Encefalitozoon cuniculi Cepa III Es una Causa de Encefalitozoonosis tanto en Humanos como en Perros

Resumen

Los microsporidios son organismos eucarióticos intracelulares obligados que se encuentran en una amplia gama de huéspedes vertebrados e invertebrados. El encefalitozoon cuniculi se encuentra comúnmente en conejos domésticos y roedores y también se encuentra en perros, otros cánidos y primates, incluidos los humanos. La secuenciación de ADN de los genes de ARN ribosómico se ha utilizado para identificar estos parásitos a nivel de especie y para definir las cepas I, II y III de E. cuniculi. Ocho nuevos aislados de perros se caracterizaron como cepa III de E. cuniculi mediante el uso de métodos moleculares. Esta cepa también se ha identificado en aislados de humanos inmunocomprometidos, lo que sugiere el potencial zoonótico de esta especie de parásito. También se ha informado de la excreción prolongada de esporas microsporidales de perros asintomáticos.

Encephalitozoon cuniculi es un protozoo intracelular obligado de los phylum Microspora y es un parásito común de los conejos domésticos y roedores. Ocasionalmente, estos parásitos se han reportado en otros huéspedes, incluidos perros, zorros azules (Alopex lagopus) y un pequeño número de otros carnívoros salvajes . Un número cada vez mayor de informes también describen una enfermedad clínica en humanos causada por E. cuniculi, pero se desconoce la fuente o fuentes de la infección en humanos .

Históricamente, la identidad del parásito se basó en características morfológicas y a veces ultraestructurales. Recientemente, miembros morfológicamente similares del género encefalitozoon han sido especiados mediante el uso de características inmunológicas y caracterización molecular de los genes de ARN ribosómico . Los aislados de E. cuniculi se han dividido en cepas I, II o III, basadas en el número de repeticiones de una secuencia de 4 bases (5′-GTTT-3′) en la región del espaciador transcrito interno (ITS) del gen del ARN ribosomal . Dos aislados de E. cuniculi para perros fueron designados cepa III sobre la base de la presencia de 4 repeticiones de secuencia . Posteriormente, se identificaron 4 aislados humanos como cepa III (aislados «Donovan» GenBank X98466, CDC: V282 e IPZ: MX-H5) y como cepa I en dos informes de Europa . Este estudio amplía ese trabajo al identificar 8 aislamientos adicionales de E. cuniculi de perros de 4 brotes como cepa III.Aunque no hay datos epidemiológicos que confirmen directamente la transmisión de perro a humano, los datos moleculares sugieren que los perros pueden servir como reservorios potenciales de parásitos. Además, se ha documentado la eliminación a largo plazo de esporas por perros asintomáticos, lo que refuerza aún más la probabilidad de transmisión zoonótica del parásito.

Materiales y métodos

Aislados de parásitos

Los cuerpos de 7 crías de 3 camadas no emparentadas y 1 perro se presentaron durante 18 meses al Laboratorio de Diagnóstico Veterinario de Texas para su evaluación post mortem. Los animales provenían de cuatro fuentes no relacionadas de diferentes regiones de Texas. Se realizó un diagnóstico de encefalitozoonosis en cada caso con base en los hallazgos histológicos. Se establecieron ocho aislados de parásitos a partir de tejidos frescos de los animales: 5 aislados se derivaron de tejidos cerebrales o renales de cachorros de Boston terrier de 5 a 7 semanas de edad (2 machos, 3 hembras) que murieron de enfermedad neurológica (aislados 1-5, camada 1). El Isolate 6 se derivó del cerebro de un terrier maltés macho de 10 semanas de edad que era 1 de 4 compañeros de camada (camada 2) que murieron de enfermedad neurológica. El Isolate 7 se derivó del cerebro de una perrita caniche miniatura de 10 semanas de edad (camada 3) que murió de una enfermedad neurológica. El aislado 8 se derivó del riñón de un perro salchicha miniatura de 18 meses de edad que murió de insuficiencia renal (tabla 1).

