Formación de triple hélice de ADN: Una herramienta potencial para la reparación genética

*Autor para correspondencia: D. V. Kohli
Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Dr. Hari Singh Gour Vishwavidyalaya, Sagar-470 003, India
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Abstract

DNA triple helices offer new perspectives towards oligonucleotide-directed gene regulation. Los oligonucleótidos formadores de triple hélice, que se unen al ADN de doble cadena, son de especial interés ya que están dirigidos al gen en sí en lugar de a su producto de ARNm (como en la estrategia antisentido). Sin embargo, la escasa estabilidad de algunas de estas estructuras podría limitar su uso en condiciones fisiológicas. Ligandos específicos pueden intercalarse en hélices triples de ADN y estabilizarlas. Esta revisión resume los avances recientes en este campo, al tiempo que destaca los principales obstáculos que quedan por superar, antes de que se pueda lograr la aplicación de la tecnología triplex a la reparación terapéutica de genes.

Formación de triple hélice (fig. 1) recientemente ha sido objeto de considerable interés debido a su posible aplicación en el desarrollo de nuevas herramientas de biología molecular, así como de agentes terapéuticos, y debido a la posible relevancia de las estructuras de ADN-H en los sistemas biológicos . En las estructuras intermoleculares, una secuencia oligopirimidina-oligopurina de duplex de ADN está unida por un oligonucleótido de tercera hebra en el surco principal .

hay Dos tipos principales de triples hélices se han descrito, dependiendo de la orientación de la tercera hebra . Los primeros complejos triples helicoidales reportados involucraron una tercera hebra pirimídica cuya unión descansa en enlaces de hidrógeno de Hoogsteen entre un par de bases T-A y timina, y entre un par de bases C-G y citosina protonada . El oligonucleótido que contiene (T, C) se une paralelamente a la hebra de oligopurina en el llamado motivo pirimidina. Una segunda categoría de hélices triples contiene purinas en la tercera hebra, que está orientada antiparalela a la hebra de oligopurina. Los trillizos de base C * G×G y T * A×A se forman después de un esquema de enlace de hidrógeno de Hoogsteen inverso . Los oligonucleótidos que contienen T y G también pueden formar hélices triples cuya orientación depende de la secuencia de base .

La formación de triple hélice ofrece un medio directo de manipular selectivamente la expresión génica en células donde las triple hélices de ADN ofrecen nuevas perspectivas hacia la regulación génica dirigida por oligonucleótidos (fig. 2). Los oligonucleótidos formadores de triple hélice sintéticos (TFO) se unen con alta afinidad y especificidad a la hebra de purina en el surco principal de la secuencia homopurina – homopirimidina en el ADN de doble cadena .

Los TFO son buenos candidatos para ser utilizados como agentes fijadores de ADN específicos del sitio y se están investigando para su uso como agentes terapéuticos potenciales. Se han estudiado en aplicaciones antisentido, donde están diseñados para atacar ARNm, aplicaciones de antígenos, donde controlan la expresión génica a través de la formación de triple hélice, y en aplicaciones que se dirigen a proteínas, donde se utilizan como aptámeros .

Los TFOs también se pueden usar en terapia génica donde se dirigen a la secuencia de ADN del gen mutado para prevenir su transcripción. Los tractos ricos en purinas se encuentran con frecuencia en regiones promotoras de genes y se ha demostrado que los TFOs dirigidos a estos sitios reguladores reducen selectivamente la transcripción de los genes dirigidos, probablemente bloqueando la unión de activadores transcripcionales y/o la formación de complejos de iniciación. La modulación de transcripción mediada por triplex tiene una aplicación potencial en la terapia, ya que se puede usar; por ejemplo, para reducir los niveles de proteínas que se cree que son importantes en los procesos de la enfermedad. Los TFOS también se pueden utilizar como herramientas moleculares para estudiar la expresión génica y se ha demostrado que son eficaces en varias estrategias de orientación génica en células vivas. Los TFOs pueden unirse a regiones de polipurina / polipirimidina en el ADN de una manera secuencial específica. La especificidad de esta unión plantea la posibilidad de utilizar la formación triplex para la modificación dirigida del genoma, con el objetivo final de reparar defectos genéticos en las células humanas. Varios estudios han demostrado que el tratamiento de células de mamíferos con TFOs puede provocar la reparación y recombinación del ADN, de una manera que puede aprovecharse para introducir los cambios de secuencia deseados. Se ha informado de varios estudios en los que se utilizaron oligonucleótidos como compuestos antígenos dentro de las células .

