Fronteras en Farmacología

Introducción

Las proteínas de membrana participan en eventos fisiológicos fundamentales en todos los sistemas biológicos, desde bacterias hasta humanos. > el 50% de los medicamentos comercializados se dirigen a proteínas de membrana, mientras que la orientación farmacológica de muchas otras proteínas de membrana se considera potencialmente beneficiosa en numerosas aplicaciones biomédicas (Overington et al., 2006; Yıldırım et al., 2007; Arinaminpathy et al., 2009). Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a su función y regulación siguen siendo en gran medida desconocidos debido a la falta de información estructural. De hecho, mientras que las proteínas de membrana representan ~26% del proteoma humano, sus estructuras representan solo 2 2% de las estructuras en el Banco de Datos de Proteínas (Fagerberg et al., 2010; Pandey et al., 2016). Varios obstáculos dificultan la investigación estructural de proteínas de membrana, lo que requiere el desarrollo de tecnologías de vanguardia para elucidar sus arquitecturas moleculares (Pandey et al., 2016; Masson et al., 2017; Hagn et al., 2018; Ravula y Ramamoorthy, 2019; Redhair et al., 2019). Los principales obstáculos son que su sobreexpresión y purificación y los estudios estructurales mediante la mayoría de las técnicas (por ejemplo, cristalografía de rayos X) siguen siendo limitados en muchos casos. En consecuencia, estos obstáculos dificultan el desarrollo racional de candidatos a fármacos dirigidos a proteínas de membrana relacionadas con la enfermedad (Vinothkumar y Henderson, 2010; Lounnas et al., 2013; Marciano et al., 2014).

Los transportadores secundarios son proteínas unidas a la membrana que catalizan selectivamente el movimiento de solutos poco permeables (p. ej., iones, neurotransmisores, fármacos) a través de la membrana celular, apoyando diversas funciones celulares en la salud y la enfermedad. Los transportadores secundarios cumplen con el paradigma de acceso alterno, según el cual el bolsillo de unión a ligandos de proteínas se vuelve accesible alternativamente en lados opuestos de la membrana al adoptar los estados orientados hacia adentro (IF) y hacia afuera (OF) en sucesión (Jardetzky, 1966; Forrest et al., 2011). Los avances recientes en la biología estructural de las proteínas de membrana proporcionaron una gran cantidad de estructuras de transportadores unidos a la membrana en diferentes estados conformacionales (Drew y Boudker, 2016; Bai et al., 2017), proporcionando información sobre sus mecanismos de reconocimiento de solutos y transporte. Sin embargo, proporcionan instantáneas estáticas de un proceso inherentemente de varios pasos (Seeger, 2018). Por lo tanto, existe una creciente necesidad de desarrollar nuevos enfoques para investigar la dinámica de las proteínas de membrana (Konermann et al., 2011; Smith et al., 2012; Sim et al., 2017; Mandala et al., 2018; Burke, 2019). Estos incluyen una combinación de simulaciones de dinámica molecular (MD) (Roux et al., 2011; Zdravkovic et al., 2012; Zhekova et al., 2016; Zhekova et al., 2017; Harpole y Delemotte, 2018) con técnicas experimentales avanzadas, incluidas técnicas espectroscópicas y microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (Smith et al., 2012; Pandey et al., 2016; Castell et al., 2018; Hagn et al., 2018; Ravula y Ramamoorthy, 2019; Sun y Gennis, 2019).

La espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) ganó atención en los últimos años para estudiar la dinámica de las proteínas de membrana, a pesar de que se ha utilizado durante décadas para caracterizar proteínas solubles (Konermann et al., 2011; Vadas et al., 2017). HDX-MS monitorea el intercambio dependiente del tiempo del disolvente D2O con hidrógenos de amidas troncales de proteínas en condiciones nativas. El tipo de cambio de deuterio depende de la accesibilidad al disolvente, la estructura secundaria y la rigidez estructural (Konermann et al., 2011). Junto con la digestión proteolítica y la separación de péptidos, HDX-MS permite cuantificar los tipos de cambio en segmentos de proteína cortos, hasta la resolución de residuo único. Dos ventajas principales de HDX-MS son que se requieren pequeñas cantidades de proteínas (< 0,1 mg) para el análisis y que no se requiere el etiquetado químico de proteínas, evitando perturbaciones estructurales no deseadas. A continuación, resumimos los avances y aplicaciones recientes en el uso de HDX-MS para estudiar la dinámica estructural de los transportadores.

