitud, en el mejor de los casos formen una ribozima de empalme ineficiente que requiere otros factores de empalme para el posicionamiento estable de los elementos del sitio activo y los grupos que reaccionan.
Prp8, que es la proteína spliceosomal más conservada, se cree que desempeña tal papel en el sitio activo spliceosomal. La Prp8 es posiblemente la más interesante de las proteínas spliceosomales, ya que se conserva inusualmente con un 61% de identidad entre levadura y humana.86 Sin embargo, tiene pocos motivos funcionales claramente distinguibles en su longitud de aproximadamente 2300 aminoácidos, y los dominios funcionales que se han discernido hasta ahora son degenerados y probablemente realizan funciones no relacionadas con el papel celular del motivo fundacional original.86 Por otro lado, el Prp8 juega claramente un papel muy crítico en el sitio activo del empalme. Se ha reticulado a los sitios de empalme de 5′ y 3′ y al sitio de ramificación de los ARN premessenger, además de los ARN U5 y U6, lo que indica que está presente en el núcleo catalítico de empalme y entra en contacto directo con los jugadores críticos en la reacción de empalme.86,90 Además, se ha demostrado que Prp8 interactúa con varias proteínas spliceosomales clave, incluidas Snu114 y Brr2 (ver a continuación).86,91,92
Las mutaciones en el Prp8 están asociadas con un amplio espectro de defectos del empalme, incluidas alteraciones en la capacidad de los empalmes para rechazar sitios de empalme subóptimos y supresión de defectos causados por mutaciones en otros factores del empalme como Prp28, Brr2, U4 y U6 snRNAs.86,93,94 Un subconjunto de mutantes Prp8 modula selectivamente la eficiencia del primer o segundo paso de empalme, especialmente en sustratos subóptimos.58,86,95-97 Estas observaciones se explican mejor por una hipótesis que afirma que el Prp8 está involucrado en la estabilización de conformaciones de sitios activos alternativos, mutuamente excluyentes, que están listas para catalizar el primer o el segundo paso de empalme, y que ciertos mutantes del Prp8 podrían conducir a una hiperestabilización selectiva de uno de estos estados.58,96,98 Si bien hay pruebas significativas que sugieren que el Prp8 probablemente esté involucrado en el posicionamiento de los sustratos y la estabilización del sitio activo, actualmente no hay pruebas directas que sugieran o refuten su participación adicional en la coordinación de iones metálicos o la participación directa en la catálisis spliceosomal.
Esta incertidumbre se debe al hecho de que se sabe muy poco sobre la forma en que Prp8 realiza su función. Un innovador ensayo de cribado mediado por transposones indicó que grandes regiones de Prp8 son altamente sensibles a la inserción de transposones y probablemente funcionan como una sola unidad estructural, aunque fue posible insertar transposones o incluso dividir Prp8 en dos fragmentos en varias otras posiciones sin pérdida de viabilidad.90,92 Aparte de una señal de localización nuclear degenerada cerca de su terminal N y un motivo de MRR degenerado (motivo de reconocimiento de ARN) en el medio de la proteína, solo se han identificado otros dos dominios funcionales en esta proteína de aproximadamente 2300 aminoácidos de largo.86
Una variante degenerada del dominio MPN / Jab1 que está asociada con enzimas desubiquitinadoras se encuentra cerca del extremo C de Prp8.86 El análisis de la estructura de alta resolución de un fragmento de Prp8 que contiene este dominio ha demostrado que el sitio de unión a iones metálicos del centro de la isopeptidasa está deteriorado, y por lo tanto es probable que no funcione como una enzima desubiquitinadora.99.100 In vitro, un fragmento de Prp8 que contiene este dominio podría unirse directamente a la ubiquitina con una afinidad que era comparable a otras proteínas de unión a la ubiquitina conocidas.101 Varias mutaciones conocidas de Prp8 que interrumpieron el empalme también interrumpieron la unión de ubiquitina in vitro, lo que aumenta la posibilidad de un papel funcional para la ubiquitinación en la regulación del empalme. Es