RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Diabrotica es un género de escarabajos crisomélidos del Nuevo Mundo que es principalmente Neotropical en su distribución y cuyo origen es probablemente la región de América Central o Tropical del Sur (28). Hoy en día su área de distribución abarca la mayor parte de los Estados Unidos al este de las Montañas Rocosas y al norte del paralelo 35, los estados de México al noroeste de Durango (excluyendo Baja California), las áreas del sur de Ontario, Canadá, y una reciente introducción en Europa oriental (29). La distribución de D. v. zeae abarca un área desde Guatemala a través del centro de México hasta el panhandle de Texas y partes del sur de Oklahoma (28). La expansión de la producción de maíz también puede haber facilitado el movimiento de D. v. zeae hacia el norte desde México, resultando en una región de contacto secundario con D. v. virgifera en el norte de Texas, donde la subespecie se hibrida (13).
Los adultos de D. v. zeae muestreados en Stephenville y Uvalde en el sur de Texas no se infectaron con Wolbachia, mientras que los adultos de D. v. virgifera de 15 sitios dentro de la distribución de D. v. virgifera en los Estados Unidos y Canadá dieron positivo para Wolbachia, con la excepción de dos sitios en Duncan y Willcox, Arizona. Veintiún adultos de tres sitios dentro de la zona híbrida del norte de Texas también dieron positivo, incluyendo cinco especímenes con patrones de índice dentro del rango de variación de D. v. zeae (J. Comunicación personal de Krysan). Las secuencias del gen FtsZ de Wolbachia de individuos individuales de Urbana, IL, Moriarty, NM y Blacksburg, VA, fueron idénticas. Además, la digestión con DraI del fragmento FtsZ obtenido con (i) cebadores generales específicos de B, (ii) ftsZf1 y (iii) ftsZr1 indicó que las poblaciones de D. v. virgifera de todos los lugares muestreados portan la misma cepa de Wolbachia. Un análisis filogenético usando el gen 16S rRNA colocó esta cepa en una posición basal con una relación sin resolver con otras cepas de Wolbachia (los resultados no se muestran). El gen FtsZ (23, 30) también identificó la Wolbachia de D. v. virgifera como una cepa basal y distinta de la mayoría de las otras cepas del grupo A (Fig. 1). Dada la consistencia de la infección y el tipo de cepa a lo largo de la distribución de D. v. virgifera, así como la rápida propagación de esta especie en América del Norte, sugerimos que la infección se produjo en el suroeste de los Estados Unidos o el noroeste de México antes de la expansión hacia el este de D. v. virgifera en los Estados Unidos y Canadá. El D. V. no infectado. las poblaciones de virgifera en el sur de Arizona pueden ser los restos de la población original no infectada o podrían representar poblaciones aisladas que han perdido la infección.
Uno de los 36 árboles igualmente parsimoniosos estimados utilizando una secuencia parcial de ADN del gen FtsZ. Los asteriscos indican ramas sostenidas por todos los árboles más parsimoniosos. El árbol tenía raíces de punto medio, una longitud de 370 pasos, un índice de consistencia (excluyendo caracteres no informativos) de 0.64 y un índice de retención de 0.95. Las designaciones A y B se refieren a grupos identificados por Werren et al. (23). † , secuencia de Wolbachia publicada en Werren et al. (23).
D. v. virgifera y D. v. zeae son morfológicamente muy similares (13), con la excepción de la maculación elitral negra que es distintiva en D. v. virgifera y confinada al húmero o está ausente en D. v. zeae. Las subespecies no están aisladas ecológicamente porque ambas se encuentran en el maíz; tampoco están aisladas temporalmente porque tienen el mismo mecanismo de diapausa. Los estudios de comportamiento no indican barreras prematrimoniales para la reproducción porque ambas subespecies responden a la feromona del mismo sexo y no se hizo discriminación durante los experimentos de elección de apareamiento (13). Cuando se cruzaron, las dos subespecies eran fértiles en una dirección, es decir, los machos D. v. zeae del centro de México se aparearon con hembras D. v. virgifera de Dakota del Sur, mientras que el cruzamiento recíproco produjo muy pocas o ninguna descendencia viable (14). Para probar si la incompatibilidad unidireccional es causada por la infección de Wolbachia identificada en D. v. virgifera, hicimos cruces recíprocos de D. V. virgifera infectada y tratada con tetraciclina. Los resultados indican que la cepa de Wolbachia que infecta a D. v. virgifera es capaz de inducir incompatibilidad citoplasmática grave, con solo el 0,4% de los 5.627 huevos que eclosionaron cuando los machos infectados de D. v. virgifera se cruzaron con hembras no infectadas de D. v. virgifera tratadas con tetraciclina (Tabla 1, cruce d).