Principios de Espectrometría de Masas de Intercambio de hidrógeno-Deuterio

Los principios HDX-MS se describen brevemente y cualitativamente a continuación, para permitir una discusión de sus aplicaciones para el estudio de transportadores. Para explicaciones detalladas, hay disponibles varios artículos de revisión excelentes (Konermann et al., 2011; Rand et al., 2014; Engen y Gales, 2015; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019).

En experimentos con HDX, el deuterio se intercambia con hidrógenos de proteínas lábiles de una manera dependiente del tiempo tras la dilución de proteínas en un tampón D2O (Masson et al., 2017) (Figura 1). HDX-MS monitorea principalmente el intercambio de hidrógenos de amidas troncales ya que i) a pH neutro se intercambian en velocidades que se pueden detectar utilizando HDX-MS (segundos a días) y ii) su intercambio se puede apagar efectivamente (Marcsisin y Engen, 2010; Gallagher y Hudgens, 2016). La velocidad HDX depende de varios parámetros. Los hidrógenos de amida pueden exhibir un «estado cerrado», derivado de la participación en enlaces de hidrógeno estables en estructuras secundarias o de la inaccesibilidad de solventes, que no permite su intercambio con deuterio solvente, o un «estado abierto» donde puede ocurrir la abstracción de protones, el paso limitante de la velocidad de HDX (Oganesyan et al., 2018). Además, la reacción tiene una constante de velocidad química intrínseca, que depende del pH, la temperatura y el entorno de residuos (Oganesyan et al., 2018).

La transición entre los estados cerrado y abierto se produce por eventos de despliegue local. En condiciones nativas, en las que las proteínas están bien plegadas, la tasa de HDX depende principalmente de la tasa de transición de regreso al estado cerrado (Weis et al., 2006). Si la región proteica desplegada regresa al estado cerrado a una velocidad mucho más lenta que la tasa de cambio químico, se observa la cinética EX1, lo que resulta en una absorción correlacionada de deuterio en residuos vecinos. Esto da como resultado dos poblaciones: una con m/z baja y otra con m/z alta, que reflejan péptidos de moléculas de proteínas que no lo han hecho y que han sufrido intercambio, respectivamente. Con el tiempo, la población de m/z alta se vuelve más prominente a expensas de la población de m/z baja. La cinética EX1 se considera rara en proteínas plegadas en condiciones nativas, pero puede inducirse, por ejemplo, mediante la adición de desnaturalizantes (Weis et al., 2006; Oganesyan et al., 2018). Si la proteína vuelve al estado cerrado a una velocidad mucho más rápida que la tasa de cambio químico, se observa la cinética EX2. En este caso, el intercambio depende de la transición de residuos individuales entre el estado abierto y el cerrado, que ocurre de manera no correlacionada. Así, con el tiempo, se observa una sola población con valores de m/z en aumento gradual (Weis et al., 2006).

Después de la deuteración, la reacción se apaga en puntos de tiempo predefinidos cambiando el pH de neutro (7) a pHmin (2,5-3), lo que resulta en una reducción de aproximadamente 10.000 veces en HDX (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Oganesyan et al., 2018); y al reducir la temperatura de 25 a 0°C, lo que lleva a una disminución de aproximadamente 14 veces en HDX (Englander, 2006; Oganesyan et al., 2018). A continuación, la proteína se digiere utilizando una proteasa y los péptidos se separan mediante cromatografía analítica de fase inversa. Actualmente, el principal cuello de botella técnico de los experimentos HDX-MS radica en obtener una alta cobertura de secuencias, limitada por la resistencia a las enzimas digestivas y por condiciones proteolíticas. Finalmente, los péptidos eluidos se identifican utilizando MS y el grado de HDX se calcula en base a los valores de m/z obtenidos. Los detalles experimentales y las trampas de la digestión de proteínas, la separación de péptidos y la identificación de EM están más allá del alcance de esta revisión (Konermann et al., 2011; Masson et al., 2017; Masson et al., 2019).