Formación de ADN de triple hélice

La formación de triple hélice es el resultado de la unión de oligoinucleótidos con una alta especificidad de reconocimiento a la ranura principal del ADN de doble hélice mediante la formación de enlaces de tipo Hoogsteen con bases de purina de los pares de bases Watson-Crick, el compuesto diseñado racionalmente para la regulación artificial de la expresión génica . La formación triplex requiere iones Mg2+, mientras que es inhibida por iones K+.

En la estrategia de triple hélice o antígeno, el oligonucleótido se une en el surco principal del ADN de doble cadena a través de la unión de hidrógeno de Hoogsteen para formar una triple hélice . Los TFOs se unen a secuencias de homopurina-homopirimidina en ADN de doble cadena. Hay cuatro motivos estructurales para la formación triplex que se han descrito en base a la composición de la tercera hebra y su orientación en relación con la hebra rica en purinas del dúplex. Los TFOs con motivos de purina (los que se componen de G y A) forman trillizos G*G:C y A*A:T y se unen en orientación antiparalela con respecto a la hebra de purina del dúplex. Por otro lado, el motivo de pirimidina TFOs (C/T) forma triplejos en orientación paralela y generalmente solo a pH bajo debido a la necesidad de protonar las bases de la citosina para formar enlaces Hoogsteen; forman trillizos C+*G:C y T*A:T. Finalmente, los TFOs mezclados de purina y pirimidina se unen en orientación paralela o antiparalela y forman trillizos G*G:C y T*A:T. La orientación en la que se unen los TFOs con motivos mixtos depende del número de pasos de GpA y ApG en el tracto homopurino . La orientación antiparalela se ve favorecida por un mayor número de pasos, mientras que un número bajo de pasos favorece la orientación paralela .

Una vez que se establece el mejor motivo para unir una secuencia objetivo en particular, los problemas con los oligonucleótidos fosfodiéster naturales limitan el éxito del enfoque antigénico y las aplicaciones terapéuticas de los oligonucleótidos en general. Los oligonucleótidos con la columna vertebral de fosfodiéster natural son susceptibles a endo y exonucleasas. La actividad predominante que degrada los oligonucleótidos es la actividad de la 3 ‘ – exonucleasa, pero la actividad de la endonucleasa también se ha observado en algunos entornos . Por lo tanto, para su aplicación como terapia in vivo, los TFOS deben ser capaces de resistir la actividad tanto de la exonucleasa como de la endonucleasa para alcanzar su objetivo. Se requiere una modificación de la columna vertebral que confiere resistencia a la nucleasa, pero permite la unión al ADN de doble cadena con alta afinidad para las aplicaciones in vivo de TFOs.

Los oligómeros de morfolino fosforodiamidato son oligonucleótidos troncales modificados que han sido investigados previamente como agentes antisentidos . Los oligonucleótidos de morfolino tienen una columna vertebral sin carga en la que el azúcar desoxirribosa del ADN es reemplazado por un anillo de seis miembros y el enlace fosfodiéster es reemplazado por un enlace fosforodiamidato (fig. 3). Los oligonucleótidos de morfolino son resistentes a la degradación enzimática y parecen funcionar como agentes antisentidos al detener la traslación o interferir con el empalme pre-ARNm en lugar de activar la RNasa H. Se han administrado con éxito a células de cultivo de tejidos mediante métodos que alteran físicamente la membrana celular, y un estudio que comparó varios de estos métodos encontró que la carga de raspado era el método más eficiente de administración; sin embargo, debido a que la columna vertebral de morfolino no está cargada, los lípidos catiónicos no son mediadores efectivos de la captación de oligonucleótidos de morfolino en las células . Un informe reciente demostró la formación triplex por un oligonucleótido morfolino y, debido a la columna vertebral no iónica, estos estudios mostraron que el oligonucleótido morfolino era capaz de formación triplex en ausencia de magnesio .

