El bloqueo dual de CD47 y HER2 elimina las células radiorresistentes de cáncer de mama

Líneas celulares

Cáncer de mama humano MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549, líneas celulares SKBR3, glioblastoma U251 y líneas celulares HCT116 de cáncer de colon se compraron en ATCC. Las células MCF-7, MDA-MB-231, BT474, BT549 y U251 se mantuvieron en medio DMEM suplementado con 10% de FBS, y las células SKBR3 se mantuvieron en medio RPMI-1640 con 10% de FBS. Las células HCT116 se mantuvieron en el medio 5a de McCoy con 10% de FBS. Las líneas celulares radiorresistentes MCF7/C6 y MDA-MB-231/C5 que se clonaron a partir de fracciones sobrevivientes de células MCF7 y MDA-MB-231 después de irradiación repetida; las células madre de cáncer de mama con sobreexpresión HER2 (HER2+/CD44+/CD24-/CCB bajas) se aislaron de MCF7/C626. Las células 4T1 de cáncer de mama triple negativo de ratón se mantuvieron en medio DMEM con 10% de FBS. El THP-1 de monocitos humanos se cultivó en medio RPMI-1640 formulado con ATCC suplementado con 10% de FBS, 15 mm HEPES, 4,5 g/l de glucosa y 2-mercaptoetanol hasta una concentración final de 0,05 mm Mφ DE ratón CRUDO 264. se cultivaron 7 células en medio DMEM con un 10% de FBS siguiendo el método de cultivo ATCC. Todas las líneas celulares fueron analizadas con contaminación por micoplasma negativa con el kit de ensayo de PCR MicoSensor (Agilent Technologies, Catálogo # 302108).

Plásmidos y reactivos

El vector de luciferasa controlado por promotor CD47 se construyó clonando la región promotora CD47 humana (-1554 nt) en plásmido básico pGL2 de los sitios KpnI/Hind III. La eliminación de los supuestos sitios de unión a NF-kB (TGGAAGCT-764-757) se realizó utilizando un kit de mutación rápida (Stratagene, La Jolla, CA). Las secuencias de imprimación utilizadas: 5 ′-GTGGTCGGGTACCTGCCCGCTCGCCCCTCGCGGGCTCTGCG-3′ (sense) and 5 ′-CGCAGAGCCCGCGAGGGGCGAGCGGGCAGGTACCCGACCAC-3′ (antisense).

pGL2-NF-κB-luc plasmid was constructed with the 3 NF-κB-binding sites: GTGGGTTCCC, TCGCCACTCCCC, and TGGAAAGTCCCC by blunt-end ligation. IMD-0354 (Catalog # I3159) and TNF-α (Catalog # T0157) were purchased from Sigma. The lentiCRISPR v2 vector was purchased from the Addgene plasmid repository (Catalog # 52961). Herceptin was obtained from the UC Davis Comprehensive Cancer Center Pharmacy as left-over medicine (Genentech, NDC 50242-132-01). Lapatinib ( Catálogo # S1028) se compró a Selleckchem. El anticuerpo anti-CD47 (B6H12) para IHC, ICC y western blot se compró en Santa Cruz (Catálogo # sc-12730). El Anti-CD47-FITC para citometría de flujo se compró a BD Biosciences ( Catálogo # 556045). Se extrajo anticuerpo anti-CD47 humano (B6H12) para el ensayo de fagocitosis del hibridoma B6H12.2 (ATCC® HB-9771™). El anticuerpo anti-ratón CD47 para la inhibición tumoral in vivo se extrajo del hibridoma MIAP301 proporcionado por el Dr. William Frazier (Facultad de Medicina de la Universidad de Washington). El anticuerpo anti-CD11b para tinción IHC se compró a Invitrogen (Catálogo # MA5-17857). El anticuerpo monoclonal anti-α-tubulina de ratón para western blot se compró a Sigma-Aldrich (Catálogo # T6074). El anticuerpo monoclonal anti-β-actina de ratón para western blot se compró a Sigma-Aldrich ( Catálogo # A5441). El anticuerpo anti-HER2/ERBB2 (Catálogo # 29D8) para tinción IHQ y western blot se compró a Cell Signaling Technology (Catálogo # 2165). El anticuerpo anti-HER2-APC para análisis de citometría de flujo se compró a BD Biosciences ( Catálogo # 340554).