Estudios de Espectrometría de Masas de Intercambio de hidrógeno-Deuterio de Proteínas de membrana

A pesar de compartir el paradigma de acceso alterno, los cambios conformacionales inducidos por ligandos difieren entre transportadores debido a diferencias en las interacciones ligando-proteína. Por ejemplo, los simportadores (co-transportando dos o más ligandos) pueden transitar entre los estados IF y OF sin ligandos unidos, mientras que la unión de ligandos es obligatoria para el intercambio entre los estados IF y OF en antiportadores (intercambiando ligandos en lados opuestos de la membrana) (Forrest et al., 2011; Drew y Boudker, 2016; Bai et al., 2017).

En general, es difícil detectar cambios dinámicos inducidos por ligandos locales en proteínas. Por ejemplo, las estructuras cristalinas de las proteínas de membrana, tanto en las formas libres de ligandos como unidas a ligandos, no están disponibles con frecuencia, lo que impide la detección de cambios conformacionales inducidos por ligandos, incluso para proteínas con estructuras conocidas. Además, las instantáneas estructurales de alta resolución de los estados apo y ligando pueden no resolver diferencias conformacionales significativas. Sin embargo, se pueden detectar pequeños cambios conformacionales inducidos por ligandos utilizando HDX-MS en subdominios de proteínas específicos en condiciones nativas midiendo la absorción diferencial de deuterio (ΔHDX) en presencia y ausencia de ligandos. Esta capacidad de HDX-MS proporciona oportunidades únicas para abordar los problemas más desafiantes al dilucidar los mecanismos de las interacciones ligando-proteína y proteína-proteína (Rand et al., 2014; Masson et al., 2019; Redhair et al., 2019), como se revisa aquí para una serie de proteínas transportadoras recientemente estudiadas.

Transiciones Conformacionales Subyacentes al Acceso Alterno: El Antiportador Na+ / H+

Las proteínas Nha regulan el pH celular y el volumen en todos los reinos de la vida (Padan y Landau, 2016). El principal modelo estructural utilizado para estudiar los ortólogos de Nha es Escherichia coli NhaA, para el que se dispone de una estructura cristalográfica del estado inactivo a pH ácido (Hunte et al., 2005). Para estudiar la dinámica estructural de NhaA bajo pH fisiológico, se utilizó recientemente HDX-MS (Eisinger et al., 2017). Crucial para los conocimientos obtenidos en este estudio, HDX-MS proporciona datos dinámicos globales, en contraste con los métodos basados en el etiquetado específico del sitio, que solo detectan movimientos de regiones proteicas predefinidas.

En este estudio, se obtuvo una cobertura de secuencia excepcionalmente alta de 88,5% para NhaA en detergente, proporcionando información sobre el mecanismo subyacente al acceso alterno al unirse al ligando. Al comparar los patrones de HDX entre el Nha unido a apo y al sustrato, se observó un patrón recurrente de cambio de HDX en varias hélices, donde el aumento de la captación de deuterio en un terminal se acompañó de una disminución de la captación de deuterio en el otro terminal. La absorción en el centro de las hélices se mantuvo prácticamente inalterada.

Basado en el patrón observado de cambio de HDX, aunque no proporciona directamente información espacial, se sugirió que se produce la traducción de las hélices transmembranas en relación con la membrana, como se refleja en los cambios recíprocos de HDX observados para los dos terminales dentro de hélices transmembranas específicas. Este modelo es consistente con el mecanismo «similar a un elevador» de acceso alterno, lo que implica una traducción vertical de hélices transmembranas durante el ciclo de transporte (Ryan y Vandenberg, 2016). En resumen, HDX-MS proporcionó información novedosa sobre las transiciones estructurales involucradas en el acceso alterno, inalcanzables por las estructuras previamente resueltas del NhaA inactivo.