- Ver en línea
- Ver ventana emergente
Comparaciones del porcentaje medio de eclosión de huevos ± SE para cruces utilizando D. v. virgifera infectada y tratada con tetraciclina y D. v. zeae naturalmente no infectada utilizando la prueba U de Mann-Whitney
También establecimos una colonia de laboratorio de D. v. zeae con especímenes de Stephenville, TX, y confirmó que las hembras de D. v. zeae cruzadas con machos de D. v. virgifera producen muy pocas o ninguna descendencia, mientras que el cruzamiento recíproco da como resultado una eclosión normal de huevos (Tabla 1, cruces f y h) (14). Cuando repetimos los cruces con machos D. v. virgifera tratados con tetraciclina, la incompatibilidad ya no existía y se observaron tasas de eclosión de huevos que no eran significativamente diferentes de los controles (Tabla 1, cruz g), lo que confirma que la incompatibilidad de apareamiento unidireccional entre estas dos subespecies es causada por la presencia de Wolbachia en D. v. virgifera.
También se han reportado incompatibilidades reproductivas similares entre algunos miembros del género Gryllus en América del Norte. El género Gryllus se distribuye en la mayor parte del mundo con la excepción de Asia oriental y el Pacífico (31). Basado en el número de especies, es posible que el género se originó en el Nuevo Mundo o África, donde se han registrado varios géneros similares a Gryllus (32). En América del Norte, el género Gryllus tiene varias especies estrechamente relacionadas, algunas de las cuales son difíciles de distinguir solo en función de los caracteres morfológicos. A principios de siglo, este grupo era considerado como una sola especie con un alto grado de variabilidad (33). Trabajos posteriores, principalmente utilizando cantos de llamada discriminados entre algunas de las especies (34).
Se ha demostrado que varias especies del género Gryllus son incompatibles unidireccional o bidireccional. La incompatibilidad unidireccional entre los machos de G. pennsylvanicus y las hembras de G. firmus en el este de los Estados Unidos (19) refleja la de D. v. virgifera y D. v. zeae. Hemos encontrado que, con la excepción de G. firmus, los especímenes de todas las especies de Gryllus que hemos estudiado generalmente están infectados con Wolbachia, a veces con más de una cepa (Figs. 2 y 3). Las incompatibilidades reportadas entre las diversas especies de este género pueden explicarse por la infección con esta bacteria. Nuestro estudio ha mostrado los siguientes patrones de infección. Las poblaciones de G. integer muestreadas del Condado de Humboldt, NV, y del Condado de Wayne, TU, están infectadas con la misma cepa de la bacteria Wolbachia, a la que nos referimos como el «tipo entero». La población muestreada en Davis, CA, también estaba infectada con el tipo entero, con la excepción de un individuo que albergaba la misma cepa de Wolbachia que se encuentra en G. rubens, a la que nos referimos como el «tipo rubens».»La población muestreada en Las Cruces, NM, tenía dos individuos infectados con la cepa Wolbachia de tipo rubens y tres individuos que estaban doblemente infectados con las cepas de tipo rubens y entero. Las poblaciones de G. integer en Austin y Dallas, Tx, también albergaban la misma cepa bacteriana, que, sobre la base del gen 16S rRNA y el gen FtsZ, parece idéntica a la encontrada en G. rubens de Lake Placid y Gainesville, FL. Esta cepa de tipo rubens también se presenta en especímenes de G. ovisopis muestreados en Gainesville. Solo pudimos obtener especímenes de G. asimilis de los cultivos de laboratorio de T. Walker y T. Zera; este último cultivo se derivó de la colonia de T. Walker. Los individuos de ambos cultivos fueron infectados con la misma cepa cuya secuencia para el gen FtsZ era idéntica a la cepa Wolbachia tipo rubens. La secuencia de fragmentos de genes del ARNr 16S indica que la cepa en esta especie tiene una transversión en la posición 380 de E. coli de una guanina a una timina, que en E. coli corresponde a la primera posición en el bucle tetra GCAA. En la cepa de tipo «assimilis», el bucle está compuesto de TAAA. Esta transversalidad no se encuentra en ninguna otra secuencia de ARNr Wolbachia 16S conocida hasta la fecha.
