Bacterias reductoras de sulfato en heces humanas y su asociación con enfermedades inflamatorias intestinales

Resumen

Hemos buscado bacterias reductoras de sulfato en heces de 41 individuos sanos y 110 pacientes de una Unidad de Hepato-Gastroenterología utilizando un medio líquido específico (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francia). Los 110 pacientes se separaron en 22 pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales y 88 pacientes hospitalizados por otras enfermedades del tracto digestivo inferior (n=30) o superior (n=58). Se aislaron bacterias reductoras de sulfato de 10 individuos sanos (24%), 15 pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales (68%) y 33 pacientes con otros síntomas (37%). Se diseñó una PCR múltiple para la identificación de Desulfovibrio piger (anteriormente Desulfomonas pigra), Desulfovibrio fairfieldensis y Desulfovibrio desulfuricans, y se aplicó a los aislados anteriores. Las cepas de bacterias reductoras de sulfato consistieron en D. piger (39 aislados), D. fairfieldensis (19 aislados) y D. desulfuricans (un aislado). La prevalencia de D. piger fue significativamente mayor en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (55%) en comparación con individuos sanos (12%) o pacientes con otros síntomas (25%) (P<0,05).

1 Introducción

La enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU) son enfermedades intestinales inflamatorias crónicas (EII) de etiología desconocida, pero es probable que dependan de factores ambientales, genéticos e inmunitarios . Se ha propuesto un origen infeccioso, y se han implicado muchos microorganismos en ausencia de argumentos convincentes. Sin embargo, en ambos síndromes, la inflamación intestinal responde a la antibioterapia. En modelos animales de colitis crónica, la flora luminal es un cofactor esencial para que se produzca la enfermedad . Esto puede explicar el renovado interés en el papel de la flora intestinal como causa de estos trastornos .

Las bacterias reductoras de sulfato (SRB) son microorganismos anaeróbicos que conducen una reducción de sulfato diferente para obtener energía, lo que resulta en la liberación de una gran cantidad de sulfuro. Por lo general, están aislados de fuentes ambientales, pero también están presentes en el tracto digestivo de animales y seres humanos. As Desulfomonas pigra ha sido reclasificado como Desulfovibrio piger comb. nov. Los aislados humanos de SRB consisten casi exclusivamente en especies de Desulfovibrio . Hallazgos recientes sugieren que el SRB puede tener un papel en las enfermedades humanas. Se han asociado con la gravedad clínica de la periodontitis humana y se han aislado de abscesos profundos (abdominales o cerebrales), sangre u orina . En estos entornos, la mayoría de las cepas se han identificado como Desulfovibrio fairfieldensis, una nueva especie propuesta recientemente , por secuenciación del gen de ARN ribosomal 16S (ADNr 16S). Desulfovibrio desulfuricans, la especie tipo del género Desulfovibrio, también ha sido aislada de especímenes humanos . Se ha sugerido la implicación del SRB en la EII, ya que su producto metabólico final, el sulfuro de hidrógeno, es un compuesto citotóxico . Este compuesto puede actuar a través de una inhibición de la oxidación de butirato, la principal fuente de energía para los colonocitos. El deterioro de las funciones del epitelio intestinal llevaría a la muerte celular y a la inflamación crónica. Sin embargo, aún no se han identificado las especies de SRB asociadas a la EII. Su identificación permitiría buscar factores de virulencia, así como su susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.

En los laboratorios médicos, los SRB rara vez se aíslan de muestras humanas debido a un crecimiento lento. Las colonias aparecen después de más de 3 días de incubación y no se notan, siendo cubiertas por la flora acompañante, a menos que sean la especie dominante o única presente. Por lo tanto, su búsqueda en las heces es difícil a menos que se utilice un medio específico. Estos medios suelen contener un compuesto orgánico (donante de electrones y fuente de carbono), sulfato (aceptor de electrones), hierro y un agente reductor. El crecimiento de SRB en medios de cultivo específicos se detecta fácilmente por un ennegrecimiento del medio debido a la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), lo que resulta en la formación de un precipitado de sulfuro ferroso. Una vez aislado de muestras clínicas, la identificación a nivel de especie puede ser difícil. Por ejemplo, no es posible diferenciar D. fairfieldensis y D. desulfuricans por pruebas fenotípicas. Por lo tanto, la amplificación génica es una herramienta valiosa para lograr dicha identificación.