Efecto de las Interacciones Proteína-Lípidos en los Paisajes de Conformación de los Transportadores

La mayoría de los transportadores secundarios pertenecen a la superfamilia de facilitadores principales (MFS), compartiendo una arquitectura conservada a pesar de sus diversas funciones (Radestock y Forrest, 2011). Aunque las estructuras cristalinas de los miembros de MFS están disponibles, proporcionaron poca información sobre las interacciones entre proteínas y lípidos y su efecto en el equilibrio entre los estados OF y IF. Así, Martens et al. simulaciones combinadas de MD con HDX-MS para estudiar los efectos del entorno lipídico en tres transportadores bien caracterizados: permeasa de lactosa, transportador de xilosa y antiportador de glicerol-3-fosfato (Martens et al., 2018).

En primer lugar, se introdujo una mutación conocida por cambiar el equilibrio hacia el estado de-en el vestíbulo extracelular de todos los transportadores (Kumar et al., 2014). La comparación de los transportadores WT y mutados utilizando HDX-MS reveló que el método detecta el cambio conformacional, con regiones en el vestíbulo extracelular que absorben más deuterio en los mutantes frente al WT, mientras que ocurre lo contrario para los residuos en el vestíbulo intracelular. A continuación, los transportadores se reconstituyeron en nanodiscos compuestos de fosfatidilglicerol, tetraoleil cardiolipina y fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina. Curiosamente, la presencia de fosfatidiletanolamina cambió el equilibrio hacia el estado IF. Posteriormente, simulaciones de MD de los transportadores en bicapas lipídicas idénticas a la composición de los nanodiscos predijeron interacciones directas entre el grupo cabeza de fosfatidiletanolamina cargada y una red citoplasmática conservada de residuos cargados, estabilizando el estado de (Doki et al., 2013). La mutación de los residuos cargados abolió el efecto de la fosfatidiletanolamina, lo que sugiere fuertemente que las interacciones específicas entre fosfatidiletanolamina y proteína controlan el equilibrio intrínseco de los transportadores. Este estudio es un claro ejemplo de combinación de métodos experimentales y computacionales para identificar interacciones sutiles pero funcionalmente significativas entre proteínas y lípidos.

Desenrollado de hélice Durante el Transporte: Estudios de LeuT

LeuT es un homólogo procariótico de la familia de neurotransmisores/simportadores Na+ (NSS), que incluye dianas importantes de fármacos como los transportadores de serotonina, dopamina y noradrenalina (Kristensen et al., 2011). El LeuT fue ampliamente estudiado, y sus estructuras cristalográficas a lo largo del ciclo de transporte están disponibles (Focke et al., 2013). Estas estructuras sugirieron que se requieren reordenamientos estructurales a gran escala durante el acceso alterno (Krishnamurthy y Gouaux, 2012). Sin embargo, el panorama conformacional que permite la transición entre el FI y LOS Estados sigue siendo difícil de alcanzar y controvertido.

Para estudiar la transición entre diferentes estados, se investigó el LeuT detergente solubilizado en condiciones que favorecen el FI o DE los estados (Merkle et al., 2018). Sorprendentemente, muchos péptidos, principalmente en el lado intracelular del transportador, exhibieron cinética EX1. Esto es bastante inusual en proteínas plegadas en condiciones nativas y se considera que refleja un despliegue de larga duración de elementos de estructura secundaria. Basándose en la distribución espacial de los péptidos que exhiben cinética EX1, junto con las estructuras cristalográficas disponibles, se propuso que las hélices específicas sufrieran un desenrollado parcial durante el acceso alterno y que estos cambios conformacionales también contribuyeran a la liberación del sustrato. Este estudio destaca la importancia funcional de los cambios conformacionales lentos (escala de tiempo de segundos) que pueden resolverse bien utilizando HDX-MS, en contraste con otros métodos experimentales o computacionales (por ejemplo, MD).