Proteínas inmunoblotantes

de células o tejidos tumorales se extrajeron en tampón de lisis RIPA (Pierce) suplementado con cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa (Señalización Celular). La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo BCA (Pierce). Los lisados se desnaturalizaron y las muestras que contenían proteínas de 30 µg se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 10%, seguidas de transferencia a membranas de difluoruro de polivinilideno (Bio-Rad). Después del bloqueo con leche seca descremada al 5%, la membrana se expuso al anticuerpo primario y se incubó a 4 °C durante la noche. Los blots se visualizaron mediante el etiquetado con anticuerpos secundarios acoplados a HRP (Sigma-Aldrich) y la incubación con reactivo de detección de blotting occidental Amersham ECL (Catálogo # RPN2106). Los blots se desarrollaron en un desarrollador Konica SRX101A y se cuantificaron con ImageJ.

Análisis de citometría de flujo

Las células recolectadas se enjuagaron con PBS que contenían 0,5% de ASC en PBS y los gránulos de células se incubaron con anticuerpos primarios marcados con fluorescencia a 37 °C durante 30 min, seguido de un lavado tres veces con 0,5% de ASC / ASC. Todos los anticuerpos fueron titulados para optimizar la condición antes de aplicarlos al experimento. El análisis de citometría de flujo se realizó con el citómetro FACS Canto II (BD) y el análisis posterior se realizó con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA). Las estrategias de apertura se basaron en las propiedades FSC y SSC y se establecieron para poblaciones de células positivas en los canales FITC y APC.

Tejidos de cáncer de mama humano

Tejidos de cáncer de mama positivo y negativo de HER2 frescos congelados fueron proporcionados por el Biorepositorio del Centro Oncológico Integral de UC Davis (IRB # 283665 e IRB # 218204) financiado por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico Integral de UC Davis (CCSG) otorgada por el Instituto Nacional del Cáncer (NCI P30CA093373) con toda la información del paciente bloqueada, excepto los resultados de diagnóstico. Se obtuvieron muestras patológicas adicionales de cáncer de mama humano, incluidas secciones de 4 µm de espesor sin teñir de cáncer de mama primario de mama con incrustación de parafina fija con formalina (FFPE) y cánceres de mama recidivantes emparejados del departamento de patología de la Universidad Estatal de Ohio con la aprobación de research IRB (#2002H0089).

Inmunohistoquímica (IHC)

La tinción inmunohistoquímica se realizó en secciones de tejido de FFPE de 4 µm de espesor. Brevemente, los portaobjetos se desparafinizaron y rehidrataron, y los antígenos se recuperaron durante 40 min en un tampón de citrato (pH 6,1) a 95 °C. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con una solución de H2O2 al 3%. La incubación primaria de anticuerpos se realizó a 4 °C durante la noche, seguida del kit Vectastain ABC (Laboratorios Vectoriales) a RT durante 30 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos de reacción se detectaron utilizando un Kit de Sustrato de Peroxidasa y se colorearon con hematoxilina (Laboratorios Vectoriales). Dos patólogos de alto nivel se encargaron del diagnóstico de cánceres de mama en la clínica y de la evaluación de tumores experimentales. La expresión de CD47 se evaluó utilizando la intensidad de tinción y el porcentaje de células teñidas. La intensidad de la tinción se calificó como 0: negativa; 1: débil; 2: moderada; 3: fuerte. La expresión alta se definió como intensidad de tinción fuerte en más del 25% de las células tumorales; la expresión media fue intensidad de tinción moderada en más del 25% de las células tumorales; la expresión baja fue intensidad de tinción débil en más del 25% de las células tumorales o tinción moderada en <se utilizó el 25% de las células tumorales utilizando las guías ASCO-cap63 para la interpretación de la inmunohistoquímica HER2 (IHC), y la expresión de proteína HER2 se calificó como IHC 0 negativo (sin tinción o tinción de membrana incompleta y débil/apenas perceptible y dentro de ≤10% de las células tumorales invasivas) o IHC negativo 1+ (tinción incompleta de membrana que es débil/apenas perceptible y dentro de >10% de las células tumorales invasivas); IHC 2 + equívoco (tinción de membrana circunferencial incompleta o débil/moderada y dentro de >10% de las células tumorales invasivas; o tinción de membrana circunferencial completa intensa y dentro de ≤10% de las células tumorales invasivas); IHC 3+ positivo (tinción de membrana circunferencial completa e intensa en más de 10% de las células tumorales invasivas). Si los resultados eran equívocos (2+), se realizaron pruebas de reflejos mediante hibridación in situ (ISH). Para detectar la expresión de CD47 de tumores irradiados in vivo, se extirparon tumores de ratón tratados y se fijaron en 4% de paraformaldehído en PBS durante 24 h.Las muestras se deshidrataron con etanol en serie (70, 95 y 100%) durante 48 h antes de incrustarse en la solución de parafina (Polisciencias).