Cationes se han demostrado para desempeñar un papel importante en la formación de la triple hélice. Cuando se usan oligonucleótidos de fosfodiéster como TFOs, el magnesio generalmente se requiere para la formación de triplex con purina y TFOs con motivos mixtos; también acelera la reacción y estabiliza el triplex formado con TFOs con motivos de pirimidina . Se ha demostrado que otros cationes divalentes funcionan en la misma capacidad que el magnesio con respecto a la formación triplex . El magnesio se produce a una concentración de ~0,8 mm en la célula y ~1,5 mm en la sangre, pero la mayoría de las reacciones triplex in vitro se realizan en MgCl2 de 5 a 10 mm. El potasio se encuentra en la célula a una concentración de ~140 mm, y a 4 mm en la sangre. Las altas concentraciones de potasio pueden inhibir la formación de triples con oligonucleótidos ricos en guanina diseñados como TFOs al favorecer otras estructuras secundarias de ADN, como dímeros y cuádruples . Será necesario superar la capacidad limitada del fosfodiéster TFOs para formar un triplex con bajo contenido de magnesio y alto contenido de potasio para que sean efectivos en condiciones fisiológicas. En un estudio reciente de morfolino TFOs, se demostró la formación triplex en ausencia de magnesio y en presencia de potasio. Estas propiedades hacen que el morfolino TFOs sea un buen candidato para estudios posteriores como terapia antigénica.

Modelado molecular

La estructura triplex de ADN se puede construir mediante técnicas de modelado molecular mediante el uso de coordenadas que tengan en cuenta correctamente la conformación de azúcar de las hélices triples con motivos (T,C). Esta estructura está más cerca de un ADN en forma B según lo informado por los estudios de RMN en comparación con la estructura propuesta , basada en la difracción de rayos X de fibra. El programa JUMNA permite construir estructuras de ADN de acuerdo con sus parámetros helicoidales . Un sitio de intercalación se puede crear fácilmente en el tríplex duplicando el parámetro de subida para dos trillizos base T·A×T adyacentes ( subida = 6,8 Å), y posteriormente disminuyendo el parámetro de torsión entre estos dos trillizos de 34° a 16° para reducir las restricciones de distancia de unión.

Usando el modelado molecular, se puede demostrar la posibilidad de formar una triple hélice paralela en la que la hebra individual interactúa con el duplex intacto en el surco menor, a través de interacciones de base novedosas .

JUMNA utiliza una mezcla de coordenadas helicoidales e internas (valencia y ángulos diédricos) para describir la flexibilidad del ácido nucleico. Los parámetros helicoidales posicionan cada nucleótido de monofosfato de 3 ‘ con respecto a un sistema de eje fijo. Las uniones entre nucleótidos sucesivos se mantienen con restricciones cuadráticas en las distancias O5 ‘- C5’. Además de un número reducido de variables con respecto a los programas de coordenadas cartesianas, la elección de variables físicamente significativas permite movimientos conformacionales grandes y concertados durante la minimización, junto con un control eficiente de la estructura y una fácil introducción de restricciones o restricciones. Las herramientas disponibles incluyen mapeo adiabático y búsquedas combinatorias con respecto a los parámetros estructurales elegidos. Las particularidades del campo de fuerza Flexible incluyen la presencia de un término específico para explicar la dependencia angular de los enlaces de hidrógeno y la posibilidad de una detección de energía electrostática con una función dieléctrica sigmoidal , ε (R) =D-(D-D0)/2 exp (-RS), donde R es la distancia entre dos cargas. La pendiente S, el valor de meseta a larga distancia D y el valor inicial D0 de la función son ajustables, con valores predeterminados de 0,16, 80 y 1, respectivamente, utilizando dos supuestos ya empleados para construir la triple hélice de ranura menor . Primero, los trillizos de base están restringidos para ser coplanares para evitar cualquier posible interacción entre trillizos de base. Estas interacciones se forman fácilmente durante la construcción de hélices estiradas, pero no pueden desempeñar un papel en el reconocimiento o el intercambio de cadenas, ya que estos procesos son independientes de la secuencia general. Se ha comprobado que la estructura optimizada del tríplex de ranura menor es independiente de estas restricciones. La segunda suposición, en línea con la estequiometría de complejos RecA/ ADN, que muestra tres nucleótidos por monómero RecA, es el uso de simetría helicoidal de trinucleótidos. Por esta razón, los estudios preliminares se han limitado a secuencias con repetición de trinucleótidos.

