- Resumen
- 1. Introducción
- 2. Materiales y Métodos
- 2.1. Animales
- 2.2. Cultivos celulares
- 2.3. Ensayo de Tinción de inmunofluorescencia
- 2.4. Western Blot
- 2.5. Reacción en Cadena Cuantitativa (en tiempo Real) de la Polimerasa (PCR en tiempo Real)
- 2.6. Análisis estadístico
- 3. Resultados
- 3.1. La Distribución de Astrocitos Marcados por NDRG2, GFAP y S100ß en Diferentes Regiones Cerebrales
- 3.2. Las Morfologías de los Astrocitos Etiquetados por NDRG2, GFAP y S100ß en Diferentes Regiones Cerebrales
- 3.3. La colocalización de NDRG2, GFAP y S100ß dentro de Astrocitos en Diferentes Regiones Cerebrales
- 3.4. Expresión de las proteínas NDRG2, GFAP y S100ß en Diferentes Regiones Cerebrales
- 4. Discusión
- Disponibilidad de datos
- Divulgación
- Conflictos de intereses
- Las contribuciones de los autores
- Reconocimientos
- Materiales suplementarios
Resumen
Los astrocitos poseen diferentes características morfológicas dependiendo de la región cerebral en la que se encuentran. Sin embargo, ninguno de los marcadores astrocíticos actuales puede etiquetar todas las subpoblaciones con éxito. Por lo tanto, es fundamental identificar el marcador apropiado para una investigación científica específica. Aquí, comparamos la distribución y expresión de proteínas de tres marcadores de astrocitos: NDRG2, GFAP y S100ß, en la corteza, el hipocampo y el tálamo. Los astrocitos positivos para NDRG2 y S100ß se distribuyeron de manera más uniforme que los astrocitos positivos para GFAP en todo el cerebro. Las inmunorreactividades NDRG2 y S100ß fueron las más fuertes en la corteza dorsal y el tálamo, mientras que la inmunorreactividad GFAP fue la más fuerte en el hipocampo. Además, los niveles de expresión de proteínas de NDRG2, GFAP y S100ß en ratones adultos fueron los más altos en la corteza, el hipocampo y el tálamo, respectivamente. También detectamos morfología de astrocitos y encontramos que, en el cuerpo calloso y el pedúnculo cerebral, se encontraron astrocitos positivos a GFAP con procesos más numerosos y más largos que los astrocitos positivos a NDRG2 y S100ß. Estos resultados demuestran que NDRG2 y S100ß se utilizan más adecuadamente para visualizar la distribución general y los cambios en el número de astrocitos, así como para etiquetar astrocitos en la corteza y el tálamo. Sin embargo, la GFAP se usa más apropiadamente para etiquetar astrocitos en el cuerpo calloso, el pedúnculo cerebral y el hipocampo. Estos resultados ayudan a guiar a los investigadores en la elección del marcador de astrocitos adecuado y sugieren diferencias en las cualidades inmunológicas de los astrocitos en función del tejido en el que se encuentran.
1. Introducción
Los astrocitos se han considerado durante mucho tiempo células auxiliares que solo proporcionan soporte trófico, metabólico y estructural a las neuronas . Sin embargo, en los últimos años, una amplia investigación ha demostrado que desempeñan un papel crucial en las funciones fisiológicas y patológicas cerebrales. Los astrocitos ayudan en el mantenimiento de la homeostasis iónica y las barreras hematoencefálicas, la formación y eliminación de sinapsis, así como en el control del flujo sanguíneo cerebral y la regulación del reciclaje de neurotransmisores, la excitotoxicidad del glutamato y el estrés antioxidante . Es importante destacar que los astrocitos poseen diversidad morfológica, poblacional y funcional en diferentes regiones cerebrales . Por lo tanto, identificar el marcador más apropiado para los subgrupos polimorfos y múltiples de astrocitos es fundamental para la investigación de la multifunción astrocítica.
