Resultados
La hemólisis Inducida por HlyA Requiere la Activación de los Receptores Purinérgicos.
Sobrenadante de los eritrocitos equinos, humanos y murinos de la cepa ARD6 de E. coli productora de α-hemolisina (HlyA) (Fig. 1). La Figura 1 muestra la hemólisis inducida por HlyA en función del tiempo. Experimentos de lapso de tiempo con eritrocitos murinos y humanos unidos a cubreobjetos revelaron que la hemólisis inducida por HlyA es un proceso secuencial. En los primeros 20 minutos, el HlyA indujo la crenación de los glóbulos rojos como resultado de la contracción celular, seguido de un aumento gradual del volumen y, finalmente, de la lisis de las células (Figs. 1A y 1B, Película S1). Esta contracción e hinchazón secuencial también se aplica a nivel unicelular. Por lo tanto, no son diferentes poblaciones de glóbulos rojos las que se encogen o se hinchan, sino que, más bien, un solo eritrocito primero se encoge y luego se hincha como consecuencia de la aplicación de HlyA. La suspensión de eritrocitos (1,25%) se incubó con sobrenadante diluido de E. coli (50 µl · ml−1). Los eritrocitos de las tres especies analizadas mostraron una marcada diferencia en la respuesta a HlyA (Fig. 1C) con la sensibilidad más baja a HlyA en eritrocitos humanos. En todos los experimentos siguientes, la cantidad de sobrenadante de E. coli añadido se ajustó para producir una hemólisis ≈50% después de 60 minutos de incubación.
hemólisis inducida por α-hemolisina en eritrocitos equinos, murinos y humanos. A) Efecto de E. coli que contiene α-hemolisina (ARD6, serotipo OK: K13:H1) sobrenadante en eritrocitos humanos adheridos a un cubreobjetos después de 10, 20 y 60 minutos de incubación a 37 °C (véase también la película S1). B) Datos resumidos. La cantidad total de eritrocitos crenados (columnas abiertas) y eritrocitos lisados (columnas punteadas) a lo largo del tiempo analizados en secuencias de imágenes recogidas durante 60 minutos, a 0,1 Hz (n = 8 humanos). C) La hemólisis general se muestra como un aumento de la densidad óptica a 540 nm (OD540) que refleja la concentración de hemoglobina en la solución. Los eritrocitos se incubaron con sobrenadante de E. coli (50 µl·ml−1) de 0 a 60 minutos. n = 5, 7 y 6 para equinos, murinos y humanos, respectivamente.
Generalmente usamos sobrenadante filtrado de E. coli (ARD6) para inducir hemólisis a menos que se indique lo contrario. Este enfoque se eligió para garantizar que nuestros resultados también se aplicaran in vivo donde HlyA se libera de E. coli junto con varios otros componentes. Al elegir este enfoque, sin embargo, tuvimos que verificar que la hemólisis inducida por E. coli productora de HlyA podría de hecho atribuirse a HlyA. Por lo tanto, purificamos a HlyA de nuestra cultura ARD6. Después de la purificación, se separó una suspensión del HlyA purificado en un gel de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 5-15%. Una sola banda de 100 kDa apareció después de la tinción de Coomassie R, y la espectroscopia de masas identificó la banda como HlyA (Fig. S1 A y B). Como control adicional, utilizamos el sobrenadante de la cepa D2103 de E. coli, una cepa de laboratorio no patológica de E. coli que no produce HlyA. El sobrenadante de estas bacterias no indujo hemólisis en eritrocitos humanos, murinos o equinos (Fig. S1D). Además, comparamos nuestros hallazgos con los de HlyA amablemente proporcionados por el Prof. Sucharit Bhakdi, Universidad de Maguncia, Alemania (con actividad de 10 ng·ml−1 para ≈50% de hemólisis, Fig. S2). A continuación, cuando se menciona HlyA purificado, es con referencia a esta preparación. Durante nuestras pruebas iniciales de la actividad biológica de HlyA, descubrimos que la apirasa