Se necesitan restricciones o restricciones específicas para la construcción y manipulación triplex. Estos incluyen las restricciones de «meseta» y las restricciones de simetría de trinucleótidos, descritas anteriormente . La sujeción de «meseta» mantiene la coplanaridad de las bases formando un triplete, al tiempo que permite las rotaciones y desplazamientos requeridos para el cambio de par de bases. La restricción de simetría de trinucleótidos implica la equivalencia de las variables que describen cada grupo sucesivo de tres nucleótidos. El estiramiento de dsDNA, de modo que la torsión disminuye y la ranura menor se abre, se ha logrado previamente restringiendo la distancia entre los átomos terminales de O3′ de la unidad de simetría de trinucleótidos. Este sistema de retención se ha modificado ligeramente porque la distancia de O3′-O3′ puede verse alterada por un desplazamiento lateral de la columna vertebral durante el intercambio de hilos. En un trabajo reciente, solo se restringió la componente del vector O3′ – O3 ‘ paralelo al eje de la hélice. Las restricciones en el ancho de la ranura, calibradas con la ayuda de cálculos electrostáticos numéricos de Poisson-Boltzmann, se utilizaron para evitar el estrechamiento de la ranura debido a la falta de moléculas de disolvente explícitas .

La conmutación de pares de bases se estudia por rotación de bases, utilizando el enfoque definido por Bernet et al . Esto implica una restricción aplicada al ángulo θ entre el enlace glucosídico (purina: C1′-N9 o pirimidina: C1′-N1) y el vector que une los dos átomos C1′ de un par de bases, proyectado en el plano perpendicular a un eje helicoidal local. θ tiene un valor de 55° en ADN-B canónico. Modelar el cambio de par de bases para una base elegida implica una variación adiabática de θ de 65° a 10° por pasos de 2° mientras se mantienen las restricciones de «meseta» y estiramiento.

Los obstáculos y limitaciones encontrados en la formación de triple hélice

Las aplicaciones biológicas de los OTF se ven comprometidas por consideraciones biofísicas fundamentales, así como por limitaciones impuestas por condiciones fisiológicas. La formación triplex implica el acercamiento y unión de una tercera cadena con carga negativa a un duplex con carga doble negativa. La neutralización de la repulsión de carga se proporciona típicamente experimentalmente por niveles de Mg++ (5-10 mm) que son mucho más altos de lo que se cree que está disponible en las células . Además, la formación triplex implica cambios conformacionales en la parte de la tercera cadena, y cierta distorsión del duplex subyacente . Los triplejos con motivo de pirimidina son inestables a pH fisiológico debido a la necesidad de protonación de citosina que ocurre a pH relativamente ácido (pKa = 4,5). Esto es necesario para el segundo enlace de hidrógeno de Hoogsteen, aunque la carga positiva resultante aparentemente hace la contribución más importante a la estabilidad triplex . Motivo pirimidina triplex contiene adyacentes citosinas a menudo son menos estables que los aislados citosinas. Tradicionalmente, esto se ha atribuido a los efectos de repulsión carga-carga, aunque un estudio reciente sugiere que la protonación incompleta de citosinas adyacentes puede ser el factor crítico . Además, las terceras hebras de motivo de purina (que son ricas en G) pueden formar tétradas de G en niveles fisiológicos de K+, que inhiben la formación de triples . Todos estos factores imponen barreras cinéticas a la formación de triples y reducen la estabilidad de los triples una vez formados (la mayoría de los triples, incluso en condiciones óptimas in vitro, son menos estables que el dúplex subyacente .

Estrategias para contrarrestar las limitaciones

El primer y principal problema que se encuentra en la estrategia de antígenos de triple hélice es la inestabilidad de la triplex formada por los TFO en condiciones fisiológicas, lo que limita en consecuencia la utilización de esta estrategia fascinante destinada a la corrección génica en grado variable. Por lo tanto, se han propuesto varios enfoques y estrategias para conferir estabilidad a la estructura de triple hélice formada.