La población de G. pennsylvanicus muestra un patrón de infección más complejo. A lo largo de la mayor parte de la distribución que hemos muestreado, G. pennsylvanicus es polimórfico para el tipo de infección. Una población muestreada en Lethbridge, Alberta, Canadá, mostró la presencia de una cepa de Wolbachia diferente de las encontradas en G. rubens, G. assimilis, G. integer y G. ovisopis. Nos referimos a esta cepa como la cepa «tipo pennsylvanicus». De los 39 especímenes infectados muestreados en el centro de Illinois, 38 albergaban la cepa tipo pennsylvanicus, mientras que un espécimen portaba la cepa tipo rubens. Una localidad a 150 km al sur, Farina, Illinois, mostró una mezcla de individuos infectados con cepas del tipo pennsylvanicus o rubens o con ambas. De dos especímenes muestreados de Ann Arbor, MI, uno llevaba la cepa tipo rubens, y el otro estaba doblemente infectado con las cepas tipo pennsylvanicus y rubens. Para la población muestreada en Londres, Ontario, Canadá, a 215 km al noreste de Ann Arbor, de 19 individuos infectados, 10 portaban cepas de tipo pennsylvanicus, uno portaba cepas de tipo rubens y ocho estaban doblemente infectados con cepas de tipo pennsylvanicus y rubens (Fig. 3a). Este patrón polimórfico continúa en especímenes de G. pennsylvanicus recolectados en Vermont y Pensilvania. En Virginia y Carolina del Norte, solo detectamos individuos infectados con cepas de tipo pennsylvanicus o rubens. La población de G. pennsylvanicus en América del Norte es una mezcla de individuos infectados con el tipo rubens o el tipo pennsylvanicus, así como individuos que están doblemente infectados con ambas cepas e individuos que no están infectados (Fig. 3). Nuestros resultados hasta ahora indican que, en poblaciones de G. pennsylvanicus del este de América del Norte, la infección de tipo rubens es más frecuente en el norte que en el sur (Fig. 3a). Además, hemos encontrado que, en la mayoría de las localidades donde se producen ambas cepas, también están presentes individuos doblemente infectados (Figs. 2 y 3a).
Como resultado del «impulso» asociado con la propagación de una infección por Wolbachia (35), proponemos que la estructura genética de las poblaciones de G. pennsylvanicus que hemos muestreado, excluyendo Lethbridge, Canadá, se ha visto afectada por la presencia de cepas de Wolbachia de tipo rubens y pennsylvanicus. Por lo tanto, nos referiremos a las muestras de G. pennsylvanicus recogidas en estas regiones como Gryllus near (nr.) pennsylvanicus para reflejar la ambigüedad de su estado taxonómico impuesta por los tipos de infección encontrados en estas poblaciones.
Hemos muestreado G. firmus de Gainesville y la Estación Biológica Archbold en Lake Placid, FL, y de Fort Fischer, NC. Treinta y dos de los 35 especímenes muestreados de estas localidades no estaban infectados. Los tres individuos infectados procedían de Gainesville, Florida. Se encontró que dos portaban el tipo rubens, y el tercero llevaba la cepa Wolbachia tipo pennsylvanicus (Figs. 2 y 3a). Este hallazgo sugiere que la infección de estas dos cepas de bacterias se está trasladando a las poblaciones de G. firmus, especialmente a la luz del hecho de que G. pennsylvanicus no se conoce en Gainesville, Florida.