El objetivo principal de este estudio fue determinar qué especies de Desulfovibrio pueden estar asociadas con EII, si las hay. Para ello, se utilizó un medio líquido específico (Test-kit Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francia) para el crecimiento de la SRB a partir de heces de individuos sanos y de pacientes hospitalizados en la Unidad de Hepato-Gastro-Enterología del Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Francia. Se diseñó una PCR múltiple para la identificación de los aislados a nivel de especie.

2 Materiales y métodos

2.1 Pacientes

Heces de 41 individuos sanos (17 hombres y 24 mujeres; se recogieron 110 pacientes (67 hombres y 43 mujeres; edad media 38 años, intervalo 1-101 años) y 110 pacientes (67 hombres y 43 mujeres; edad media 57 años, intervalo 14-100 años) de la Unidad de Hepato-Gastroenterología del Centre Hospitalier et Universitaire de Nancy, Francia. Individuos sanos consultados consecutivamente para un chequeo. No se encontró ningún microorganismo patógeno en sus heces. Los individuos sanos y los pacientes no han recibido ninguna administración de antibióticos en el mes anterior a la obtención de la muestra. Los pacientes se separaron en tres grupos: la EII (n=22) incluyó 17 EC y cinco CU; otras enfermedades intestinales inferiores (n=30) incluyeron 23 pacientes que presentaban síntomas leves o moderados, como dolor abdominal, problemas de tránsito intestinal y rectorragia, y siete pacientes con cáncer de colon; las enfermedades del tracto digestivo superior (n=58) incluyeron cálculos biliares, cirrosis, carcinoma hepatocelular y tumores gástricos y pancreáticos. La EII se diagnosticó mediante hallazgos clínicos, endoscópicos e histológicos. La mayoría de los pacientes con EII presentaban una enfermedad activa (Tabla 1).

2.2 Detección y enumeración de SRB

Se mezcló un gramo de heces con 4 ml de solución salina tamponada con fosfato y se centrifugó (3000 rpm, 5 min). Se inoculó inmediatamente un mililitro de sobrenadante en un medio líquido (Kit de prueba Labège®, Compagnie Française de Géothermie, Orléans, Francia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, los kits de prueba Labège ® consisten en viales que contienen 9 ml de un medio específico (compuestos orgánicos: lactato y acetato, agente reductor: citrato de titanio) acondicionado anaeróbicamente para la detección de SRB. Se inocula con una jeringa a través de una tapa de goma. Este medio límpido e incoloro se diseñó originalmente para la detección de SRB a partir de muestras ambientales. Se comparó con el medio sólido E de Postgate comúnmente utilizado (compuesto orgánico: lactato, agentes reductores: ácido ascórbico y ácido tioglicólico) , inoculado en paralelo bajo atmósfera anaeróbica. Los SRB se enumeraron utilizando tubos largos y estrechos llenos de este último medio y se inocularon con diluciones decimales de las heces. Todos los medios inoculados se incubaron a 37°C durante 2 meses. La presencia de SRB se determinó por la formación de un precipitado negro (sulfuro ferroso) en medios líquidos y por la aparición de colonias negras en medios sólidos.

2.3 Diseño de cebadores PCR

Las secuencias de ADNr 16S de cepas de Desulfomonas y Desulfovibrio disponibles en la base de datos GenBank se compararon utilizando el software Sequence Navigator, versión 1.0.1 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Permitió diseñar seis cebadores para la identificación por PCR del SRB previamente aislado de seres humanos, relacionados respectivamente con D. piger (anteriormente Desulfomonas pigra) ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, y D. fairfieldensis ATCC 700045. D. desulfuricans Essex 6 y D. desulfuricans MB se diferenciaron ya que las secuencias de ADNr 16S de estas cepas muestran una diferencia del 3%. Los cebadores eran 27K-F (5′-CTG CCT TTG ATA CTG CTT AG-3′), 27K-R (5′-GGG CAC CCT CTC GTT TCG GAG A-3′), Essex-F (5′-CTA CGT TGT GCT AAT CAG CAG CGT AC-3′), Fair-F (5′-TGA ATG AAC TTT TAG GGG AAA GAC-3′), Pig-F (5′-CTA GGG TGT TCT AAT CAT CAT CCT AC-3′), y P687-R (5′-GAT ATC TAC GGA TTT CAC TCC TAC ACC-3′) (Tabla 2). La especificidad de estos cebadores se comprobó en todas las secuencias bacterianas disponibles en la base de datos GenBank utilizando el programa Blast, versión 2.0 (Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda, MD, EE.UU.).

