Definición
El etiquetado fluorescente es el proceso de unión de tintes fluorescentes a grupos funcionales contenidos en biomoléculas para que puedan visualizarse mediante imágenes de fluorescencia (nature.com La disponibilidad de nuevos fluoróforos ha cambiado drásticamente las posibilidades de detección sensible de biomoléculas y el análisis de sus interacciones. Los tintes fluorescentes mejorados ahora permiten estudios previamente imposibles de estructuras y procesos celulares. Las etiquetas fluorescentes ofrecen muchas ventajas, ya que son altamente sensibles incluso a bajas concentraciones, son estables durante largos períodos de tiempo y no interfieren con la función de las moléculas objetivo. La imagen dirigida de las células etiquetadas permite rastrearlas in vitro e in vivo. El uso de diferentes fluoróforos en la misma muestra también puede permitir la observación simultánea de varias moléculas al mismo tiempo. Los fluoróforos más utilizados son el isotiocianato de fluoresceína (FITC), derivados de rodamina (TRITC), cumarina y cianina. Estos tintes orgánicos sintéticos se utilizan para etiquetar biomoléculas como proteínas, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, bacterias o levaduras. Los fluorocromos de origen natural, como la Proteína Fluorescente Verde (GFP), también se pueden usar para etiquetar genéticamente a las células vivas.
- Etiquetado fluorescente de proteínas
El etiquetado fluorescente permite a los investigadores investigar la dinámica conformacional y las interacciones moleculares de las proteínas o rastrear sus movimientos para comprender mejor sus funciones biológicas (Modesti M, 2011). Para obtener una mejor comprensión de la unión de receptores y ligandos, las estructuras de proteínas y la actividad enzimática, también se pueden etiquetar péptidos individuales. Los anticuerpos marcados con fluorocromo se utilizan ampliamente en la investigación biomédica para detectar antígenos en ensayos de inmunofluorescencia y también son herramientas esenciales en inmunodiagnóstico. Para garantizar resultados fiables, la conjugación de fluoróforos no debe interferir con las características de unión al antígeno del anticuerpo (Nath N et al, 2016). - Etiquetado fluorescente de ácidos nucleicos
Los ensayos basados en fluorescencia desempeñan un papel importante en los estudios biofísicos de la estructura, función y dinámica de los ácidos nucleicos. Los avances recientes en métodos de etiquetado y sistemas de imágenes han permitido la observación directa in vivo del ADN y el ARN, y de sus interacciones con otros componentes celulares. La obtención de imágenes de células vivas de ácidos nucleicos ha abierto nuevos caminos para comprender mejor la organización de la cromatina y la regulación de la expresión génica. (Dirks RW et al, 2018). - Etiquetado fluorescente de polisacáridos
Los polisacáridos complejos, como la heparina, son componentes estructurales de la matriz extracelular. Estos polisacáridos son esenciales para la adhesión celular, la migración y el crecimiento (Prigent-Richard S. et al, 1998). Algunos compuestos también son conocidos por sus propiedades anticoagulantes, antitrombóticas, antiinflamatorias, antivirales y antiangiogénicas. Los métodos basados en fluorescencia facilitan la identificación de nuevos polisacáridos bioactivos y la caracterización de sus funciones biológicas (Roger O et al, 2002). - Etiquetado fluorescente de lípidos
Los lípidos celulares desempeñan un papel crucial en la célula para el almacenamiento de energía, para la formación de membranas celulares y para los procesos de señalización intracelular (Maekawa M. y Fairn G, 2014). El colorante lipofílico Rojo Nilo se usa ampliamente para teñir lípidos intracelulares con el fin de analizar su ubicación y organización (Greenspan P et al, 1985). Además, para estudiar la dinámica lipídica, también es posible el etiquetado específico en células vivas (Schultz C et al, 2010).
Técnicas de etiquetado fluorescente
Los métodos de etiquetado fluorescente de uso común utilizan técnicas de etiquetado químico, enzimático, de etiqueta de péptidos/proteínas y genético (Sahoo H, 2012 , Toseland CP, 2013).