El análisis de las relaciones entre las diferentes cepas que hemos examinado de Wolbachia en la especie Gryllus utilizando el gen FtsZ indica que las cepas de tipo entero y rubens forman un grupo monofilético y no están estrechamente relacionadas con la cepa de tipo pennsylvanicus, que es basal a todas las otras cepas de Wolbachia del grupo B conocidas hasta ahora. La cepa de Wolbachia reportada por Werren et al. (23) en G. pennsylvanicus es del tipo rubens (Fig. 2).
Proponemos que las infecciones en los miembros anteriores del género Gryllus ofrecen una explicación para las incompatibilidades de apareamiento observadas obtenidas por Smith y Cade (17), Cade y Tyshenko (18) y Harrison (19) y apuntan a un posible papel de Wolbachia en la especiación de algunos miembros de este género. La incompatibilidad bidireccional observada entre G. rubens y G. integer es probable que sea el resultado de la infección con las dos cepas diferentes de Wolbachia que se encuentran en estas dos especies. La compatibilidad de G. rubens de Florida, con G. entero de Texas (17, 18) se puede explicar porque estas poblaciones portan la bacteria tipo rubens. Nuestros datos apoyan la conclusión de Smith y Cade (17) de que G. rubens y G. integer de Texas pueden ser la misma especie, a pesar de las diferencias en sus cantos de un grado que generalmente se usa para diferenciar especies.
Dado que G. pennsylvanicus está infectado con Wolbachia y G. firmus generalmente no, los cruces que muestran que los machos de G. pennsylvanicus son incompatibles con las hembras de G. firmus (19) pueden interpretarse como resultado de incompatibilidad citoplasmática causada por Wolbachia. Nuestra interpretación está corroborada por el patrón mitocondrial observado en estas dos poblaciones, a saber, que G. firmus y G. pennsylvanicus tienen tipos mitocondriales distintos por los que se han identificado estas dos poblaciones; sin embargo, aunque el ADNmt de G. pennsylvanicus se introduce fácilmente en la población de G. firmus, no ocurre lo contrario (36). Este patrón se observaría si G. pennsylvanicus está infectado con Wolbachia porque la mayoría de los individuos en la zona híbrida serían el resultado de la progenie de hembras infectadas, que en este caso portarían la G. tipo mitocondrial de pensilvania junto con la infección de Wolbachia hereditaria materna.
La incompatibilidad unidireccional entre los machos de G. ovisopis, portadores de la bacteria tipo rubens, y las hembras de G. firmus (T. Walker, comunicación personal) también se puede interpretar a la luz de esta infección. La falta de descendencia de cruces entre machos de G. pennsylvanicus y G. ovisopis con hembras de G. firmus indica que estas dos cepas podrían causar incompatibilidad. Sabemos que G. ovisopis y G. los rubens tienen la misma cepa de Wolbachia, por lo que la causa probable de la incompatibilidad bidireccional observada entre G. rubens y G. pennsylvanicus son las diferentes cepas de Wolbachia que pueden albergar.
Utilizando el gen FtsZ, observamos 39 diferencias de presión arterial entre las cepas de tipo pennsylvanicus y rubens, 41 diferencias entre las cepas de tipo pennsylvanicus y tipo entero, y 22 diferencias entre las cepas de tipo rubens y tipo entero. Para una comparación, en el mismo segmento de genes, solo hay un cambio de base entre las cepas de Wolbachia incompatibles bidireccionalmente encontradas en Drosophila simulans Hawaii y D. simulans Riverside (23). Con base en esta evidencia, así como en las incompatibilidades observadas en los apareamientos entre las respectivas especies de Gryllus, predecimos que las cepas de tipo rubens, integer y pennsylvanicus son incompatibles bidireccionalmente.