Inmunocitoquímica (ICC)

Las células se sembraron en cubreobjetos redondos y crecieron hasta un 60-80% de confluencia, seguido de enjuague con PBS, fijación en 4% de paraformaldehído (pH 7,2) y permeabilización con 0,1% de Tritón X-100 en PBS. Las células se incubaron en una solución de bloqueo durante 15 minutos antes de la incubación con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C con diluciones de 1:250. Las células se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados TR o FITC diluidos 1:1000 en la solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizaron con microscopía confocal.

Identificación de proteínas antigénicas asociadas a la radiación

El ratón C57 / B6 se utilizó como huésped de inmunización con células MCF7/C6 de 5 × 106 en 0.1 ml de volumen inyectado en la base de la cola o la almohadilla para los pies por ratón, seguido de un aumento con el mismo volumen de células al día 14. Entre el 5 y el 7 días después del segundo desafío, los ratones fueron sacrificados y el suero se recolectó para detectar moléculas antigénicas expresadas en células BC radiorresistentes. Con el fin de distinguir la RAAP de moléculas inespecíficas expresadas en células epiteliales mamarias normales y células MCF7 de tipo salvaje, se realizó un procedimiento de limpieza previa con el suero crudo siguiendo los siguientes pasos. Se prepararon dos millones de células epiteliales mamarias normales humanas MCF10A en una solución que contenía EDTA/PBS de 1 mm sin tripsina para evitar digerir algunas de las proteínas sensibles, seguido de enjuague con PBS dos veces. Las células se peletizaron y luego se aflojaron golpeando la parte inferior del tubo, seguido de la adición de 1 ml de suero de ratón y girar a 4 °C durante 2 h. A continuación, la mezcla se centrifugó a 9391 × g durante 5 minutos a 4 °C y se recogieron los sobrenadantes, que se repitieron una vez. El primer antisuero limpiado se limpió posteriormente mediante incubación con células MCF7 de tipo silvestre utilizando los mismos procedimientos y se repitió seis veces. El antisuero purificado final se probó con western blot contra lisado de proteínas de células MCF10A, células MCF7, células MCF7 / C6 y células RD-BCSC que se clasificaron por marcadores de células madre de cáncer de mama HER2+ / CD44+ / CD24, así como aldehído deshidrogenasa (ALDH)64. CD47 y HER2, junto con otras PAA en las células radiorresistentes de CB, se identificaron mediante western blots o inmunoprecipitación de proteínas de membrana purificadas a partir de células RD-BCSC y las fracciones eluidas se analizaron a través de LC/MS.Las PAA de membrana resultantes se agruparon con un número de proteínas y categorías funcionales de proteínas.