La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) es el marcador astrocítico más utilizado, pero como el principal filamento intermedio que compone el citoesqueleto, la GFAP inmunomarcó solo alrededor del 15% del volumen total de astrocitos , y se encontró que más del 40% de los astrocitos eran GFAP negativos en el hipocampo de rata adulta . Además, los astrocitos humanos protoplásmicos marcados con GFAP se expresaron de forma deficiente y tardía en el desarrollo de astrocitos fibrosos .
Otro marcador astrocítico de uso común es S100ß, un péptido de unión a Ca2 + abundante en el citoplasma y núcleo de astrocitos que participa en la regulación del ciclo celular y la modificación del citoesqueleto . Sin embargo, S100ß también se expresa en una subpoblación de oligodendrocitos maduros, en las células epiteliales del plexo coroideo y en algunas neuronas . Las deficiencias de GFAP y S100ß en el etiquetado de astrocitos pueden conducir a inexactitudes o incluso errores en la exploración de las funciones de los astrocitos.
El gen N-Myc 2 (NDRG2) regulado aguas abajo se descubrió por primera vez en una biblioteca de ADNc cerebral humano normal mediante un método de hibridación sustractiva basado en PCR . Es un gen supresor de tumores y relacionado con el estrés celular asociado con la proliferación y diferenciación celular . La NDRG2 se expresa ampliamente en la corteza cerebral, el bulbo olfativo, el cerebro medio, el hipocampo y el tálamo . Lo más importante, NDRG2 se expresa específicamente en los astrocitos del cerebro . Por lo tanto, NDRG2 es considerado como un nuevo marcador astrocítico, especialmente para astrocitos maduros, no reactivos y no proliferantes . Sin embargo, no se ha reportado si NDRG2 es más confiable que GFAP y S100ß como marcador astrocítico, así como las diferencias de su distribución y expresión en diferentes regiones cerebrales.
En el presente estudio, comparamos la distribución, la expresión de proteínas y la colocalización mutua de los marcadores astrocíticos NDRG2, GFAP y S100ß en todo el cerebro de ratones. Nuestro objetivo fue identificar el marcador más adecuado para astrocitos en diferentes regiones cerebrales.
2. Materiales y Métodos
2.1. Animales
Se obtuvieron ratones machos jóvenes, adultos y viejos C57BL / 6 de 1 mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses del Centro de Animales Experimentales de la Universidad Central Sur. Los animales eran libres de comer y beber, mantenidos a una temperatura de 25 ± 1°C, y alojados con un círculo claro-oscuro de 12:12 h para simular el ritmo circadiano del animal. Se hicieron todos los esfuerzos posibles para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados. Todos los procedimientos experimentales con animales siguieron un protocolo aprobado por el Comité Ético para la Experimentación con Animales del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Central del Sur, China.
2.2. Cultivos celulares
Las células HT22 (una línea celular neuronal) y las células MA1800-57 (una línea celular de astrocitos) se cultivaron en Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM, HyClone) que contenía un 10% de suero fetal bovino (FBS, Gibco), 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Las células OLN-93 (una línea celular oligodendroglial) se mantuvieron en DMEM suplementadas con 10% de FBS, 2 mm de Glutamina, 50 U/ml de penicilina y 50 µg/ml de estreptomicina. Todas las células se mantuvieron a 37°C en una mezcla de 95% de aire atmosférico y 5% de CO2. Las células HT22, las células OLN-93 y las células MA1800-57 se sembraron en portaobjetos y se teñieron con anticuerpos contra la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2), α-tubulina y GFAP, respectivamente.