eliminadora de ATP inhibía completamente la hemólisis inducida por HlyA de los eritrocitos equinos. Este hallazgo fue realmente sorprendente, ya que implicaba ATP extracelular necesario para la hemólisis infligida por E. coli productora de HlyA. Como el ATP extracelular es una molécula de señalización que activa los receptores P2, nuestros hallazgos podrían sugerir que el modelo de poros prevaleciente para la hemólisis inducida por HlyA podría ser una simplificación. Por lo tanto, probamos el efecto de la eliminación de ATP más a fondo. Encontramos que la apirasa inhibía completamente la hemólisis no solo de los eritrocitos equinos, sino también de los murinos y humanos (Fig. 2A). Además, la hexoquinasa, que degrada rápidamente el trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP), redujo de manera similar la hemólisis inducida por HlyA en los glóbulos rojos de origen murino y humano de manera dependiente de la concentración (Fig. 2B). Este hallazgo fue verificado por HlyA purificado (Fig. 2B, recuadro). Vale la pena notar que, en los eritrocitos humanos, tanto la apirasa como la hexoquinasa potenciaron la hemólisis inducida por HlyA a concentraciones más bajas. La distinción podría sugerir una diferencia en el patrón de expresión del receptor P2 en los glóbulos rojos entre las especies.
La hemólisis de eritrocitos inducida por HlyA es inhibida por las ectoATPasas y el antagonista purinérgico. El sobrenadante de E. coli (60 minutos) induce hemólisis de eritrocitos humanos (cuadrados), murinos (círculos llenos) y equinos (círculos abiertos). A) Curvas de concentración-respuesta para la apirasa eliminadora de ATP. El recuadro muestra una imagen representativa del sobrenadante de eritrocitos murinos sometidos a HlyA en presencia de 0, 1, 2, 5 o 10 U ml−1 de apirasa. B) Efecto de la hexoquinasa en la lisis inducida por HlyA de eritrocitos humanos, murinos y equinos; el recuadro muestra el efecto de la hexoquinasa (10 U ml−1) en la hemólisis inducida por HlyA purificado en eritrocitos murinos y humanos. C) Efecto de los PPAD antagonistas de los receptores P2 no selectivos en la lisis inducida por HlyA de eritrocitos de las tres especies. D) Relación concentración–respuesta de los PPAD a diversas concentraciones de HlyA purificado en eritrocitos humanos. La hemólisis se midió como OD540. Los valores son media ± SEM; n = 5-13.
Para validar la relevancia de este hallazgo, fue importante saber si los antagonistas de los receptores P2 influyeron en la hemólisis inducida por HlyA. El antagonista de los receptores P2 no selectivo PPAD, dependiente de la concentración, disminuyó la hemólisis inducida por E. coli productora de HlyA en eritrocitos equinos, murinos y humanos (Fig. 2C). El valor de CE50 para PPAD fue de 520 µM, 400 µM y 180 µM para eritrocitos humanos, murinos y equinos, respectivamente. Este hallazgo se corroboró para todo el rango de concentraciones de HlyA (Fig. 2D) probado en eritrocitos humanos expuestos a HlyA purificado. La relación concentración-respuesta fue compatible con el antagonismo competitivo, y cabe señalar que el efecto incluso de las concentraciones máximas de toxinas fue reducido por el bloqueador del receptor P2. Por lo tanto, la activación del receptor P2 parece estar involucrada en la hemólisis inducida por HlyA. La suramina, antagonista no selectivo del receptor P2, también disminuyó de forma dependiente de la concentración la hemólisis inducida por HlyA en las tres especies (datos no mostrados). Sin embargo, en concentraciones más altas, la suramina causa una contracción dramática de los eritrocitos y, por lo tanto, puede no ser adecuada para evaluar la implicación del receptor P2 en los eritrocitos.