Edición CRISPR de HER2 y CD47

Los sgRNAs se diseñaron siguiendo las instrucciones publicadas por el software de diseño CRISPR del Dr. Zhang Lab (http://crispr.mit.edu) y el protocolo establecido que se ha descrito en la publicación anterior65. Se diseñaron cuatro Oligos correspondientes a los sgRNAs humanos, se sintetizaron y clonaron en el vector lentiCRISPR v2 siguiendo el protocolo de amplificación de biblioteca agrupada de gecos de laboratorio Zhang. Para minimizar la posibilidad de un objetivo no específico, se sintetizaron y probaron tres oligos sgRNA de cada gen objetivo. El sgRNA con la mejor eficiencia de knockout determinada por western blot fue elegido para experimentos posteriores. Las secuencias sgRNA se utilizaron para células humanas y de ratón de la siguiente manera:

hHer2gRNA_F: CACCGGGCACAGACAGTGCGCGTC

hHer2gRNA_R: AAACGACGCGCACTGT CTGTGCCGC

hCD47gRNA_F: CACCGTAAATATAGATCCGGTGGTA

hCD47gRNA_R: AAACTACCAC CGGATCTATATTTAC

mHer2gRNA_ F: CACCGTGATGGCCCTCGCCCCTCGG

mHer2gRNA_ R: AAACCCGAGGGGCGAGGGCCATCAC

mCD47gRNA_F: CACCGCCCTTGCATCGTCCGTAATG

mCD47gRNA_R: AAACCATTACGGACGATGCAAGGGC

The lentiviral particles were generated using 293T cells following the protocol from Addgene. For gene editing, the isolated BCSC sphere cells or MCF7/C6 cells were trypsinized into single cells and plated 1. 2.5 × 105 cells/0.5 ml per well in the 12-well plates. Después de incubar durante 12 h, se añadió a las células 1 ml de sobrenadante con 8 ng de polibreno, seguido de incubación durante 6 h. A continuación, se añadieron 0,5 ml de medio regular adicional con un 10% de FBS inactivado por calor y se cultivaron durante la noche. El medio de infección se reemplazó por medio fresco de 2 ml con 10% de FBS y se cultivó durante 72 h. Las células se pasaron a platos de cultivo de tejidos de 60 mm y se seleccionaron mediante cultivo en Puromisina de 0,3 µg/ml durante 1 semana y el knockout del gen objetivo se verificó mediante inmunoblotaje.

Ensayo de luciferasa

Las células se transfectaron con reporteros de luciferasa pGL2-basic-CD47 o pGL2-basic-CD47-ΔNF-kB o pGL2-NF-kB, y la actividad de la luciferasa se midió mediante Luminómetro (Promega, Madison, WI). Para la normalización de la eficacia de la transfección del reportero, se midió la concentración total de proteínas de lisados con el kit de ensayo de Proteínas BCA (Pierce, Rockford, IL) con ASC como estándar.

Ensayo de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP)

Las células se reticularon con formaldehído (1% final) durante 10 min, se lavaron con PBS frío y se recogieron en tampón de lisis SDS (1% SDS, EDTA de 10 mM, Tris de 50 mM, pH 8. 1). La cromatina se esquiló mediante sonicación, se aclaró previamente con perlas de agarosa conjugadas con proteína G y se incubó con anti-p65, anti-c-Rel o IgG normal a 4 C durante la noche. Después de agregar proteína G durante 2 h a 4 ° C, el complejo se lavó de manera secuencial con tampones de lavado de complejos inmunes con baja y alta sal (0. 1% SDS, 1% Triton X-100, EDTA de 2 mm, Tris-HCl de 20 mM pH 8.1 más NaCl de 150 mm para tampones bajos en sal y NaCl de 500 mM para tampones altos en sal) seguido de tampón TE (dos veces). La interacción del factor de transcripción de ADN se invirtió tras la adición de NaCl y la incubación a 65 °C durante la noche. Después de la digestión de la RNasa A y la proteinasa K, los fragmentos de ADN se purificaron mediante extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol. Los ADN se purificaron y se utilizaron para PCR con cebadores específicos para la región promotora de genes que abarcaba los sitios de unión de NF-kB. Los cebadores CD47 eran:

5′-CGTGGACCAGGACACCTAGG-3′ (sense)

5′-AGGGAAGAGAACCGCATAGG-3′ (antisense)

The PCR amplification of the IκB promoter region (1134/902) was also included as positive. The primers for NF-κB-binding site in the IκB promoter were:

5′-TGTAGCACCCATTAGAAACACTTC-3′ (sense)

5′-TTCTTGTTCACTGACTTCCCAAT-3′ (antisense).