2.3. Ensayo de Tinción de inmunofluorescencia
Después de anestesiar a los ratones con pentobarbital sódico (50 mg/kg), se extrajeron sus cerebros y se fijaron con solución salina heparinizada fría al 0,9% y paraformaldehído al 4%. Después de la postfijación, los cerebros se deshidrataron sucesivamente en soluciones de sacarosa al 20% y sacarosa al 30%. Se prepararon secciones de 10 µm de espesor con una cortadora congelada Leica CM1900. Las secciones cerebrales se incubaron en H2O2 al 1% durante 15 min y Tritón X-100 al 0,3% durante 15 min, con 3 × lavados en PBS postincubación entre cada tratamiento. Las secciones se bloquearon en suero normal de cabra al 5% durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche a 4°C en una caja humidificadora con anticuerpos primarios de la siguiente manera: anticuerpo anti-GFAP de ratón (#3670, 1:500, Tecnología de Señalización celular); anticuerpo anti-NDRG2 de conejo (#5667, 1:200, Tecnología de Señalización Celular); anticuerpo anti-NDRG2 de ratón (#DA281-6A5, 1:100, Sigma); anticuerpo anti-S100ß de conejo (#2017-1, 1:500, Epítómica); anticuerpo anti-Glutamina Sintetasa (GS) de ratón (#MAB302, 1:200, Milipora); anticuerpo anti-MAP2 de conejo (#ab32454, 1:500, Abcam); y anticuerpo anti-α-tubulina de ratón (#T6199, 1:500, Sigma). Luego, las secciones se incubaron con mezclas de anticuerpos secundarios conjugados de Alexa-488 (verde, Invitrogen) y Alexa-647 (rojo, Invitrogen) anti-conejo de burro o anti-ratón de burro durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente. Se utilizó 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) (ZLI-9557, Zsbio) para teñir núcleos. Las secciones se montaron con glicerol al 50%. Finalmente, se observaron y fotografiaron las secciones utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX51 (Japón). Los anticuerpos utilizados en nuestro estudio fueron ampliamente utilizados en nuestros estudios anteriores y por otros investigadores , y se ha confirmado la sensibilidad y especificidad de estos anticuerpos.
2.4. Western Blot
La corteza, el hipocampo y el tálamo se recolectaron de ratones C57BL/6 de 1 mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses. Las muestras se homogeneizaron en tampón RIPA, y la concentración de las muestras de proteínas se midió mediante el kit de ensayo de proteínas BCA (Pierce Biotechnology, EE. UU.). Las muestras de proteínas se separaron con un 10% de SDS-PAGE (kit de gel SDS-PAGE, CW0022S, China) y se transfirieron eléctricamente a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Los componentes del kit de Gel SDS-PAGE incluían un 30% de Acr-Bis, un Tampón de Gel Separador de PÁGINAS SDS, un Tampón de Gel Apilador de páginas SDS, APS (persulfato de amonio) y TEMED (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamina). Posteriormente, las membranas se bloquearon en leche seca descremada al 5% diluida en TBST (TBS con 0,05% de Tween 20) durante 1 h a temperatura ambiente y luego se incubaron con anticuerpos primarios específicos: anticuerpo anti-GFAP de ratón (#3670, 1:1000, Tecnología de Señalización Celular); anticuerpo anti-NDRG2 de conejo (#5667, 1:1000, Tecnología de Señalización Celular); anticuerpo anti-S100ß de conejo (#2017-1, 1:1000, Epítómica); y anticuerpo anti-GAPDH de conejo (#5174, 1:1000, Tecnología de Señalización Celular) durante la noche a 4°C. Las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo o UU.) para 2 h. Se desarrollaron señales quimioluminiscentes utilizando Reactivo de quimioluminiscencia Western Lightning Plus (PerkinElmer Life Sciences; Wellesley, MA) y detectado por un analizador de imágenes del sistema LI-COR Odyssey (LI-COR Biotechnology, EE.UU.). La inmunorreactividad de las bandas de proteínas se analizó cuantitativamente mediante el software Bio-Rad ® Image Lab™. Los valores de densidad de banda se normalizaron a GAPDH.