- Técnicas de etiquetado químico: Los fluoróforos se acoplan a las moléculas objetivo a través de la modificación química (unión covalente o no covalente). Los métodos de etiquetado químico tienen varias ventajas, ya que son robustos, fáciles de realizar y muy eficientes con una amplia gama de fluoróforos. Son más adecuados para estudios in vitro que in vivo.
- Técnicas de etiquetado enzimático: Las reacciones enzimáticas permiten un etiquetado rápido, altamente eficiente y selectivo in vivo e in vitro y se pueden usar para apuntar a proteínas o células enteras. Sin embargo, debido al gran tamaño de las etiquetas, pueden ocurrir interferencias con la función de las moléculas objetivo.
- Etiqueta de péptido / proteína: Una técnica de reciente desarrollo, y muy prometedora, permite el etiquetado específico y selectivo de proteínas mediante la incorporación de etiquetas fluorescentes cortas que no interrumpen el plegado ni la función de la molécula. Esta técnica también es fácil de realizar y se puede usar para investigar diferentes sitios de proteínas individuales dependiendo de la especificidad de la etiqueta peptídica.
- Etiquetado genético: El etiquetado genético se puede lograr utilizando dominios de proteínas, pequeños péptidos o aminoácidos individuales que están marcados con colorantes fluorescentes y se pueden unir específicamente a sitios a lo largo de los cromosomas in vivo. Este enfoque permite la detección de anomalías cromosómicas como deleciones o duplicaciones.
- Etiquetado multicolor: Un requisito común para la obtención de imágenes de células vivas y para aplicaciones de citometría de flujo es la capacidad de seguir o detectar múltiples proteínas marcadas con fluorescencia al mismo tiempo. Para este propósito, se pueden usar tintes diseñados específicamente con un desplazamiento de Stokes muy grande, que permiten el monitoreo simultáneo de diferentes procesos bioquímicos.
Ensayos basados en fluorescencia
Los ensayos basados en fluorescencia se basan en la capacidad de los fluoróforos para reemitir luz después de la exposición a partículas de luz o fotones. La diferencia en la longitud de onda entre la luz de excitación y la luz de emisión, el llamado desplazamiento de Stokes, se puede detectar en microscopios y sistemas de imágenes. Cada fluoróforo tiene un desplazamiento de Stokes específico. Diferentes ensayos permiten a los investigadores localizar biomoléculas, observarlas en tiempo real, investigar sus interacciones y estudiar las actividades enzimáticas.
- Microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia permite la identificación de células y componentes celulares y el monitoreo de la fisiología celular con alta especificidad. La microscopía de fluorescencia separa la luz emitida de la luz de excitación mediante filtros ópticos. El uso de dos indicadores también permite la observación simultánea de diferentes biomoléculas al mismo tiempo. Mientras que los sistemas de imágenes convencionales permiten una resolución de 200 a 300 nm debido a los límites de difracción física, los nuevos microscopios de fluorescencia de súper resolución como STED (agotamiento de emisiones estimuladas) superan estos límites y proporcionan información sobre el mundo de las moléculas a nanoescala (Sanderson MJ et al, 2014). - Citometría de flujo
La citometría de flujo se utiliza ampliamente en la investigación básica y la práctica clínica para medir la señal de fluoróforos específicos. Las células y partículas se analizan y, finalmente, se clasifican en «tiempo real» a medida que pasan a través del haz de luz de los detectores que cuantifican la fluorescencia producida por anticuerpos o ligandos marcados. Estos marcadores se unen a moléculas específicas en la superficie celular o dentro de la célula, lo que permite su detección y cuantificación. Se pueden medir varios parámetros como el tamaño y el volumen en células individuales, y se pueden aislar y caracterizar diferentes tipos de células (Nolan JT y Condello D, 2013). La citometría de flujo encuentra amplias aplicaciones en campos como la inmunología, la hematología, la medicina de trasplantes, la oncología y la genética. - Hibridación fluorescente in situ (FISH)