Preparation of anti-human and anti-mouse CD47 antibodies

Hybridoma for monoclonal mouse anti-human CD47 antibody (B6H12.2), IgG2b were obtained from ATCC. El anticuerpo monoclonal anti-CD47 IgG2a de ratón de rata (MIAP301) y el hibridoma se obtuvieron del Dr. William Frazier (Facultad de Medicina de la Universidad de Washington). Ambas líneas celulares de hibridoma se mantuvieron en medio de DMMI con 20% de FBS. Los anticuerpos se purificaron del sobrenadante de hibridoma utilizando resina de proteína G de GenScript (Catálogo # L00209) siguiendo procedimientos estándar de fabricación. Las muestras se concentraron 10-20 veces más utilizando dispositivos centrífugos Microsep de Pall Life Sciences. Las concentraciones de IgG purificada se determinaron midiendo la absorbancia en OD280.

Ensayo de fagocitosis

Se mantuvieron en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C66 con una densidad aproximada de 1 × 106/ml Tanto células THP1 de monocitos humanos como células Mφ CRUDAS de ratón de 264,7 (ATCC, TIB-71). Alrededor de 0,8 × 106 células/ml de 264,5 células CRUDAS o 1 × 106 células THP1 se sembraron en una placa de 6 pocillos. Después de 24 h de incubación, se activaron 264,7 células CRUDAS mediante tratamiento con 0,1 µg/ml de lipopolisacárido (LPS) durante 24 h. Las células monocitarias THP1 se diferenciaron por Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) (40 nM) durante 48 h. Los macrófagos activados se teñieron con Dio en la concertación final a 40 nM en un medio durante 20 min, seguido de enjuague tres veces con medio. Las células cancerosas se marcaron con DDAO de 1 µM (solución madre de 5 mM en DMSO almacenada a -20 °C) en PBS a 37 °C durante 15 minutos y se lavaron con PBS que contenían 1% de FBS. Las células diana marcadas con DDAO (1 × 106) se añadieron a los Mφ teñidos con DIO y se incubaron en un volumen final de 2 ml a 37 °C durante 2 h. Después de la incubación, los Mφ y las células diana se cosecharon con tres lavados EDTA-PBS seguidos de tripsinización al 0,25%. La fagocitosis se evaluó mediante la evaluación de las células de doble etiqueta (DIO+/DDAO+), que representan las células fagocitadas de cáncer de mama por Mφs maduros, mediante citometría de flujo. Para el análisis se utilizó el software FlowJo.

Ensayo de supervivencia clonogénica

El ensayo de supervivencia clonogénica se realizó después de la radiación con o sin tratamiento (Lapatinib, 10 µM durante 72 h; anticuerpo anti-CD47 10 µg/ml durante la noche). Las células tratadas se cultivaron durante 10-14 días y las colonias se fijaron, teñidas con tinción azul de Coomassie. Las colonias que contenían más de 50 células se contaron como clones sobrevivientes y se normalizaron según la eficiencia de recubrimiento de cada línea celular tumoral tratada con farsa.

Ensayo de tasa de llenado de huecos

La capacidad de llenado de huecos se midió con 1 × 106 células cultivadas en cada una de las placas de 6 pocillos hasta una confluencia del 100%, seguido de una inanición de células de 24 h. Luego, el espacio se creó raspando el plato en diagonal con una punta de pipeta estéril. Las células se dejaron sin tratar o se trataron con 10 µg/ml de IgG o anticuerpos anti-CD47 durante la duración del experimento. Se monitorizó la capacidad de llenado durante 72 h y se tomaron imágenes representativas el día 0 (día de raspado) y el día 3.

Formación de tumores

Las células se tamizaron con tamices celulares de 40 µm (Catálogo # 352340. Corning) y las suspensiones unicelulares se sembraron en placas de Petri de 60 mm de baja fijación a una densidad de 1000 células/ml. Las células se cultivaron en medio basal epitelial mamario libre de suero (MEBM), suplementado con B27 (Catálogo # 17504-044. Tecnología Life), 20 ng/ml EGF (Catálogo # 4022-500. Bio-visión), 20 ng/ml basic-FGF (Catálogo # 13256-029. Invitrogen), y 4 µg/ml de heparina (Catálogo # 80603-686 EMD MILLIPORE). Las células se cultivaron durante 10 días y los tumores se contaron con microscopía de luz.