2.5. Reacción en Cadena Cuantitativa (en tiempo Real) de la Polimerasa (PCR en tiempo Real)
La corteza, el hipocampo y el tálamo se recogieron de ratones C57BL/6 de 1 mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses. El ARN total se aisló utilizando un kit TransZol Up Más ARN (Código No. ER501-01, Transgen, China) y cuantificado utilizando un NanoDrop 2000. Luego, 1000 ng de ARN total se transcribieron de forma inversa en una reacción de 20 µL a 42°C durante 15 min, seguida de 85°C durante 5 segundos utilizando una Supermezcla de Síntesis de ADNc Todo en Uno TransScript® para qPCR (Código No. AT341, Transgen, China). Los componentes del kit incluían una Supermezcla Todo en Uno de 5 × TransScript® para qPCR (TransScript ® RT, Inhibidor de RNasa, Imprimación Oligo Anclada(dT)18, Imprimación Aleatoria(N9), dNTPs, tampón), una Supermezcla Todo en Uno de 5×TransScript® sin Control RT para qPCR, un Eliminador de gDNA y un agua libre de RNasa. La supermezcla de Control sin RT Todo en uno TRANSCRIPT® de 5×para qPCR se utilizó como control negativo. La PCR en tiempo real se realizó en una reacción de 20 µL de acuerdo con el manual del fabricante para la punta TransStart Verde qRNA SuperMix (Código No. AQ141, Transgen, China). Las secuencias de imprimación de ARNm utilizadas se pueden encontrar en la Tabla 1. La reacción se realizó a 94 ° C durante 30 segundos, seguida de 40 ciclos de 94°C durante 5 segundos, 60°C durante 15 segundos y 72°C durante 19 segundos en el Sistema de Detección de PCR en Tiempo Real ViiA7 (Termociclador 2720, Biosystems Aplicados). Los cebadores y las secuencias derivadas de la expresión relativa del ARNm se analizaron utilizando la fórmula .
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2.6. Análisis estadístico
Las pruebas estadísticas se realizaron con el software PRISM v7.0 (GraphPad). Las comparaciones entre dos grupos se realizaron utilizando las pruebas t de Student. Las comparaciones entre varios grupos se realizaron utilizando ANOVA unidireccional con el posttest de Tukey. Todos los valores fueron presentados como media ± DE. Los valores de p<0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
3. Resultados
3.1. La Distribución de Astrocitos Marcados por NDRG2, GFAP y S100ß en Diferentes Regiones Cerebrales
Las regiones de la cerebra de ratones se identificaron mediante el etiquetado de los núcleos celulares. Además, se utilizó un atlas cerebral de ratón correspondiente para verificar las regiones específicas analizadas (Figura 1). A continuación, utilizamos tinciones de inmunofluorescencia para detectar la distribución de astrocitos marcados por NDRG2, GFAP y S100ß en diferentes regiones cerebrales de ratones machos adultos de 6 meses de edad. Los astrocitos positivos para NDRG2 y S100ß fueron más abundantes y distribuidos de manera más uniforme que los astrocitos positivos para GFAP en todo el cerebro (Figura 2). Los astrocitos NDRG2 positivos se concentraron en la corteza dorsal (Región 1) y el tálamo (Región 5), pero menos en el hipocampo (Región 4), el cuerpo calloso (Región 3) y la corteza ventral (Región 2) y menos en el pedúnculo cerebral (Región 6) (Figuras 2(a) y 2(b)). Los astrocitos positivos a GFAP se concentraron principalmente en el hipocampo; se detectaron menos en el cuerpo calloso y el pedúnculo cerebral y casi indetectables en la corteza dorsal, la corteza ventral y el tálamo (Figuras 2(a) y 2(c)). Los astrocitos S100ß positivos se concentraron principalmente en la corteza dorsal y el tálamo, menos en el hipocampo y la corteza ventral, y menos en el pedúnculo cerebral y el cuerpo calloso (Figuras 2(b) y 2(c)). La distribución de los astrocitos positivos a NDRG2 fue similar a la de los astrocitos positivos a S100ß.