2.4 SRB identification by multiplex PCR

Four collection strains (D. piger ATCC 29098T, D. desulfuricans Essex 6 ATCC 29577T, D. desulfuricans MB ATCC 27774, and D. fairfieldensis ATCC 700045) and 12 clinical strains (two strains related to D. desulfuricans Essex 6, dos cepas relacionadas con D. desulfuricans MB y ocho cepas identificadas como D. fairfieldensis) se utilizaron como controles positivos. La sensibilidad de la PCR se evaluó con diluciones de suspensiones de cepas bacterianas cuantificadas. Se comprobó la especificidad de la PCR con controles negativos que incluían cepas de tipo (Bilophila wadsworthia ATCC 49260T, Desulfovibrio gigas DSM 1382T, Desulfovibrio vulgaris DSM 644T) y cepas clínicas intestinales comunes pertenecientes a las siguientes especies: Bacteroides quebradizo, Bacteroides merdae, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniforme, Bacteroides vulgatus, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Bacterias inofensivas, Enterobacter imperio romano, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium pequeño, Eubacterium pegajoso, Fusobacterium nucleatum, Copenhague del canal, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Peptostreptococcus big, Proteus wonderful, Proteus common, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, y Streptococcus bovis.

Al final del tiempo de incubación, se comprobaron los 151 kits de prueba inoculados Labège® utilizando la PCR múltiple. Se obtuvieron extractos de ADN a partir de 500 µl de medio de cultivo, tras centrifugación y resuspensión en tampón TE (10 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Brevemente, las células se lisaron utilizando lisozima (3 mg ml−1), SDS (1%, p/v) y proteinasa K (0,25 mg ml−1) sucesivamente. Después de una incubación nocturna a 37°C, se extrajo ADN por el método estándar de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. Cada mezcla de PCR de 50 µl contenía 5 µl de extracto de ADN (aproximadamente 50 ng de ADN) y cantidades finales de 0,4 µM de cada imprimación, 0,8 mm de cada trifosfato de desoxinucleósido (Boehringer Mannheim Biochemicals, Mannheim, Alemania), 0,4 mm de tampón Tris–HCl, 1,5 mm MgCl2 y 1,5 U de polimerasa de ADN Taq (Gibco BRL Life Technologies, Paisley, Reino Unido). Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando el GeneAmp PCR System 2400 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA). Un paso inicial de desnaturalización de 94°C durante 4 min fue seguido por 30 ciclos de desnaturalización (94°C, 1 min), recocido (55°C, 1 min) y extensión (72°C, 2 min), y con una extensión final (72°C, 5 min). Se incluyeron controles negativos (agua en lugar de extracto de ADN) y positivos (extracto de ADN de D. fairfieldensis) en cada corrida. Los productos amplificados se resolvieron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% (p/v) que contenían bromuro de etidio (1,6 mg ml−1). Se utilizó una escalera de ADN de 100 bp como marcador de tamaño (Gibco BRL Life Technologies, Rockville, MD, EE.UU.). D. piger, D. desulfuricans Essex 6, D. los desulfuricanos MB y D. fairfieldensis fueron identificados por una banda de 255, 255, 396 y 534 pa, respectivamente. D. piger y D. desulfuricans Essex 6 se diferenciaron aún más mediante ensayos de PCR separados utilizando sus respectivos cebadores específicos. Para las muestras negativas, se realizó una amplificación del ADNr de 16S utilizando los cebadores de consenso 27f y 1525r para verificar la ausencia de inhibición de los RCP por contaminantes.

3 Resultados

3.1 Detección y enumeración de SRB

En individuos sanos y de acuerdo con los criterios anteriores, se encontraron SRB en 10 heces (24%) con el kit de prueba Labège® y el medio Postgate. En pacientes de la Unidad de Hepato-Gastro-Enterología, se cultivaron SRB a partir de 42 heces utilizando el medio de Postgate. Se encontraron tres muestras adicionales positivas con el kit de prueba Labège®. Así, entre los 110 pacientes estudiados, se detectaron BSR por cultivo en 45 pacientes (41%). Tres muestras adicionales dieron resultados equívocos con el kit de prueba Labège® (presencia de un precipitado marrón oscuro). Los tiempos medios de detección del crecimiento de SRB fueron de 2 y 6 días utilizando el kit de prueba Labège® (rango 1-11 días) y el medio Postgate (rango 3-39 días), respectivamente. El recuento medio de SRB en las heces de individuos y pacientes sanos fue de 105 g−1 (rango 102-109 g−1). Por lo tanto, el recuento de SRB no se relacionó con el estado clínico de los pacientes.

