Discusión
El método de citometría de imagen propuesto en este trabajo demuestra la capacidad de analizar rápida y eficientemente la autofagia en células vivas para detectar posibles medicamentos que pueden inducir o inhibir actividades autofágicas, como promover la eliminación de proteínas mal plegadas asociadas con la neurodegeneración o inhibir la resistencia a los medicamentos asociada con el cáncer. La limitación en los métodos actuales se puede superar mediante citometría de imagen y reactivos únicos para desarrollar un método novedoso para la detección de autofagia. La Visión del celómetro se ha utilizado previamente para ensayos basados en células fluorescentes (Chan et al., 2011, 2012b; Robey et al., 2011), y se ha demostrado que el tinte de autofagia Cyto-ID tiñe específicamente autofagosomas en células vivas. En este trabajo, se muestra que el tinte Cyto-ID se coloca con RFP-LC3 en células HeLa hambrientas, lo que valida aún más la especificidad del tinte. El método de detección de autofagia basado en imágenes desarrollado se compara con la citometría de flujo estándar comparando los resultados de la actividad de autofagia en células Jurkat carentes de nutrientes. Los resultados mostraron un aumento de la intensidad fluorescente en las células carentes de nutrientes y una disminución en las células Jurkat recuperadas. Sin embargo, los valores medidos de AFA de la citometría de imagen son considerablemente más altos que la citometría de flujo, lo que podría deberse a diferencias entre la instrumentación y los métodos. El citómetro de imagen de visión del Cellómetro utiliza un dispositivo de carga acoplada para la medición de fluorescencia, mientras que el citómetro de flujo Calibur de FACS utiliza un tubo multiplicador de fotos (PMT). Además, el método para analizar las intensidades fluorescentes también difería entre los dos sistemas. El citómetro de flujo mide las señales de fluorescencia total de cada célula, mientras que el sistema basado en imágenes adquiere imágenes y analiza autofagosomas teñidos fluorescentemente dentro de las células, lo que puede proporcionar mediciones más precisas de la actividad autofágica. El software Cellometer puede analizar la fluorescencia de las células sumando el total de píxeles fluorescentes en cada célula, o midiendo solo los píxeles de alta intensidad fluorescente de los autofagosomas dentro de cada célula. Otra diferencia podría ser causada por el esfuerzo cortante de la citometría de flujo que afecta la viabilidad de las células diana (Robey et al., 2011).
El flujo autofágico también es un ensayo importante para desarrollar un nuevo método de detección. La CQ se emplea para inhibir la degradación lisosómica de los autofagosomas, donde la actividad autofágica sería la más alta para las células Jurkat hambrientas de nutrientes en presencia de CQ debido a la interacción sinérgica entre los tratamientos. La siguiente más alta serían las células Jurkat en inanición sin CQ. Solo un ligero aumento en la actividad autofágica sería exhibido por las células Jurkat con CQ solo en comparación con el control debido a la acumulación de autofagolisosomas basales. Los resultados de flujo autofágico obtenidos de ambos instrumentos mostraron tendencias similares, pero los valores de FAA medidos en citometría de imagen son significativamente más altos. Estos resultados demostraron que el método de detección citométrica de imágenes se podía implementar fácilmente para examinar la actividad de la autofagia, a pesar de las diferencias cuantitativas potencialmente específicas del instrumento en los valores de FAA.
Para demostrar que la citometría de imagen puede ser una tecnología de detección de descubrimiento de fármacos potencial, se debe probar la capacidad de analizar muestras en múltiples condiciones. La citometría por imágenes se utiliza para medir la actividad autofágica de las células Jurkat tratadas con rapamicina en varias concentraciones, para demostrar la capacidad de la citometría por imágenes para medir los efectos de la dosis–respuesta a lo largo de un estudio de un curso de tiempo. Como resultado, la citometría basada en imágenes es capaz de detectar las diferencias en la actividad autofágica en varias condiciones experimentales. En la Fig. 8.6, la actividad autofágica (medida por los valores de FAA) es la más alta después de 18 h de incubación. Se observa una ligera disminución de los valores de FAA entre las 8 y 4 h de incubación, lo que puede deberse a que las células no se recuperan completamente después del tratamiento farmacológico inicial. Además, las células adherentes, como la línea celular de cáncer de próstata humano (PC-3), también se pueden medir mediante el método de citometría por imágenes. La resolución de imagen de la Visión del celómetro puede analizar autofagosomas marcados fluorescentemente (puntos), observados tanto en imágenes fluorescentes como en histogramas de intensidad de fluorescencia.
También es importante demostrar la capacidad de caracterizar diferentes compuestos farmacológicos comparando su efecto dosis–respuesta autofágica para campañas de descubrimiento de fármacos. Los efectos de respuesta a la dosis del tamoxifeno y la rapamicina se comparan directamente mediante citometría de imagen. Los resultados a las 18 h de incubación mostraron que la rapamicina inducía un mayor nivel de actividad autofágica que el tamoxifeno. Es importante tener en cuenta que el tamoxifeno a 100 µM es altamente citotóxico, lo que lleva a la muerte y desintegración de las células Jurkat después de 18 h de incubación. La verificación basada en imágenes del efecto de citotoxicidad en tamoxifeno a alta concentración puede ser muy útil para eliminar incertidumbres de los resultados de gráficos de dispersión e histogramas.
La citometría de imagen ha demostrado resultados comparables a la citometría de flujo estándar para análisis basados en células fluorescentes (Chan et al., 2011; Robey et al., 2011). El método de citometría basado en imágenes puede ofrecer varias ventajas sobre la citometría de flujo. Por ejemplo, el número de células necesarias para cada muestra (10-20 µL) es significativamente menor que un citómetro de flujo convencional (300-500 µL). La configuración inicial en el citómetro de flujo requiere que algunas de las muestras de células objetivo se utilicen para los voltajes de PMT y el ajuste de compensación. Por otro lado, muchos citómetros de imagen pipetean células en una cámara de conteo que se puede volver a escanear varias veces. Por lo tanto, las muestras de células objetivo no se desperdician durante la optimización inicial del ajuste del tiempo de exposición y el enfoque. Más importante aún, la ventaja de capturar imágenes BR y fluorescentes permite a los investigadores verificar visualmente los datos de fluorescencia adquiridos. Esto puede ayudar a identificar la citotoxicidad como un efecto secundario complicado de un ensayo de tratamiento farmacológico que induce autofagia.
La autofluorescencia puede ocurrir utilizando el tinte de autofagia verde Cyto-ID debido a la cámara de conteo de plástico, pero el software puede eliminar automáticamente la señal de fondo para obtener la fluorescencia objetivo real sin alterar el cálculo de AAF. Además, se minimiza el fotoblanqueo de sondas fluorescentes en ensayos basados en células, ya que la Visión del celómetro utiliza ledes de menor potencia en comparación con los láseres de alta potencia utilizados en otros instrumentos. La mejora futura del citómetro de imagen de celómetro sería desarrollar un sistema automatizado de mayor rendimiento que pueda analizar más células para mejorar el análisis estadístico, así como la capacidad de analizar múltiples muestras simultáneamente, facilitando la detección de fármacos basados en células de mayor rendimiento de inhibidores y activadores de autofagia, apoptosis, necrosis y otros fenómenos fisiológicos de interés.