La hibridación fluorescente in situ (FISH) permite la localización de secuencias de ADN específicas en cromosomas. Las sondas fluorescentes de ADN o ARN se utilizan para hibridar e identificar secuencias de ADN diana complementarias. El FISH se ha utilizado tradicionalmente para mapear genes en cromosomas, por ejemplo, durante el Proyecto Genoma Humano. Hoy en día, la hibridación fluorescente in situ se utiliza principalmente con fines diagnósticos en la detección de anomalías cromosómicas o en el análisis de células cancerosas (O’Connor C, 2008). - Espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS)
La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) permite el análisis de cambios temporales en la intensidad de fluorescencia de fluorocromos, que son causados por influencias químicas, biológicas o físicas. El FCS se introdujo por primera vez para investigar la interacción entre fármacos y ADN y ahora representa una herramienta sensible para determinar los niveles de concentración y agregación de proteínas, así como para observar las interacciones moleculares (Tian Y et al, 2011). - Microarrays
Los microarrays permiten el estudio de la expresión génica en diferentes condiciones. Miles de genes se pueden examinar al mismo tiempo en chips de ADN. Estos son portaobjetos microscópicos impresos con pequeñas manchas que contienen secuencias de ADN conocidas que pueden unirse selectivamente a moléculas de ARNm/ADNc marcadas con fluorescentes. Después de la hibridación, se lee el chip de ADN y los datos se utilizan para crear perfiles de expresión génica (Hoen PAC et al, 2003).
Etiqueta fluorescente: Imagen de células vivas
La observación cinética de procesos celulares utilizando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo se ha convertido en una técnica fundamental en biología celular, ya que la imagen de células vivas puede proporcionar información muy valiosa sobre el crecimiento celular y los mecanismos de transporte. Un desafío importante en la microscopía de lapso de tiempo es minimizar los efectos fototóxicos resultantes del fotoblanqueo. La exposición a la luz destruye progresivamente las moléculas fluorescentes, lo que conduce a una reducción de la señal de fluorescencia y a la formación de radicales libres que pueden dañar las células. Por lo tanto, es crucial para el método de obtención de imágenes de células vivas encontrar un equilibrio entre reducir la exposición a la luz tanto como sea posible y obtener señales útiles para observar las células. Los científicos también necesitan crear un entorno fisiológico que permita replicar de cerca la dinámica in vivo. (Ettinger y Wittmann T, 2014).
Etiquetado fluorescente PromoCell
La disponibilidad de nuevos fluoróforos ha cambiado drásticamente las posibilidades para la detección sensible de biomoléculas y el análisis de sus interacciones. Los tintes fluorescentes mejorados ahora permiten estudios previamente imposibles de estructuras y procesos celulares. PromoCell ofrece una amplia gama de fluoróforos de alta calidad para el etiquetado fluorescente de diversas biomoléculas: etiquetado de proteínas, etiquetado de anticuerpos, etiquetado de ácidos nucleicos (etiquetado de ADN, etiquetado de ARN), así como kits de etiquetado completos y conjugados fluorescentes listos para usar.
Nuestros tintes PromoFluor son alternativas rentables a los fluoróforos líderes conocidos y abarcan el espectro de longitudes de onda del azul al rojo lejano. Muestran una excelente intensidad de fluorescencia y fotoestabilidad, una fuerte absorción de luz, alto rendimiento cuántico de fluorescencia y buena solubilidad en agua, y se pueden usar para microscopía de fluorescencia, hibridación fluorescente in situ (FISH), espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) y microarrays (proteína, ADN). Algunos de ellos ofrecen un cambio de Stokes extra grande, lo que los hace ideales para aplicaciones de etiquetado multicolor o citometría de flujo. Los tintes PromoFluor están disponibles, p. ej. como ésteres del NHS, maleimidas y etiquetas amino-modificadas listas para el acoplamiento covalente o como conjugados con biotina, faloidina y desoxinucleótidos (dUTPs). Además, también proporcionamos kits de etiquetado de anticuerpos de proteína & de alta calidad con diferentes tintes PromoFluor.