importante destacar que los análisis proteómicos han indicado que varios factores spliceosómicos, incluidos Sad1, Snu114, Rse1 y el propio Prp8, están ubiquitinados in vivo, y además la proteína central spliceosómica Prp19 exhibe actividad de la ubiquitina ligasa E3 in vitro.101-105 Además, la ubiquitina juega un papel en la formación y mantenimiento de tri-snRNP, posiblemente modulando la regulación mediada por Prp8 de la función de Brr2.102 Alternativamente, también es posible que el dominio MPN/Jab1 funcione como una plataforma de interacción proteína-proteína. Una serie de mutaciones en Prp8 que caen en este dominio dan lugar a la retinitis pigmentosa hereditaria,86 y estas mutaciones debilitaron la interacción de Prp8 con Brr2 y Snu114.99
Se ha determinado la estructura de alta resolución de otro fragmento de Prp8 que abarca una región altamente conservada (69% de identidad de aminoácidos entre levadura y humano) ubicada cerca de su dominio C-terminal. El análisis de la estructura reveló la presencia de un dedo β-horquilla que se asemeja a los encontrados en las proteínas ribosómicas y un dominio degenerado similar a la RNasa H.106-108 Si bien la geometría general del motivo similar a la RNasa H a nivel de estructura secundaria y terciaria estaba bien conservada, la secuencia primaria mostró un nivel de conservación mucho más bajo y solo uno de los tres residuos catalíticos está presente en el sitio activo. El residuo conservado, un aspartato, participa en la coordinación de dos iones metálicos catalíticos en el sitio activo de los dominios canónicos de la RNasa H. En un estudio, la mutación de este residuo en Prp8 en levadura resultó en ningún defecto de crecimiento detectable, lo que podría indicar redundancia o falta de una función crítica.108 En otro estudio, su efecto no se pudo examinar ya que la mutación indujo un plegamiento incorrecto del fragmento de proteína.107 No se observó unión a iones metálicos en la región correspondiente al sitio activo del dominio de la RNasa H cuando los cristales crecieron en hasta 200 mm MgCl2, lo que indica que el sitio activo degenerado carece de capacidad de unión a iones metálicos. Además, el fragmento de Prp8 que contiene este dominio mostró una capacidad de unión de ARN muy débil, con un Kd de 20 µM a más de 200 µM dependiendo de la especie de ARN probada.106-108 Aunque el fragmento mostró una afinidad muy baja por los ARN de unión, mostró una preferencia por los ARN dúplex de unión que contenían uniones de cuatro vías.108 En los spliceosomas humanos activados, se predice que los ARNNS U2 y U6 formarán tal estructura.53,69 Lo que hizo que este Rnasa H-como dominio particularmente interesante fue que los aminoácidos correspondientes a su sitio activo son colocadas junto a los residuos en Prp8 que fueron mostrados anteriormente para entrelazar a los 5′ del sitio de empalme en precatalytic espliceosomas.109 Sin embargo, la eficiencia de la formación de este reticulado se redujo a medida que los spliceosomas precatalíticos progresaban hasta convertirse en complejos spliceosómicos catalíticamente activos.109 La disminución observada en la eficiencia del reticulado podría interpretarse como una indicación de que esta interacción se interrumpe en los spliceosomas activados. Alternativamente, la interacción puede persistir, pero la formación del enlace cruzado en sí se elimina debido a un cambio menor en el entorno de los residuos reticulados. Si este dominio degenerado similar a la RNasa H se coloca en la proximidad del sitio de empalme de 5′ en empalmes catalíticamente activos, es posible que pueda participar en la estabilización de la conformación activa de los ARNNS, el posicionamiento de los sustratos en el sitio activo y/o la coordinación de iones metálicos catalíticos. Si bien el dominio por sí solo no puede unirse a ARN o iones metálicos, es posible que en presencia de otros elementos del sitio activo pueda formar parte del sustrato o bolsas de unión a iones metálicos. A pesar de estas posibilidades intrigantes, el papel del Prp8 en la catálisis spliceosomal sigue siendo incierto.