Ensayo de invasión Transwell

Alícuotas (0. 4 ml) de Matrigel (Catálogo # 356231. BD Biosciences) se diluyeron en tampón de recubrimiento: 0,01 M Tris (pH 8,0), 0,7% NaCl a la concentración final de 200-300 µg/ml. Se cargaron unos 100 µl en la cámara superior de transwell de 24 pocillos (Catálogo # 3422. Costar) e incubado a 37 °C para gelificar aproximadamente 1 h. Retire con cuidado el tampón de recubrimiento restante de la membrana de soporte permeable sin alterar la capa y luego agregue celdas (2,5 × 104/ml). La cámara inferior se llenó con 800 µl de medios MEM que contenían 5 µg/ml de fibronectina (Catálogo # SC-29011. Santa Cruz). El transwell con células tratadas de manera diferente se incubó durante 48 h y se teñió con un kit de tinción Diff-Quick (Catálogo # K7128). IMEB INC).

Preparación de fragmentos de F (ab’)2

CD47 Los fragmentos de F (ab’)2 se produjeron mediante la escisión de resina de papaína de IgG utilizando un kit de preparación de F (ab’)2 (Catálogo # 786272. G-Bioscience) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y el procedimiento informado67. Después de la digestión de papaína, el fragmento de Fab se separó de la IgG no digerida y la región Fc con la Columna de Espín de Proteína A del Kit de Fragmentación de Fab, se suministraron las columnas de desalinización de SpinOUT GT-600 para garantizar que la muestra inicial de anticuerpos fuera la condición óptima para la fragmentación de Fab y se recolectó la IgG CD47 anti-ratón purificada para el tratamiento in vivo de tumores de ratón.

Radiación de células BC con CRISPR-KO CD47 y/o HER2

Para la prueba in vivo de eficacia de inhibición tumoral por radiación con estado deficiente de CD47 y HER2, se implantaron células 5 × 105 4T1/C2 con CRISPR-knockout de CD47 (CD47−/−), HER2 (HER2−/−) o doble (CD47−/−/HER2−/−) en las almohadillas de grasa mamaria de BALB/c (n = 6 por grupo). El crecimiento tumoral se evaluó midiendo el volumen tumoral cada 2 días a partir del día 7 hasta que el volumen tumoral alcanzó la limitación. Para evaluar la radiosensibilidad de los tumores con diferentes estados de CD47 y HER2, se administró radiación tumoral local con 5 Gy a cada tumor en el día 9 y se midió el crecimiento tumoral cada dos días hasta que los tumores de control alcanzaron la limitación máxima.

RT de BC de ratón con tratamiento anti-CD47 y/o HER2

Para pruebas in vivo de inhibición tumoral con un único anticuerpo CD47 en presencia o ausencia de radioterapia, el tratamiento anti-CD47 siguió el protocolo de Willingham et al20 con algunas modificaciones. Ratones hembra inmunocompetentes (BALB/c) de ocho semanas de edad (Laboratorios Charles River, Sacramento, EE.UU.) fueron inyectados con 1 × 105 células 4T1 de mama de ratón en la 4a glándula mamaria. Se inyectaron cincuenta microlitros PBS que contenían 100 µg de IgG de control o fragmentos anti-CD47 F (ab’) en el sitio del tumor (día 1) o en los tejidos del tumor (día 15) y se repitieron cada dos días hasta el final de los experimentos. Los volúmenes tumorales se controlaron cada 5 días. Para el tratamiento con radiación, anti-CD47 o radiación combinada con anti-CD47, los animales con tumores 4T1 se dividieron al azar en varios grupos de tratamiento y un grupo de control (5 a 10 ratones por grupo). La radiación local tumoral comenzó cuando el volumen tumoral alcanza los 200 mm3 con FIR (5 Gy/día/tumor para cuatro fracciones utilizando una fuente de INFRARROJOS de micro haz; dosis total = 20 Gy) combinada con inyecciones tumorales de anti-CD47 F (ab’) tres veces mayores. La radiosensibilidad de los tumores irradiados in vivo con presencia o ausencia de anti-CD47 F (ab’) se evaluó midiendo el volumen tumoral al final de los experimentos. Los animales fueron sacrificados cuando los tumores eran de ~1400 mm3 o cuando los animales parecían sentirse incómodos incluso cuando el tumor era menor de 1400 mm3 para cumplir con las regulaciones de la UCD IACUC para el uso de animales vertebrados en la investigación. El protocolo de uso y cuidado de animales de la radioterapia in vivo fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de California Davis (IACUC 15315).