Para evaluar si el efecto del antagonista purinérgico sobre la hemólisis fue simplemente el resultado de una mayor osmolalidad, probamos el efecto de la sacarosa extracelular sobre la hemólisis inducida por HlyA (datos no mostrados). Sacarosa (1 mm) solo disminuyó ligeramente la hemólisis (5,1% ± 1,7%), mientras que la sacarosa de 10 mm y 75 mM disminuyó notablemente la hemólisis (28.5% ± 5.0%, 82.8% ± 5.2%). Dado que las concentraciones de antagonistas y ATPasas utilizadas en este estudio nunca excedieron de 1 mm, el efecto no puede ser el resultado de un aumento de la osmolaridad. Nuestros resultados tampoco reflejan una unión no selectiva entre los antagonistas y la toxina. Esto se probó en eritrocitos equinos, que se preincubaron con HlyA durante 10-15 minutos a 37 °C o durante 30 minutos a 4 °C, se lavaron a fondo y se volvieron a suspender con o sin antagonistas. Debido a que el HlyA se incorpora a la membrana durante la preincubación, los eritrocitos procedieron a la lisis en ausencia de HlyA libre. Higo. S2 muestra que varias intervenciones farmacológicas redujeron la hemólisis después de que el HlyA se enviara previamente a los eritrocitos. Los antagonistas fueron, sin embargo, menos eficientes cuando se agregaron a eritrocitos lavados en los que el proceso lítico ya se había iniciado.
¿Qué Receptor(es) de P2 Está Implicado en la Hemólisis Inducida por HlyA?
Los eritrocitos expresan varios tipos de receptores P2. Los receptores P2 que se han reportado que se expresan en eritrocitos humanos maduros incluyen P2Y1 (14), P2Y2 (15), P2Y13 (15), P2X1 (15) y P2X7 (16), mientras que P2Y1, P2X1, P2X4 y P2X7 parecen estar presentes en las células progenitoras eritroides (17). Para probar cuál de estos receptores purinérgicos participa en la hemólisis inducida por HlyA, abordamos los receptores en cuestión individualmente. Como el receptor P2Y1 está implicado en la hemólisis inducida por sorbitol de eritrocitos humanos y murinos infectados por plasmodio (14), probamos si este receptor era responsable de la hemólisis inducida por HlyA. El antagonista del receptor P2Y1 MRS2179 no afectó a la hemólisis inducida por HlyA (Fig. S3A) a concentraciones (de hasta 500 µM) superiores a las necesarias para inhibir la hemólisis en eritrocitos infectados por Plasmodium berghei (14). Como no hay antagonistas específicos para los receptores P2Y2, examinamos el efecto de HlyA en ratones transgénicos. La hemólisis inducida por HlyA fue similar en eritrocitos de ratones P2Y2−/− y P2Y2+/+ (Fig. S3B). En el caso del P2Y13, probamos el antagonista MRS2211, que ha mostrado cierta selectividad hacia el receptor P2Y13 (18). MRS2211 disminuyó significativamente la hemólisis inducida por HlyA en eritrocitos humanos y murinos (Fig. S3C). Este hallazgo contradice nuestros resultados con la hexoquinasa (degradando ATP a ADP), que debería estimular en lugar de inhibir el receptor P2Y13 sensible al ADP. Por lo tanto, la hexoquinasa y el MRS2211 deben dar resultados opuestos si el receptor P2Y13 está involucrado. Como este no es el caso, el receptor P2Y13 es un candidato improbable para el receptor P2 involucrado en la hemólisis inducida por HlyA. No podemos excluir la posibilidad de que la inhibición producida por MRS2211 esté mediada por otro receptor P2.