Espectrometría de Masas de Intercambio de hidrógeno-Deuterio de Proteínas de Membrana en Nanodiscos de Lípidos

Las interacciones de las proteínas de membrana con los lípidos circundantes pueden modular drásticamente su función (Vadas et al., 2017). De hecho, la actividad de los miembros eucariotas del SEN depende significativamente de las interacciones lipídicas-proteicas específicas que modulan la dinámica de las proteínas y, en consecuencia, las interacciones con el sustrato (Divito y Amara, 2009). Por lo tanto, Adhikary et al. se estudió el LeuT reconstituido en nanodiscos de dos capas de fosfolípidos (Adhikary et al., 2017). Utilizando este enfoque, el LeuT se investigó en condiciones que favorecen las conformaciones de SI y DE. La comparación de los patrones de HDX entre estos estados reveló alteraciones específicas en regiones previamente implicadas en el ciclo de transporte, lo que refleja cambios estructurales funcionalmente significativos. Curiosamente, los datos HDX-MS, consistentes con estudios biofísicos y computacionales previos, apoyaron un ángulo de inclinación más pequeño para la primera hélice transmembrana en la conformación IF en comparación con el observado en las estructuras cristalinas. Esta diferencia se atribuyó al ambiente lipídico, ya que la estructura cristalina se obtuvo en detergente con cantidad minúscula de lípidos. En resumen, HDX-MS proporciona una plataforma flexible para estudiar proteínas de membrana en diferentes entornos hidrofóbicos y en condiciones que favorecen estados conformacionales específicos, sin necesidad de etiquetado específico del sitio.

Interacciones Iónicas Con Múltiples Sitios: El intercambiador Na + / Ca2+

NCX participa en la homeostasis celular de Ca2+ extruyendo Ca2 + de las células contra su gradiente electroquímico (Blaustein y Lederer, 1999). Intercambios NCX 3Na+: 1Ca2+, donde Na+ y Ca2+ se transportan en pasos separados (Khananshvili, 1990). Sorprendentemente, la estructura cristalina de NCX de Methanocaldococcus jannaschii (NCX_Mj) reveló cuatro sitios de unión a iones, ocupados simultáneamente por tres iones Na+ en sitios denominados Sint, Smid, Sext y un ion Ca2+ en un sitio denominado SCa (Liao et al., 2012). Dado que este modo de unión era inconsistente con estudios anteriores, se realizaron simulaciones de MD y análisis de flujo iónico de mutantes, lo que sugiere que los iones Na+ ocupan Sint, SCa y Sext, mientras que Ca2+ ocupa SCa (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016b; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). Por lo tanto, los iones Na+ y Ca2+ se unen de manera mutuamente excluyente a lo largo del ciclo de transporte.

Para establecer experimentalmente la asignación de sitios de unión iónica, comparamos el estado apo con los estados unidos a iones de NCX_Mj usando HDX-MS (Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017). A pesar de la baja cobertura de secuencias, nuestro análisis incluyó 10 de los 12 residuos que coordinan los iones. Detectamos una disminución dependiente de Na + en la captación de deuterio en Sint, SCa y Sext, pero no en Smid, mientras que en presencia de Ca2+ la disminución en la captación de deuterio se observó principalmente en SCa. Esto es consistente con las predicciones realizadas por las simulaciones de MD y los análisis mutacionales que prevén la ocupación de Smid por una molécula de agua, pero no por Na+ o Ca2+ en el estado fundamental (Marinelli et al., 2014; Giladi et al., 2016a; Giladi et al., 2017; van Dijk et al., 2018). En particular, los estudios cristalográficos posteriores han validado la asignación de nuestros sitios de unión(Liao et al., 2016). Por lo tanto, HDX-MS corroboró el modo de unión iónica sugerido por los estudios computacionales y funcionales.