En la autopsia, los tejidos se recolectaron asépticamente y se homogeneizaron (homogeneizador de tejidos Ten Broeck; Corning, Corning, NY) utilizando PBS, pH 7.2, más 2× solución antibiótico-antimicótica (Gibco, Gaithersburg, MD). Las esporas microsporidiales se purificaron a partir de homogeneizado de tejido del huésped utilizando un método de gradiente de densidad de percolación descrito anteriormente, modificado cambiando la velocidad de centrifugación a 600 g . Los microsporidios se cultivaron en células RK-13 (ATCC CCL-37) utilizando medio RPMI 1640 suplementado con suero fetal bovino al 5% y solución antibiótico-antimicótica 2× (Gibco) como se describió anteriormente . El cultivo de parásitos y el análisis de ADN se realizaron durante varios meses en función de la recepción de las diversas muestras de casos, por lo que la posibilidad de contaminación cruzada accidental era insignificante.

Aislamiento de ADN

Para los aislados 1-6 y 8, los parásitos se cultivaron en cultivo a corto plazo para generar esporas adecuadas para la caracterización molecular. Para el isolate 7, los parásitos se purificaron directamente del tejido cerebral fresco del cachorro para el aislamiento del ADN. Para la mayoría de los aislados, el ADN se extrajo de esporas purificadas utilizando la matriz Instagene (BioRad, Hercules, CA), siguiendo el protocolo del fabricante para cultivos bacterianos . Para algunos de los trabajos moleculares con los aislados 6 y 8, las esporas se procesaron como se describió anteriormente, y el ADN se extrajo de las esporas mediante un método estándar de extracción de fenolcloroformo utilizando un sistema de tubo de microfusión de gel de partición (sistema de gel de bloqueo de fase ligera; Fabricante 5 Prime→3 Prime, Westchester, PA) para optimizar la recuperación del ADN. El ADN se precipitó con etanol, el pellet se resuspendió en TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,6) y la concentración de ADN se estimó utilizando las proporciones A260 : A280 por espectrofotometría UV (Ultraspec Plus; Pharmacia, Piscataway, NJ). El ADN extraído de esporas de encefalitozoarios hellem derivadas de cultivos de tejidos se utilizó como control positivo, y se incluyó un control negativo solo con reactivo en todas las reacciones de extracción y secuenciación.

Secuenciación parcial de ADN y análisis del gen de ADN ribosomal de subunidad pequeña (ARNR SSU)

Una porción del extremo 5′ del gen ARNr SSU de cada uno de los 8 aislados se amplificó utilizando un par de cebadores PMP1 y PMP2, como se describió anteriormente . La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para cada aislado se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante (reactivos de núcleo de PCR de GeneAmp, N808-0009; Perkin-Elmer Cetus/Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ). La amplificación se realizó en un termociclador (PTC-200 Peltier; MJ Research, Watertown, MA). Después de la desnaturalización inicial durante 5 minutos a 95°C, se añadió polimerasa Taq (0,5 U) a cada reacción de 25 µL. Las muestras se sometieron a 35 ciclos de desnaturalización (94°C, 30 s), recocido (60°C, 30 s) y extensión (72°C, 1 min) seguidos de 10 minutos a 72°C para la extensión final. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron mediante columnas de cromatografía (Micro Bioespín 30; BioRad). Las muestras se mantuvieron a 4°C hasta que se procesaron para su secuenciación automatizada.

Análisis de ADN de la región ITS

Una porción de la región ITS del gen de ARN ribosomal de cada aislado fue amplificada por PCR con el par de cebadores int530f e int580r, utilizando los métodos de amplificación descritos anteriormente. El producto de PCR resultante se secuenció en un secuenciador de ADN automatizado (modelo 377; Perkin-Elmer Applied Biosystems / Roche Molecular Systems, Branchburg).

Secuenciación automatizada de ADN

El ADN amplificado por PCR de cada aislado se amplificó para una secuencia automatizada con un kit comercial (ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready-Reaction Kit; Promega, Madison, WI) siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las reacciones se realizaron en un termociclador MJ Research Minicycler). Las muestras se sometieron a 35 ciclos de desnaturalización (94°C, 30 s), recocido (60°C, 30 s) y extensión (72°C, 1 min) seguidos de 10 minutos a 72°C para la extensión final. Los productos de extensión se purificaron utilizando columnas de cromatografía (Micro Bio-Spin; BioRad), se secaron en una centrífuga al vacío (Savant Instruments, Holbrook, NY) y se almacenaron a -20°C hasta que se secuenciaron en un secuenciador automático (Perkin-Elmer 377 ABI Applied Biosystems).