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Los astrocitos en diferentes regiones cerebrales presentaron inmunorreactividades desiguales a NDRG2, GFAP y S100ß (Figura 2). Los astrocitos de la corteza dorsal y el tálamo reaccionaron fuertemente a NDRG2 y S100ß, pero débilmente a GFAP. Los astrocitos en el hipocampo reaccionaron fuertemente a GFAP y moderadamente a NDRG2 y S100ß. Los astrocitos de la corteza ventral, el cuerpo calloso y el pedúnculo cerebral reaccionaron de manera débil a moderada a NDRG2, GFAP y S100ß (Tabla 2).
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+++: muy positiva; ++: moderadamente positivo; +: positivo débil.
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La distribución de astrocitos marcados por NDRG2, GFAP y S100ß en diferentes regiones cerebrales de ratones machos fue similar a la de ratones machos viejos (12 meses) (Figura 3).
3.2. Las Morfologías de los Astrocitos Etiquetados por NDRG2, GFAP y S100ß en Diferentes Regiones Cerebrales
Los astrocitos se dividen principalmente en dos tipos: astrocitos fibrosos en materia blanca y astrocitos protoplásmicos en materia gris. Por lo tanto, comparamos las morfologías de los dos tipos etiquetados por diferentes marcadores en el cuerpo calloso (materia blanca, Región 3) y el hipocampo (materia gris, Región 4) (Figura 4). Los resultados de ratones machos adultos (6 meses) mostraron que los astrocitos NDRG2 y S100ß positivos presentaban una forma estrellada caracterizada por soma grande y redondo junto con procesos citoplásmicos cortos y gruesos que tenían pocas ramas. Los astrocitos GFAP positivos se presentaron con una forma radial caracterizada por soma pequeño, procesos largos y múltiples ramas (Figura 4). Además, en el cuerpo calloso y el pedúnculo cerebral, los astrocitos etiquetados por GFAP presentaron procesos más largos y abundantes que los etiquetados por NDRG2 y S100ß (Figuras 5 y 7).
3.3. La colocalización de NDRG2, GFAP y S100ß dentro de Astrocitos en Diferentes Regiones Cerebrales
NDRG2 casi se colocalizó con GFAP en astrocitos de la corteza ventral, el cuerpo calloso y el pedúnculo cerebral, y en su mayoría se colocalizó con GFAP en astrocitos del hipocampo(Figuras 5 y 8 (a)). NDRG2 casi no tuvo colocalización con GFAP en astrocitos de la corteza dorsal y el tálamo (Figura 5). NDRG2 y S100ß presentaron colocalización casi completa en astrocitos de las seis regiones cerebrales(Figuras 6 y 8 (b)). GFAP y S100ß presentaron colocalización significativa en astrocitos de la corteza ventral, cuerpo calloso y pedúnculo cerebral y colocalización casi completa en astrocitos del hipocampo (Figura 7). La GFAP y el S100ß no tuvieron casi colocalización en los astrocitos de la corteza dorsal y el tálamo (Figura 7).
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También detectamos colocalización de NDRG2 y otro fabricante de astrocíticos, la glutamina sintetasa (GS), en astrocitos del cerebro de ratones. NDRG2 y GS tuvieron colocalización significativa en astrocitos (Figura s1a). NDRG2 y GS presentaron colocalización completa en astrocitos fibrosos del cuerpo calloso y en astrocitos protoplásmicos del hipocampo (Figura s1b). También se detectó la expresión de proteínas NDRG2 en la línea celular neuronal HT22, la línea celular oligodendroglial OLN-93 y la línea celular astrocítica MA1800-57 (Figura s2). La proteína NDRG2 se detectó en células MA1800-57 y apenas se detectó en células HT22 y células OLN-93 (Figuras s2a y s2b).