Selectividad iónica de un mutante NCX Transportador de Li+

El intercambiador mitocondrial Na+/Ca2+ (NCLX) exhibe una selectividad iónica excepcional, intercambiando Ca2 + con Na+ o Li+, mientras que los NCXs no transportan Li + (Palty et al., 2010). Aunque la relevancia fisiológica de esta selectividad iónica sigue siendo desconcertante, es notable que 9 (de 12) residuos de coordinación iónica en NCLX difieren de los de NCXs y otros miembros de la superfamilia de antiportadores de Ca2+/cationes. Para entender cómo estas diferencias afectan el reconocimiento y transporte de la unión iónica, realizamos un reemplazo basado en la estructura de los residuos que coordinan los iones en NCX_Mj para imitar los sitios de unión NCLX(Refaeli et al., 2016). Sorprendentemente, la construcción de nuevo diseño (denominada NCLX_Mj) media Na+/Ca2+ y Li+/Ca2+ con valores de Km comparables (Refaeli et al., 2016).

A continuación, buscamos determinar si los sitios de unión iónica en NCLX_Mj son reminiscentes de los de NCX_Mj (Giladi et al., 2019). Los análisis HDX-MS de los cambios conformacionales inducidos por iones revelaron que SCa se une a Na+, Li + o Ca2+, mientras que uno o más sitios adicionales de Na+ / Li + de NCLX_Mj son incompatibles con los sitios originales de Na+ (Sext y Sint) asignados a NCX_Mj. Estos resultados sugieren que NCLX_Mj puede transportar iones con una estequiometría electroneutral de 2Na+: 1Ca2+o 2Li+: 1Ca2+. De acuerdo con los datos HDX-MS, la sujeción de voltaje acelera los tipos de cambio Na+/Ca2 + en proteoliposomas reconstituidos con NCX_Mj (debido a una estequiometría de 3Na+:1Ca2+), mientras que no tiene un efecto apreciable en los tipos de cambio Na+/Ca2+ o Li+/Ca2+ en NCLX_Mj (Giladi et al., 2019).

Nuestros estudios han demostrado la utilidad de HDX-MS en la identificación y validación de sitios de unión en transportadores de iones, donde las diferencias relativamente pequeñas en las señales ΔHDX inducidas por iones proporcionan información importante sobre la selectividad iónica y los cambios conformacionales que ocurren al unirse a iones en sitios distintos. Por lo tanto, combinado con simulaciones de MD y cristalografía de rayos X, HDX-MS es especialmente atractivo para elucidar los determinantes estructurales de la selectividad iónica y los cambios conformacionales inducidos por iones en sistemas de transporte iónico que comprenden múltiples sitios de unión iónica.

Conclusiones

En las últimas décadas, la biología estructural ha contribuido enormemente a nuestra comprensión de la función de las proteínas de membrana, principalmente al proporcionar instantáneas estáticas de estados discretos en alta resolución. Para descifrar completamente las relaciones estructura-función subyacentes al complejo proceso de transporte de solutos, se han desarrollado un número creciente de métodos experimentales y computacionales para cerrar la brecha entre estas instantáneas estáticas y determinar los paisajes conformacionales subyacentes. La HDX-MS se usa cada vez más para estudiar proteínas de membrana intactas en diversas condiciones casi nativas, lo que brinda nuevas oportunidades para estudiar las interacciones entre membrana y proteína, el reconocimiento de sustrato y las transiciones conformacionales relacionadas con el transporte. Los desarrollos futuros en instrumentación y automatización de análisis de datos pueden permitir el uso de HDX-MS en alto rendimiento, explotando plenamente su uso potencial en investigación básica y aplicaciones biomédicas, como el diseño de fármacos.

Contribuciones del autor

MG y DK revisaron la literatura y escribieron el manuscrito.

Financiación

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Científica de Israel (Subvención #1351/18) (D. K) y por la Fundación para la Investigación del Cáncer de Israel (Subvención #19202) (MG). Se agradece el apoyo financiero del premio Shmuel Shalit a Dinamarca.

Conflicto de Intereses

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un conflicto de intereses potencial.