Las hélices triples dirigidas a oligonucleótidos podrían estabilizarse mediante el uso de ligandos de ácido nucleico que estabilizan selectivamente las hélices triples. Por ejemplo, se ha demostrado que el bromuro de etidio se une y estabiliza una triple hélice hecha de poli (dT)·poli (dA)× poli (DT), que contiene solo trillizos T·A×T. Sin embargo, este compuesto estabiliza mal (o incluso desestabiliza) las triples hélices que contienen trillizos de base T·A×T y C·G×C+, probablemente como resultado de la repulsión electrostática . Los derivados del benzopiridoindol fueron las primeras moléculas que estabilizaron fuertemente este último tipo de hélices triples a pesar de que tienen preferencia por estiramientos T·A×T. También se ha demostrado que varios otros intercaladores, así como varios ligandos de ranura menor de ADN, se unen a las hélices triples de ADN. Por ejemplo, las hélices triples se pueden estabilizar mediante la modificación química de oligonucleótidos, como el psoraleno unido a oligonucleótidos que ha demostrado mejorar su actividad biológica después de la irradiación UV . Los intercaladores generalmente estabilizan en mayor medida las hélices triples que contienen trillizos T * A×T, mientras que los ligantes de ranuras menores generalmente desestabilizan los triplejos, excepto en un caso particular donde la triple hélice involucra una hebra de ARN . Debido a que no hay datos estructurales disponibles sobre complejos de triple hélice-ligando, no se sabe mucho sobre las interacciones que dirigen la intercalación específica en las triples hélices. Se ha demostrado que los derivados de BPI se intercalan entre trillizos de base T·A×T por transferencia de energía de fluorescencia de excitación desde trillizos de base a ligandos y por dicroísmo lineal y circular . Se encontró que los oligonucleótidos morfolino paralelos a pirimidina eran capaces de formar un objetivo triplex con duplex. Como era de esperar, este motivo requería un pH bajo para la formación triplex, como lo requiere el fosfodiéster de motivo paralelo a pirimidina TFO. Puede ser posible superar esta dependencia del pH con sustituciones tales como 5-metilcitosina para las citosinas en el TFO .

Un enfoque alternativo por el cual las hélices triples pueden estabilizarse es a través de modificaciones químicas de oligonucleótidos, como la unión covalente de una molécula de acridina . Se ha demostrado que la sustitución de acridina aumenta fuertemente la inhibición de la escisión de la enzima restrictina y también no afecta la especificidad de la secuencia para la formación triplex .

Aplicaciones de ADN de Triple Hélice

La formación de triple hélice de ADN intermolecular ofrece la posibilidad de diseñar compuestos con amplias propiedades de reconocimiento de secuencias, que pueden ser útiles como agentes antígenos o herramientas en biología molecular . Durante la última década, un nuevo enfoque que utiliza análogos de ADN, como agentes terapéuticos, está emergiendo en la química medicinal. Esto se basa en la regulación de la expresión de genes de proteínas/enzimas relacionadas con la enfermedad bloqueando su transcripción (antígeno) o traducción (antisentido) (fig. 4). Se ve afectada a través de la unión de oligonucleótidos complementarios específicos de secuencia a cualquiera de los dos duplex de ADN a través de la formación triplex para inhibir la producción de ARNm o interferir en la traducción de este último a proteínas. Dado que los oligonucleótidos no entran fácilmente en las células y pueden ser destruidos por nucleasas celulares, se están diseñando, sintetizando y evaluando diversos análogos de oligonucleótidos modificados químicamente para su desarrollo como agentes terapéuticos.

El reconocimiento específico de las regiones homopurina-homo pirimidina en el ADN dúplex por oligonucleótidos de formación triple (TFOs) proporciona una estrategia atractiva para la manipulación genética, con el objetivo final de reparar defectos genéticos en células humanas. La capacidad de atacar mutaciones puede resultar útil, como una herramienta para estudiar la reparación del ADN y como una técnica para la terapia génica y la ingeniería genética .

Se desarrollaron herramientas eficientes basadas en hélices triples para diversas aplicaciones bioquímicas, como el desarrollo de nucleasas artificiales altamente específicas. La estrategia antigénica sigue siendo uno de los campos de aplicación triplex más fascinantes para controlar selectivamente la expresión génica (Tabla 1). El objetivo de secuencias genómicas ha demostrado ser un concepto valioso en un número aún limitado de estudios; la mutagénesis local es, en este sentido, una aplicación interesante de oligonucleótidos de formación triple en cultivos celulares .

Table 1: Los estudios de Ácido Nucleico de antígenos en Células Eucarioticas80

Las estrategias de antígenos se centran principalmente en la selección de genes mediante recombinación homóloga o oligodesoxinucleótidos formadores de triple hélice . Por muchas razones técnicas, incluyendo una accesibilidad genética muy limitada dentro de la estructura cromosómica envuelta en proteínas altamente malariacondensada, la aplicación clínica de estos métodos no ha progresado rápidamente. Kielkopf et al han descrito recientemente un enfoque alternativo, utilizando poliamidas que pueden difundirse en el núcleo y reconocer secuencias de ADN específicas . Aunque es muy emocionante, esta metodología todavía está en su infancia y su utilidad clínica final sigue siendo desconocida .