En principio, esto deja que solo se consideren los receptores P2X. Higo. 3A muestra que el bloqueador no selectivo de los receptores P2X Evans blue redujo de manera potente la hemólisis inducida por HlyA, lo que sugiere que un receptor P2X está involucrado en esta hemólisis. De los receptores P2X expresados en eritrocitos, consideramos que el P2X7 es el mediador más probable de la hemólisis inducida por HlyA por las siguientes razones. Se sabe que los receptores P2X7 experimentan una transición a un estado de mayor permeabilidad, que eventualmente conduce a lisis en ciertas células (12). Se ha informado que el receptor P2X7 interactúa con la proteína del canal pannexina1 (12), y el complejo crea un poro permeable considerable a moléculas más grandes como el bromuro de etidio (13). La pannexina 1 se expresa en los glóbulos rojos humanos (19) y recientemente se ha sugerido que es el canal de liberación de ATP en los eritrocitos (20). Para probar si los receptores P2X7 participan en la hemólisis inducida por HlyA, utilizamos antagonistas con relativa selectividad para P2X7: G Azul Brillante (BBG), ATP-2′,3′-dialdehído (OxATP) y KN-62 (21). Todos los antagonistas disminución de la hemólisis de forma dependiente de la concentración en eritrocitos equinos, murinos y humanos (Fig. 3). Los eritrocitos equinos y humanos fueron más sensibles a todas las sustancias analizadas que los eritrocitos murinos. En este contexto, debe mencionarse que se sabe que el receptor murino P2X7 es menos sensible al KN – 62 en comparación con el receptor humano (22). La protección contra la hemólisis por el antagonismo de los receptores P2X se confirmó de nuevo para todo el rango de concentración de HlyA purificado en eritrocitos humanos utilizando BBG como ejemplo de un antagonista P2X7 (Fig. 3D). De nuevo, el antagonista muestra un efecto sustancial sobre la hemólisis inducida por HlyA incluso bajo concentraciones de HlyA que produjeron hemólisis máxima. La inhibición de la hemólisis por OxATP se verificó utilizando HlyA purificado en eritrocitos murinos y humanos (Fig. 3E, recuadro). El nuevo antagonista competitivo selectivo del receptor P2X7 A438079 redujo la hemólisis en los eritrocitos humanos, pero fue menos eficiente en los eritrocitos murinos (Fig. 3F). Los inmunoblots de fracciones de membrana plasmática para el receptor P2X7 confirman que los eritrocitos humanos y murinos expresan una proteína de tamaño relevante (66 kDa, Fig. 3G, y en su totalidad en la Fig. S4B). Se requerirá una investigación adicional para establecer completamente la contribución relativa de los receptores P2X en la hemólisis inducida por HlyA. Con nuestras herramientas actuales, no podemos excluir la posibilidad de contribuciones de otros receptores P2X en la hemólisis inducida por HlyA en ninguna de las especies estudiadas.
Fig. S4A muestra la hemólisis inducida por HlyA en eritrocitos murinos (P2X7+/+ y P2X7−/−). Los eritrocitos murinos muestran un grado similar de hemólisis en respuesta a HlyA independientemente de su genotipo. Los ratones P2X7−/− y los ratones P2X7+/+ fueron generados originalmente por Pfizer y retrocruzados al fondo BALB / c. No detectamos discrepancias entre la sensibilidad a la hemólisis inducida por HlyA en eritrocitos aislados de ratones BALB/c y C57BL/6 (datos no mostrados), a pesar de que se sabe que la cepa C57BL/6 tiene una variación genética en el extremo C del receptor P2X7 (23). Estos datos son consistentes con el efecto minúsculo del A438079 en los eritrocitos murinos y la baja expresión proteica del receptor P2X7 en los eritrocitos murinos (Figs. 3F y 3G).