3.4. Expresión de las proteínas NDRG2, GFAP y S100ß en Diferentes Regiones Cerebrales
Utilizamos western blotting para detectar los niveles de expresión de las proteínas NDRG2, GFAP y S100ß en tres regiones cerebrales de ratones machos adultos (6 meses): la corteza, el hipocampo y el tálamo (Figura 8(c)). Se analizaron los niveles de expresión de estos marcadores en la misma región cerebral (Figura 8 (d)). En la corteza, el nivel de expresión NDRG2 fue marcadamente más alto que los niveles de expresión GFAP y S100ß (p<0,001, p<0,05). El nivel de expresión de S100ß también fue mucho más alto que GFAP (p<0.05). En el hipocampo, el nivel de expresión de GFAP fue mayor que NDRG2 y S100ß (p<0.01), y el nivel de expresión NDRG2 fue un poco menor que el nivel de expresión S100ß, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa. En el tálamo, el nivel de expresión de S100ß fue significativamente mayor que los niveles de expresión de GFAP y NDRG2 (p<0,01), mientras que el nivel de expresión de NDRG2 fue similar al de GFAP.
A continuación, analizamos los niveles de expresión del mismo marcador en diferentes regiones cerebrales (Figura 8(e)). El nivel de expresión de NDRG2 en la corteza fue mucho más alto que en el hipocampo y el tálamo (p<0,01), y no se observó diferencia significativa entre el hipocampo y el tálamo. El nivel de expresión de GFAP en el hipocampo fue el más alto entre las tres regiones (p<0,001, p<0,01); no se observaron diferencias significativas entre la corteza y el tálamo. El nivel de expresión de S100ß en el tálamo fue significativamente mayor que en la corteza y el hipocampo (p<0.01), sin que se observen diferencias significativas entre los dos últimos.
También detectamos los niveles de proteínas de NDRG2, GFAP y S100ß en la corteza, el hipocampo y el tálamo de ratones machos de 1 mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses (Figuras 9(a)-9(f)). Los niveles de proteínas de NDRG2 y GFAP en la corteza, el hipocampo y el tálamo aumentaron gradualmente con la edad (p<0,05, p<0,01). Los niveles de proteína de S100ß en la corteza y el tálamo, pero no en el hipocampo, aumentaron gradualmente con la edad(p< 0.05, p<0.01, p<0.001). Los niveles de ARNm de NDRG2, GFAP y S100ß en la corteza, el hipocampo y el tálamo de ratones machos de 1 mes, 3 meses, 6 meses, 9 meses y 12 meses fueron consistentes con los de los niveles de proteínas (p<0,05, p<0,01, Figuras 9(g)-9(i)).
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4. Discusión
En este estudio, encontramos que los astrocitos etiquetados por NDRG2 y S100ß se distribuyeron de manera más amplia y uniforme que los etiquetados por GFAP en todo el cerebro de ratones jóvenes, maduros y viejos. Esto sugiere que NDGR2 y S100ß son marcadores más apropiados para observar la distribución general y los cambios en el número de astrocitos. Además, nuestros resultados mostraron que los astrocitos en diferentes regiones cerebrales presentaban diferentes niveles de inmunorreactividad a NDRG2, GFAP y S100ß, lo que sugiere que, en la corteza y el tálamo, NDRG2 y S100ß son marcadores astrocíticos más apropiados que GFAP. La inigualable inmunorreactividad de los astrocitos a NDRG2, GFAP y S100ß también podría deberse a la sensibilidad y especificidad de los anticuerpos que utilizamos. Además, las morfologías de los astrocitos etiquetados por NDRG2 y S100ß eran similares entre sí, pero obviamente eran distintas de las etiquetadas por GFAP porque estos marcadores etiquetaban diferentes estructuras citoesqueléticas. NDRG2 tiñe el citoplasma y las membranas celulares y tiñe débilmente el núcleo . El GFAP tiñe principalmente el soma y los procesos, pero no el núcleo, mientras que el S100ß tiñe el núcleo y parte del citoplasma y los procesos . Al comparar las morfologías de astrocitos etiquetados por NDRG2, GFAP y S100ß, encontramos que GFAP era un marcador más adecuado para astrocitos en el cuerpo calloso, el pedúnculo cerebral y, especialmente, el hipocampo. Las proteínas NDRG2 y S100ß se expresaron más en la corteza y el tálamo, respectivamente. Inferimos que NDRG2 es más adecuado para astrocitos en la corteza, mientras que S100ß es más adecuado para astrocitos en el tálamo al cuantificar la densidad astrocítica. Los diferentes patrones de expresión de proteínas de NDRG2, GFAP y S100ß en la corteza, el hipocampo y el tálamo confirmaron la heterogeneidad funcional astrocítica.