Mediante el uso de un software de alineación (Sequencher; Gene Codes, Ann Arbor, MI), se obtuvieron secuencias de consenso de ∼265 bases para una porción del gen SSU rRNA para cada aislado de parásito. Estas secuencias se evaluaron para su homología frente a secuencias de encefalitozoos previamente reportadas en la base de datos NCBI GenBank utilizando una búsqueda simple de BLASTN.

Ensayo de movilidad heteroduplex de ADN de doble cadena

El ADN del aislado 6 se amplificó por PCR con el par de cebadores int530f e int580r como se describió anteriormente . Los productos amplificados por PCR se analizaron para la generación de heteroduplejos y homoduplejos utilizando aislamientos previamente caracterizados de E. cuniculi de varios huéspedes.

Resultados

Se establecieron un total de 8 aislados de parásitos de 4 brotes clínicos separados en cultivo de tejidos. Tanto las características microscópicas de luz como las características de crecimiento in vitro de los parásitos sugirieron que eran E. cuniculi, un microsporidiano reportado previamente en perros y en otros huéspedes. La secuenciación parcial del extremo 5′ del gen SSU rRNA de cada aislado (GenBank AF144246-AF144253) confirmó la identidad de los parásitos como E. cuniculi, ya que todos los especímenes mostraron homología al 100% con secuencias publicadas previamente (GenBank L39107dEZORGOA, L17072¦EZORGSMALL; X98470¦ECDSSRR2).

El análisis heteroduplex y la secuenciación de la región ITS del gen de ARN ribosomal caracterizaron aún más a todos los aislados de perros como cepa III, confirmando informes previos de variaciones sutiles entre aislados de E. cuniculi de varios roedores, conejos y huéspedes humanos. La figura 1 ilustra el ADN homodúplex formación entre canino aislar 6 y una caracterizado previamente cepa III aislar así como la formación de heterodúplex aislar entre 6 y las otras cepas de E. cuniculi.

Discusión

La importancia biológica de múltiples cepas de E. cuniculi aún no se ha aclarado; sin embargo, la capacidad de distinguir entre cepas de parásitos puede proporcionar una herramienta para rastrear las fuentes de infección en estudios epidemiológicos. Nuestros datos moleculares que identifican 8 aislados microsporidianos de perros como E. cuniculi cepa III coinciden con un estudio previo que clasificó 2 aislados de perros como cepa III . Se han notificado aislados de conejo, ratón y zorro como cepas I o II . Estos datos sugieren que la cepa III podría estar predominantemente asociada a perros. Los aislados humanos se han identificado como cepa III en el hemisferio occidental y como cepa I en Europa . Aunque las fuentes de exposición humana a la E. cuniculi es desconocido, hay cada vez más evidencia de que los animales pueden servir como reservorios de infección, y hay una posibilidad de transmisión zoonótica del organismo entre animales y personas. Es una posibilidad interesante que las diferencias geográficas y culturales en la propiedad de mascotas puedan jugar un papel en la exposición humana, ya que los perros son mascotas comunes en los Estados Unidos, mientras que los conejos se mantienen con frecuencia como mascotas o como alimento en Suiza y otros países europeos.

El examen de muestras fecales y de orina de padres clínicamente normales de Boston terrier y 1 cachorro de la camada 1 mostró niveles bajos de desprendimiento de esporas durante 4 4 meses después de la muerte de los compañeros de camada (aislados 1-5; datos no publicados). Esta observación sugiere además un posible mecanismo para la transmisión directa o indirecta de los parásitos de perros a humanos a través de la contaminación de ambientes localizados con excreciones urinarias y fecales de perros. Aunque ningún estudio epidemiológico ha evaluado la relación entre la propiedad/exposición de mascotas y las infecciones microsporidiales humanas, en un solo caso en el que los niños estuvieron expuestos a cachorros con encefalitozoonosis manifiesta, 1 de cada 3 niños fueron seroconvertidos . Es necesario analizar aislados adicionales de E. cuniculi de varios huéspedes para evaluar más a fondo el riesgo de mantener mascotas potencialmente infectadas en los hogares de personas inmunodeprimidas con alto riesgo de infecciones microsporidiales.

Agradecimientos

Agradecemos a los patólogos del Laboratorio de Diagnóstico Médico Veterinario de Texas Jay Hoffman, Joanne Mansell y Bruce Abbitt por proporcionar tejidos caninos para este estudio.