Aplicaciones terapéuticas de la tecnología de antígenos

El ADN de triple hélice ha atraído la atención debido a la posible aplicación de TFOs como agentes terapéuticos, para aplicaciones como la orientación intracelular de genes, como soluciones químicas racionales para secuenciar el reconocimiento específico de un duplex de ADN e identificación de genes responsables del crecimiento celular y la transformación maligna . Con este conocimiento ha surgido un deseo natural de traducir esta información en nuevas estrategias terapéuticas específicas para el tratamiento del cáncer, las enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades comunes de la humanidad (Tabla 2). El reciente desarrollo de un inhibidor bioquímico relativamente específico de la proteína bcr/abl tirosina quinasa en pacientes con leucemia mielógena crónica es un ejemplo impresionante de esta búsqueda . En el caso de las terapias dirigidas directamente a reemplazar, reparar o incapacitar genes causantes de enfermedades, el progreso ha sido mucho más lento y aún no se ha logrado un éxito equivalente al del inhibidor bioquímico bcr/abl. Las razones de esto son complejas y varían según el tipo de terapia dirigida por genes que se utilice .

Tabla 2: Algunas Enfermedades Susceptibles de Tratamiento con Terapias de ADN

Stephenson y Zamecnik mostraron que un oligonucleótido de ADN corto (13 nt) complementario inverso en secuencia (antisentido) al virus del sarcoma Rous podía inhibir la replicación viral en cultivo. Una de las propiedades más importantes de los oligonucleótidos antisentidos y antígenos en su uso terapéutico es su resistencia a las nucleasas. Los oligonucleótidos de fosforotioato son el tipo más común de oligonucleótidos que tienen una resistencia relativamente alta a las nucleasas y se han introducido en el mercado como medicamentos contra la retinitis inducida por citomegalovirus . Los oligonucleótidos con un residuo de ácido nucleico de 2′-O,4′-C – etileno (ENA) en la segunda posición desde el extremo 3′ muestran una resistencia a las nucleasas mucho mayor que aquellos con un residuo de ácido nucleico bloqueado (LNA) en la misma posición .

Aunque Kurreck et al informaron que los oligonucleótidos de ENA eran estables en el suero humano, los oligonucleótidos de ENA parcialmente modificados eran mucho más resistentes a las nucleasas que los oligonucleótidos de ENA en plasma de rata. Además, los oligonucleótidos modificados contiguamente con residuos de ENA en los extremos de 3′ y 5′ muestran más estabilidad que los modificados parcialmente. Por lo tanto, los oligonucleótidos de ENA tienen un alto potencial como agentes antisentidos y antigénicos que se pueden usar in vivo . La formación triplex específica de secuencia se puede aplicar para la orientación génica, el silenciamiento génico y la mutagénesis .

Perspectivas de futuro

Los oligonucleótidos pueden unirse al sitio, específicamente a un gen objetivo de interés mediante la formación de triple hélice. En la actualidad, los oligonucleótidos de formación triple están diseñados para unirse al gen HER-2 (receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano)/ neu, un gen que está sobreexpresado en una amplia variedad de tumores humanos, incluidos el cáncer de pulmón de células no pequeñas, el cáncer de mama, el cáncer de ovario y los tumores gastrointestinales. Esta estrategia será ampliamente aplicable para prevenir la expresión de muchos oncogenes u otros genes relacionados con el cáncer. Estos oligonucleótidos «antígenos» ahora se utilizan para suministrar agentes alquilantes de ADN a bases específicas en el promotor HER-2/neu y la secuencia de codificación, para evitar la iniciación y elongación de la transcripción. En particular, se han utilizado oligonucleótidos de formación triple para suministrar mostaza nitrogenada, como el clorambucilo, a una base de guanina específica en el gen HER-2/neu para prevenir la expresión génica. La estrategia anticancerígena dirigida a objetivos específicos, que incluye oligonucleótidos antigénicos acoplados a fármacos activos de ADN, demostrará ser un hito en el futuro cercano.

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