Estos resultados implican que hay al menos un receptor P2 adicional involucrado en la hemólisis inducida por HlyA en eritrocitos murinos. Como el P2X1 y el P2X7 comparten perfiles de inhibidores similares para BBG, KN – 62 y OxATP (24), probamos los antagonistas del P2X1 MRS2159 y NF449. MRS2159 hemólisis inhibida de forma dependiente de la concentración en eritrocitos de caballo (CE50: 150 µM) y ratón (CE50: ≈250 µM). Los eritrocitos humanos eran relativamente insensibles al antagonista, pero a una concentración superior a 250 µM, vimos una reducción pequeña y estadísticamente significativa (Fig. 4A). Este efecto era mucho más pronunciado si se utilizaba HlyA purificado (Fig. 4C). Esto implica que puede haber diferencias en la respuesta celular con respecto a si se someten a HlyA en forma pura o en combinación con otros constituyentes de E. coli. NF449 inhibe de forma dependiente de la concentración la hemólisis inducida por HlyA en humanos (Fig. 4B). NF449 fue mucho menos eficiente en eritrocitos murinos, de acuerdo con que el receptor murino P2X1 es relativamente resistente a este inhibidor (25). Se debe enfatizar que a pesar de que NF449 es un derivado de la suramina, no provocó los mismos cambios de volumen en los eritrocitos que la suramina. Se sabe que los inmunoblots del receptor P2X1 muestran hasta 4 bandas en varios tejidos; una banda no glicosilada de 45 kDa, una banda glicosilada de 60 kDa y una banda de 95/120 kDa que podría ser la forma polimerizada del receptor (26, 27). En nuestras manos, el anticuerpo receptor P2X1 reconoció consistentemente una banda de 45 KD y una banda muy débil de 60 kDa en manchas de membranas plasmáticas de eritrocitos murinos y humanos (Fig. 4D). Curiosamente, encontramos que el nivel de expresión de la banda de 60 kDa era mucho mayor en los ratones P2X7−/− en comparación con los controles (similar en tres preparaciones, Fig. 4D). En este inmunoblot, los niveles de proteína se ajustan para evitar la sobrecarga de las bandas de los ratones P2X7−/−, lo que deja la banda de 60 kDa casi indetectable en los ratones P2X7+/+. Esta aparente regulación ascendente del receptor P2X1 podría ocultar potencialmente un fenotipo hemolítico en ratones deficientes en el receptor P2X7. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la hipótesis de que tanto el receptor P2X1 como el P2X7 son relevantes para la hemólisis inducida por HlyA. Nuestros resultados apuntan a variaciones significativas entre especies, en las que el receptor P2X7 es más importante para la hemólisis en eritrocitos humanos.
Efecto de los antagonistas P2X1 (MRS2159 y NF449) sobre la hemólisis inducida por HlyA en eritrocitos equinos, murinos y humanos. A) Se incubaron eritrocitos con sobrenadante de E. coli que contenía HlyA y concentraciones crecientes de MRS2159 (media ± SEM, n = 7-8). B) Se incubaron eritrocitos con HlyA purificado y concentraciones crecientes de NF449 (media ± SEM, n = 5-6). C) Efecto de 250 µM MRS2159 en hemólisis inducida por HlyA purificado. D) Inmunoblot con un anticuerpo dirigido contra el receptor P2X1 (diluido 1:200); el panel derecho muestra una mancha paralela con preadsorción de péptidos. El aislamiento de proteínas y el inmunoblot se repitieron tres veces, con resultados similares.
La Hemólisis Inducida por HlyA Se Previene con Antagonistas de la Pannexina 1.
Se han utilizado carbenoxolona (28), mefloquina y probenecid (30) como antagonistas con relativa selectividad para la pannexina1. La carbenoxolona disminuyó significativamente el nivel de hemólisis en las tres especies con sensibilidad similar (Fig. 5A). El efecto de la carbenoxolona se probó de nuevo para todo el rango de concentraciones de HlyA (toxina purificada, Fig. 5B), que también muestra efectos considerables bajo concentraciones máximas de HlyA. La mefloquina y el probenecida se probaron solo en eritrocitos murinos y humanos. La CE50 para la mefloquina fue de 25 µM en los eritrocitos humanos y de 18 µM en los murinos. Probenecid inhibió la hemólisis en eritrocitos humanos, con una CE50 de 2 mm, pero fue menos eficaz en eritocitos murinos. Recientemente, los conocidos antagonistas del canal Cl–NPPB y ácido niflúmico también han demostrado inhibir los canales de pannexina (31). Ambas sustancias redujeron la hemólisis inducida por HlyA, con un efecto sustancialmente más pronunciado en los eritrocitos humanos (Fig. S5).