3,2 Identificación de SRB por PCR múltiple

La sensibilidad del ensayo de PCR múltiple fue de 100 bacterias por ml. Su especificidad se determinó por la ausencia de reacciones cruzadas entre las cuatro genoespecies diferenciadas. Cada control positivo se encontró positivo únicamente con el conjunto correspondiente de cebadores. Todas las cepas utilizadas como controles negativos para verificar la especificidad, incluidas las cepas de tipo de D. gigas y D. vulgaris, dieron resultados negativos con los cuatro juegos de cebadores. La especificidad de las reacciones se confirmó mediante la secuenciación de los productos amplificados. Las secuencias obtenidas siempre correspondían a las esperadas. En el caso de las muestras negativas de SRB por PCR, la amplificación del ADNr 16S permitió descartar la posibilidad de inhibición de los RCP por contaminantes.

En pacientes de la Unidad de Hepato-Gastro-Enterología, las 45 heces positivas y las tres equívocas dieron resultados positivos por PCR. Correspondían a D. piger (n = 33), D. fairfieldensis (n=14) o ambos (n=1). No se evidenció D. desulfuricans (Tabla 3). Los matraces con cultivo negativo también fueron negativos por PCR.

3.3 Relación de las especies de Desulfovibrio con EII

La distribución de las especies no difirió significativamente al comparar individuos sanos y pacientes con enfermedades intestinales no inflamatorias. D. piger era apenas más frecuente que D. fairfieldensis. Por el contrario, en pacientes con EII, D. piger fue 4 veces más frecuente que D. fairfieldensis. Esta diferencia fue especialmente notable para la EC, ya que los pacientes con EII consistían principalmente en pacientes con EC. Además, la prevalencia de D. piger fue significativamente mayor en pacientes hospitalizados por EII en comparación con individuos sanos o pacientes hospitalizados por otras patologías (P<0,05). No hubo relación entre el estadio de la enfermedad y la presencia de SRB. La terapia no modificó la tasa de aislamiento de estas bacterias.

4 Discusión

La presencia de SRB en el tracto intestinal de animales y humanos ha sido reconocida durante mucho tiempo, aunque las identificaciones a nivel de especie rara vez se han realizado. Nuestros resultados confirman que estas bacterias son habitantes comunes del tracto intestinal de los seres humanos. La mayoría de los estudios de SRB intestinal de pacientes con EII se han basado en el análisis microbiológico de muestras fecales basado en el cultivo y, por lo tanto, han identificado SRB a nivel de género . Sin embargo, estudios recientes han sugerido que el posible papel del SRB en la patogénesis de la EII puede estar relacionado con diferencias fisiológicas y/o filogenéticas entre cepas de SRB . Por lo tanto, ideamos una PCR múltiple para identificar estas bacterias a nivel de especie. Teniendo en cuenta la dificultad del aislamiento y la rareza de búsquedas específicas, la prevalencia de SRB en muestras clínicas humanas está ciertamente subestimada. El kit de prueba Labège®, desarrollado para la detección de SRB a partir de muestras ambientales, demostró ser un medio adecuado para la detección de SRB a partir de heces y fluidos corporales (Loubinoux, resultado no publicado). El fabricante ha demostrado que cultiva cepas ambientales de SRB como D. desulfuricans DSM 1926, Desulfotomaculum nigrificans DSM 574T, Desulfobacter postgatei DSM 2034T y Desulfobulbus propionicus DSM 2032T. En nuestras manos, demostró ser más sensible que el medio Postgate de uso común, ya que se detectaron seis aislados adicionales de Desulfovibrio en pacientes. A pesar de la abundante flora acompañante, el kit de prueba Labège® permitió un crecimiento rápido del SRB a partir de muestras de heces, ya que el tiempo medio de detección fue de 2 días (frente a 6 días en el medio de Postgate). Esto puede estar relacionado con la calidad del medio, pero también con el modo de inoculación de muestras que garantiza el mantenimiento de anaerobiosis estricta. En comparación con el medio de Postgate, la adición de acetato al lactato amplía el espectro de detección para incluir acetato de crecimiento lento que metaboliza SRB, como Desulfobacter spp. Además, la presencia de citrato de titanio, que es un agente reductor muy eficiente (el potencial redox del kit de prueba Labège® es de aproximadamente -600 mV), permite una detección más rápida de la mayoría de las cepas de SRB.