La zona híbrida entre G. pennsylvanicus y G. firmus designada por Harrison y Arnold (20) es más compleja que una interacción especie–especie. Algunos de los sitios que muestreamos a lo largo de la Cordillera Azul y los montes Apalaches muestran una distribución irregular de tipos de infección dentro de las poblaciones de G. pennsylvanicus (Fig. 3a). Por lo tanto, en esta región, pueden ocurrir posibles interacciones entre poblaciones de G. firmus no infectadas, G. nr. pennsylvanicus infectadas con Wolbachia de tipo rubens o pennsylvanicus y G. nr pennsylvanicus infectadas con cepas de Wolbachia de tipo rubens y pennsylvanicus. La infección de Wolbachia en las especies de Gryllus mencionadas y específicamente los múltiples tipos de infección encontrados en el G. nr. la población de pensilvania indica que la restricción al flujo genético puede ocurrir dentro de una población debido a las diferencias en el tipo de infección. El éxito reproductivo de los individuos en estas poblaciones dependerá de su perfil de infección, así como el de los individuos con los que se aparean. Nuestro concepto de lo que constituye una especie del género Gryllus debe ser reevaluado a la luz de las infecciones de Wolbachia que albergan.
Las infecciones por Wolbachia pueden extenderse a través de una población como resultado de la ventaja que tienen las mujeres infectadas sobre las mujeres no infectadas (35). Dado que G. se ha demostrado que pennsylvanicus y G. firmus se hibridan en el laboratorio (19) y que hay evidencia de hibridación en el campo (21), la distribución actual de G. firmus puede interpretarse como una reliquia, de un área más amplia a través de la cual se movió un barrido de una población infectada. Una explicación alternativa podría ser múltiples sitios de infección con la misma cepa de Wolbachia, pero no tenemos información sobre cómo las bacterias Wolbachia se transmiten horizontalmente a través de las especies o la frecuencia con la que se adquieren. Por lo tanto, elegimos la explicación más parsimoniosa, que la infección se originó en un lugar y posteriormente se propagó. De hecho, nuestros datos sugieren que las infecciones de Wolbachia tienen un componente geográfico y que el tipo rubens se originó en el sur, donde predomina (Fig. 3a). Sin embargo, en la población de Pensilvania del este de América del Norte, la infección de tipo rubens es prevalente en las poblaciones muestreadas en el norte. Estas localidades son los puntos más alejados de las poblaciones de Gryllus uniformemente infectadas con la cepa tipo rubens y lejos de cualquier G reportada. poblaciones de rubens (Fig. 3 a y b). Proponemos que la infección de tipo rubens se movió a través de la población de Gryllus que existía en el este de América del Norte antes del movimiento hacia el este de la cepa de tipo pennsylvanicus.
En las poblaciones de Gryllus, los individuos doblemente infectados pueden ser el resultado de la presión de selección en una población en la que existen dos cepas bacterianas que son bidireccionalmente incompatibles (Figs. 2 y 3a). En tal circunstancia, los individuos que están doblemente infectados serían seleccionados porque, si ambas infecciones pueden sobrevivir en un grillo, las hembras serían compatibles con los machos portadores de cualquiera de las cepas bacterianas. Un tercer barrido infeccioso de individuos doblemente infectados podría ocurrir a través de la población porque las hembras doblemente infectadas tienen una ventaja sobre las hembras singularmente infectadas, que solo pueden reproducirse con éxito con machos infectados con la misma cepa de Wolbachia. Se han reportado múltiples infecciones de una variedad de taxones de insectos (37-39), y se ha demostrado que los machos doblemente infectados son parcial o completamente incompatibles con las hembras infectadas por separado en otros insectos (37-41). Predecimos que las infecciones dobles podrían ocurrir en localidades donde las infecciones únicas con dos cepas de Wolbachia incompatibles bidireccionalmente ocurren en el mismo taxón o en taxones muy estrechamente relacionados.
En una pantalla de taxones de insectos templados utilizando PCR con cebadores específicos de ARNr de 16S, encontramos que el 16% de 615 taxones de insectos, de una amplia variedad de familias y órdenes, estaban infectados con Wolbachia (R. G. y H. M. R., datos no publicados), y se han obtenido tasas de infección similares para insectos tropicales (42). Dada esta frecuencia de infección, podemos predecir que otros insectos en zonas híbridas serán definidos al menos en parte por la infección por Wolbachia y la incompatibilidad citoplasmática. Algunos géneros de insectos pueden ser más propensos a la infección por Wolbachia como consecuencia de su historia natural. La especiación dentro de estos grupos debe examinarse con respecto al papel desempeñado por la Wolbachia.