Para las pruebas in vivo de inhibición tumoral con anticuerpos duales a CD47 y HER2 en presencia o ausencia de radioterapia, se inyectó a ratones hembra inmunocompetentes (BALB/c) de ocho semanas de edad (Laboratorios Charles River, Sacramento, EE.UU.) células 4T1 de mama de ratón de 1 × 105 en la cuarta glándula mamaria. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 200 mm3, los ratones se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos (6 ratones por grupo). Se inyectaron fragmentos de PBS, IgG, anti-CD47 F (ab’) (100 µg) o Herceptin (5 mg/kg) en tejidos tumorales 4 h antes de la radioterapia local (5 Gy por día durante 2 días). Se realizaron inyecciones y se monitorizaron los tamaños de los tumores cada dos días hasta el final de los experimentos. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores eran de ~1400 mm3 o cuando los animales parecían sentirse incómodos, incluso cuando el tumor era menor de 1400 mm3 para cumplir con las regulaciones de la UCD IACUC para el uso de animales vertebrados en la investigación. El protocolo de uso y cuidado de animales de la radioterapia in vivo fue aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de California Davis (IACUC 15315).

macrófagos infiltrados por tumor y fagocitosis de macrófagos

Cáncer de mama de ratón con expresión de GFP Se implantaron células 4T1 en la cuarta almohadilla de grasa mamaria de ratones BALB / c y se inició el tratamiento cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3 mediante inyección tumoral de 50 µl de PBS que contenían 100 µg de IgG de control, fragmentos de anti-CD47 F (ab’), Herceptin o ambos anticuerpos en días alternos durante tres veces. La RT local tumoral se administró los días 10 y 11 con 5 Gy/día/tumor para dos fracciones, dosis total = 10 Gy, y los experimentos finalizaron 2 días después de la terminación de los tratamientos con anticuerpos. Se extrajeron tumores y se prepararon secciones de FFPE para la tinción de inmunofluorescencia para seguir el procedimiento estándar: los portaobjetos se desparafinizaron y rehidrataron, y los antígenos se recuperaron durante 40 min en un tampón de citrato (pH 6,1) a 95 °C. Para eliminar la autofluorescencia, los portaobjetos se colocaron en una solución de desenfluorescencia (0,5 M CuSO4, 0,05 M NH4COOH en H2O) en RT durante 48 h, se enjuagaron con agua 5 min 3 veces y luego se bloquearon con 1:suero de 100 caballos. La incubación de anticuerpos primarios se realizó a 4 °C durante la noche: anti-GFP (1:100; Dako), anti-CD11b (1: 100; Milipora); Después del lavado, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados fluorescentes diluidos de 1:250 (Rodamina para CD11b, Alexa Fluor 488 para GFP) en RT durante 1 h y luego se montaron con solución antifade Vectashield que contenía DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). La fagocitosis mediada por macrófagos se detectó con microscopía fluorescente utilizando el software Axiovision (Zeiss, Alemania) y las microfotografías se cuantificaron mediante ImageJ.

Análisis estadístico

Todos los datos experimentales obtenidos de estudios celulares in vitro y pruebas en animales se presentan como media ± SE, analizados utilizando la prueba t de Student de dos colas para dos grupos o ANOVA para múltiples grupos. La significación estadística de las curvas de supervivencia de Kaplan–Meier se evaluó con la prueba de Mann–Whitney. El número de experimentos independientes y las réplicas se indicaban en las leyendas de las figuras. Los valores de P < 0,05 fueron considerados significativos y se indican con asteriscos de la siguiente manera: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de Informes de Investigación de la Naturaleza vinculado a este artículo.