Es posible que algunas cepas de SRB no hayan sido detectadas por los kits de prueba Labège®, estando cubiertas por la flora acompañante o debido a un bajo número de muestras. Sin embargo, el kit de prueba Labège® está adaptado al crecimiento de la mayor parte de SRB, y todos los matraces positivos fueron identificados por PCR como D. piger, D. fairfieldensis o D. desulfuricans. A pesar del tiempo de incubación de 2 meses, no se evidenció ninguna especie adicional. Por lo tanto, es posible que nuestros hallazgos se correspondan con la flora humana real que consiste casi exclusivamente en D. piger y D. fairfieldensis. D. desulfuricans se aisló una vez y también se describió en humanos en un estudio previo , pero es probablemente poco común en el tracto intestinal. En la mayoría de los casos, D. piger y D. fairfieldensis eran mutuamente excluyentes. Solo se observó una asociación de ambas especies en un caso de cáncer de colon. Para confirmar la aparición casi no solapada de D. piger y D. fairfieldensis, se han identificado cinco colonias de SRB cultivadas en medio sólido de Postgate por PCR para cada kit de prueba positivo Labège®. En cada caso se obtuvo el mismo resultado y las cinco colonias pertenecían a la misma especie (datos no mostrados). También hemos realizado un seguimiento de 10 pacientes (cinco positivos para SRB y cinco negativos para SRB) durante 2 meses y se cultivaron heces cada semana. Para cada paciente, se obtuvo el mismo resultado (SRB positivo o SRB negativo) con todas las muestras (no se muestran los datos). Sin embargo, sería interesante seguir a los pacientes con EII durante un período de tiempo más largo para determinar si la actividad de la enfermedad tiene una consecuencia en la población de SRB.

D. desulfuricans es comúnmente aislado del medio ambiente, y también ha sido considerado como la especie más prevalente de Desulfovibrio en humanos hasta la reciente descripción de D. fairfieldensis. Por lo tanto, uno puede sorprenderse por la muy baja incidencia de D. desulfuricans en nuestra población. Hasta ahora, D. piger y D. fairfieldensis han sido aislados únicamente de muestras humanas. Por lo tanto, nuestros resultados muestran que ambas especies pueden ser específicas para el tracto intestinal humano. Sin embargo, esto queda por determinar por la búsqueda específica de estas bacterias en otros nichos ecológicos. D. piger se ha descrito solo una vez, y se consideró un hallazgo poco común en humanos. Nuestros resultados indican que puede ser el SRB más común en el tracto intestinal. Sin embargo, esta especie nunca ha sido descrita en procesos infecciosos. Al contrario, D. la fairfieldensis, aparentemente menos común en las heces humanas, se ha aislado fuera de la luz colónica de las colecciones de sangre y sépticas . Por lo tanto, D. fairfieldensis puede poseer propiedades invasivas adicionales en comparación con otras especies de Desulfovibrio, lo que explicaría su recuperación a partir de muestras clínicas. Curiosamente, en nuestra serie de pacientes, la prevalencia de D. piger en las heces es significativamente mayor en pacientes hospitalizados por EII (principalmente EC) que en individuos sanos o en pacientes hospitalizados por otras patologías. Esto puede tener dos explicaciones: o bien D. piger tiene características fisiológicas que causan la aparición de lesiones y/o participan en la perpetuación de procesos inflamatorios crónicos, o la colonización por esta especie es favorecida por las condiciones locales en pacientes con EII. Ya se ha descrito la asociación del SRB con la EII . D. piger no se ha considerado más desde su primera descripción en 1976 . Por lo tanto, el hallazgo de que esta bacteria, considerada como una especie ‘no patógena’, es un habitante común del tracto intestinal humano y la especie más prevalente de SRB en pacientes con EII es sorprendente. Se deben realizar estudios adicionales para dilucidar la forma en que D. piger puede estar implicado en estos procesos inflamatorios crónicos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por la Compagnie Française de Géothermie (Orléans, Francia) y por una beca FCT POCTI 36562/ESP / 2000 al ICP. Estamos en deuda con el difunto Dr. Wee Tee (Universidad de Melbourne, Australia) por proporcionar amablemente cuatro cepas de D. fairfieldensis (incluida la cepa ATCC 700045) y también con el Prof. D. Raoult (Universidad de Marsella, Francia) por proporcionar una cepa de D. fairfieldensis. Agradecemos a D. Meng y A. M. Carpentier (Laboratoire de Bactériologie-Virologie UMR CNRS 7565) por su excelente asistencia técnica, el Dr. A. Dao y el Prof. B. Fortier por proporcionar heces de personas sanas, así como las enfermeras de la Unidad de Hepato-Gastro-Enterología por su amabilidad.