Se ha encontrado que los astrocitos juegan un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis, y participan activamente en casi todos los trastornos neurológicos, como accidentes cerebrovasculares isquémicos, lesiones cerebrales traumáticas, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson . Se ha demostrado que la morfología astrocítica, la expresión génica y la función difieren entre las diferentes regiones del cerebro . Los astrocitos fibrosos y los astrocitos protoplásmicos son dos subpoblaciones principales identificadas por su morfología . Los astrocitos fibrosos tienen procesos largos y delgados, y una apariencia similar a una estrella, mientras que los protoplásmicos tienen numerosos procesos finos, que contactan y sinapsis de vainas . Curiosamente, muchos genes se expresan de forma heterogénea por subconjuntos de astrocitos. Estos genes codifican proteínas como transportadores de glutamato y canales iónicos , así como receptores de glutamato , dopamina y opioides .
La heterogeneidad de la expresión génica implicaba la diversidad funcional de los astrocitos. Por ejemplo, la absorción de glutamato difiere entre diferentes subconjuntos . Además, las oscilaciones espontáneas de calcio difieren entre las diferentes capas de la corteza somatosensorial. Los astrocitos de la capa cortical 1 mostraron actividad asíncrona frecuente de Ca2+, mientras que los astrocitos de la capa 2/3 mostraron actividad síncrona de Ca2 + poco frecuente . En la corteza, los astrocitos responden al glutamato y la norepinefrina con aumentos en el calcio, mientras que los astrocitos del hipocampo presentan respuestas de calcio al ATP, GABA, glutamato, acetilcolina, prostaglandinas y endocannabinoides . Los estudios también han demostrado que los astrocitos cultivados de diferentes regiones cerebrales tienen diferentes capacidades para estimular el crecimiento y la ramificación de las neuritas . Como los astrocitos en diferentes regiones cerebrales presentan diferentes características de morfología y función, identificar el marcador más apropiado para los astrocitos en diferentes regiones cerebrales es crucial para los investigadores astrocíticos.
Aunque se ha informado que varias proteínas se expresan selectivamente por astrocitos, no se ha demostrado que estén completamente restringidas a todos los subtipos astrocitos. El GFAP, el marcador astrocítico más utilizado, se expresa preferentemente en astrocitos de materia blanca sobre los de materia gris y no etiqueta todos los procesos de los astrocitos . Más importante aún, hay subconjuntos de astrocitos GFAP negativos que presentan corrientes K + dependientes del voltaje, mientras que los astrocitos GFAP positivos presentan el patrón clásico de corrientes independientes del tiempo y del voltaje .
Estudios previos encontraron que S100ß era capaz de etiquetar astrocitos en materia gris y blanca; sin embargo, también se expresó en unos pocos oligodendrocitos y neuronas . Se encontró que S100ß se expresa más en los astrocitos de tálamo, un subtipo de células que participan en la limpieza de residuos daérgicos producidos por la degeneración de terminales daérgicos en la enfermedad de Parkinson al facilitar la presencia de lisosomas y la formación de autofagosomas . El análisis transcriptómico de astrocitos identificó la familia aldehído deshidrogenasa 1, miembro L1 (ALDH1L1), como un marcador astrocítico . Sin embargo, ALDH1L1 también marcó oligodendrocitos . De manera similar, los transportadores excitadores de aminoácidos transportador de glutamato/aspartato (GLAST), glutamina sintetasa (GS), transportador de glutamato-1(GLT-1), vimentina, conexina 43, acuaporina 4 y la glicoproteína de superficie celular CD44 también tuvieron limitaciones al etiquetar astrocitos .
