Si tuviera tiempo suficiente y un entorno sin vibraciones, podría esperar pacientemente y la fuerza de gravedad llevaría la mayoría de las partículas suspendidas al fondo de un tubo de centrífuga. Las partículas más pequeñas probablemente permanecerían en suspensión debido al movimiento browniano, y la mayoría de las macromoléculas se distribuirían uniformemente porque estarían en solución en lugar de suspensión. No se usted, pero no tengo el tipo de paciencia necesaria para confiar únicamente en la gravedad para la separación de componentes sólidos de líquidos. Además, para fines prácticos, el pellet que obtuviera se interrumpiría con demasiada facilidad para una separación efectiva del material sólido del sobrenadante. La gravedad no sería una forma terriblemente efectiva de separar materiales suspendidos en función del tamaño u otras características.
Descripción de las condiciones de centrifugación
Al describir una operación de centrifugación en materiales y métodos, rara vez es necesario informar más que la fuerza, el tiempo y la temperatura de la centrifugación. La velocidad requerida (rpm) depende de la centrífuga y el rotor utilizados, que variarán de un laboratorio a otro. Por lo tanto,rara vez es relevante informar la marca de la centrífuga, el tipo de rotor o la velocidad.
El proceso de centrifugación
La centrifugación produce una fuerza centrípeta que puede ser cientos o miles de veces la fuerza de gravedad, acelerando así el proceso considerablemente. Cuanto mayor sea el número de revoluciones por minuto (RPM), mayor será la fuerza de gravedad. La utilidad de la centrifugación en el fraccionamiento celular sería limitada si todo lo que pudiéramos hacer fuera conducir partículas suspendidas al fondo de un tubo. Sin embargo, los investigadores son capaces de controlar el tamaño de las partículas que se bajan, gracias a la física de las partículas en suspensión.
En una suspensión de partículas redondas de igual densidad pero diferentes diámetros, la fuerza que impulsa a una partícula dada al fondo es igual a su masa por la aceleración aplicada. El volumen de la partícula es una función de su radio, y su masa es igual a su volumen por su coeficiente de densidad, que es una constante. El volumen de una esfera es igual a 4/3 veces pi (una constante) veces el cubo del radio. Para una suspensión de partículas esféricas de igual densidades bajo un conjunto específico de condiciones, la única variable que determina la fuerza sobre una partícula es su radio.
La resistencia al movimiento a través de una solución es proporcional a la parte de la superficie que empuja a través del medio. Para partículas de forma similar, las partículas más pequeñas encuentran menos resistencia que las más grandes. Dado que el área de superficie de una esfera es 4 veces pi por el cuadrado del radio, y 4 veces pi es una constante, entonces para partículas esféricas de composición igual, la única variable que determina la resistencia bajo un conjunto dado de condiciones es el radio de la partícula.
La fuerza motriz aumenta proporcionalmente al cubo del radio. La resistencia al movimiento aumenta proporcionalmente al cuadrado del radio. No es difícil ver que a medida que aumenta el radio de una partícula, también aumenta su tendencia a acercarse al fondo. Agregue una cantidad significativa de ‘arrastre’, y el experimento de gravedad que se ha atribuido a Galileo no funciona tan bien, después de todo. Dado que las partículas grandes se sedimentan más rápidamente que las partículas pequeñas, un investigador puede separar orgánulos, células, etc. grandes de pequeños. simplemente controlando el tiempo y las rpm de una centrifugadora.
Fraccionamiento por centrifugación diferencial
Para un homogeneizado celular típico, a 10 min. el giro a baja velocidad (400-500 x g) produce un pellet que consiste en tejido ininterrumpido, células enteras, núcleos celulares y desechos grandes. El pellet de baja velocidad se llama tradicionalmente el pellet nuclear. A 10 min. girar a una velocidad moderadamente rápida, produciendo fuerzas de 10,000 a 20,000 x g hace descender las mitocondrias junto con los lisosomas y peroxisomas. Por lo tanto, el segundo pellet en el esquema de fraccionamiento celular tradicional se llama pellet mitocondrial.
El fraccionamiento de células por centrifugación diferencial requiere el uso de una ultracentrífuga. Este instrumento está diseñado para girar rotores a altas velocidades angulares, para generar fuerzas g muy altas. El aire debe bombearse fuera de la cámara para evitar la acumulación de calor debido a la fricción del aire. De hecho, muchos rotores que están diseñados para una ultracentrífuga ni siquiera se construyen aerodinámicamente, ya que se giran en vacío. Una ultracentrífuga de alta velocidad de una hora que genera una fuerza del orden de 80.000 x g produce un pellet microsomal. Los microsomas incluyen fragmentos de membrana, incluida la membrana celular y el retículo endoplásmico. Los fragmentos de membrana forman vesículas cuando se interrumpen en un medio acuoso, por lo que el examen revelaría numerosas vesículas de membrana de varios tamaños. Las propias vesículas se pueden separar en función de la densidad, debido a la variación del contenido de proteínas. Pero ese es un tema para otro documento.
Gire durante varias horas a 150.000 x g o algo así, y podrá eliminar los ribosomas e incluso las macromoléculas más grandes. El sobrenadante que queda consiste en componentes solubles del citoplasma, incluyendo sales, pequeñas macromoléculas y moléculas precursoras, y gases disueltos.