NDRG2 se expresa específicamente en astrocitos de ratas y ratones y se asocia con el crecimiento y la maduración del cerebro embrionario en desarrollo . Además de la proliferación celular, la diferenciación y el transporte transmembrana, NDRG2 también participa en las respuestas al estrés, la depresión, las enfermedades isquémicas y los trastornos neurodegenerativos . En ratones y humanos, NDRG2 participa en el desarrollo del trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH), una enfermedad asociada con el centro de locomoción en la corteza cerebral . Flugge et al. detectó la expresión de NDRG2 en los cerebros de humanos, titíes, musarañas arbóreas, ratas y ratones, y sugirió que NDRG2 era un nuevo marcador astrocítico, especialmente para astrocitos maduros, no reactivos y no proliferantes . En este estudio, primero detectamos el patrón de distribución de astrocitos NDRG2 positivos en diferentes regiones cerebrales y diferencias con los astrocitos marcados por los marcadores clásicos GFAP y S100ß.
Los astrocitos y los marcadores astrocíticos cambiaron durante el envejecimiento cerebral normal. Trabajos previos han demostrado que los astrocitos se activan temprano en el envejecimiento, y el aumento significativo de astrocitos positivos a GFAP se encontró en las regiones del hipocampo de ratones ancianos . Los niveles de proteína GFAP y ARNm GFAP aumentaron en varias partes del cerebro envejecido, como la corteza cerebral, el hipocampo y el cerebelo . Siguen existiendo discrepancias entre varios informes de S100ß en el cerebro envejecido . Cada vez más, los estudios han demostrado que NDRG2 está asociado con trastornos relacionados con la edad, como la enfermedad de Alzheimer. En nuestro estudio, los niveles de ARNm GFAP y NDRG2 en la corteza, el hipocampo y el tálamo aumentaron gradualmente con la edad, mientras que los niveles de ARNm S100ß en el hipocampo y el tálamo aumentaron con la edad, pero no en la corteza.
Debemos tener en cuenta que, actualmente, muchos marcadores, además de los que probamos, como ALDH1L1, GLAST, GLT-1, CD44 y vimentina, se utilizan para etiquetar astrocitos. En nuestro estudio, solo comparamos los astrocitos cerebrales clásicos etiquetados por el nuevo marcador propuesto NDRG2 y los marcadores más utilizados: GFAP, S100ß y GS en el cerebro.
En conclusión, nuestro estudio indica que NDRG2 y S100ß son marcadores más apropiados para astrocitos en la corteza y el tálamo, respectivamente, así como para observar la distribución general y los cambios en el número de astrocitos en todo el cerebro. Mientras tanto, GFAP es superior a NDRG2 y S100ß al etiquetar los procesos y ramas de los astrocitos en el cuerpo calloso, el pedúnculo cerebral y, especialmente, el hipocampo. Nuestro estudio muestra la importancia de elegir el marcador más apropiado para los astrocitos en diferentes regiones cerebrales de ratones, lo que proporciona una guía para los investigadores de neurociencia al explorar las funciones astrocíticas.
Disponibilidad de datos
Los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio se incluyen en el artículo.
Divulgación
Zengli Zhang y Zhi Ma son los coautores.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Las contribuciones de los autores
Zengli Zhang y Zhi Ma contribuyeron igualmente a este estudio.
Reconocimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (no. 7194321 para Lixia Zhang), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (no. 81801138 para Yulong Ma, no. 81771206 para Wangyuan Zou), la Beca de Investigación para Jóvenes Académicos de la Asociación China de Anestesiólogos (no. 21700001 para Yulong Ma), la Fundación Miaopu de Hospital General PLA (no. 18KMM47 a Lixia Zhang), y la Comisión de Tecnología de Beijing Municipal Science & (no. 1811000017180022 para colgar Guo).
Materiales suplementarios
Figura suplementaria 1. La colocalización de NDRG2 y GS dentro de los astrocitos. Gráfico complementario 2 Expresión de la proteína NDRG2 en líneas celulares. (Materiales complementarios)