DISCUSIÓN
Nuestros resultados muestran que, mediante una cuidadosa planificación, capacitación y estandarización de reactivos y protocolos, una red transnacional de laboratorios tiene la capacidad de producir resultados de ensayos de IAH consistentes y comparables. Los cinco laboratorios académicos y de salud pública que participaron en este estudio formaron parte de PCIRN, que se desarrolló para aumentar la capacidad nacional de Canadá para apoyar la investigación de vacunas y otros tipos de influenza en caso de una pandemia. En una situación de pandemia, con pruebas de influenza de gran volumen, alta presión y geográficamente dispersas, la estandarización del ensayo de IAH será de suma importancia para garantizar la comparabilidad de los resultados entre laboratorios. Los laboratorios de PCIRN mostraron un alto nivel de reproducibilidad dentro del laboratorio, con una precisión del 99,8% de los duplicados (99.entre el 2% y el 100% por laboratorio), el 97,8% de los títulos en un intervalo de 2 veces en días de ensayo repetidos (entre el 93,3% y el 100% por laboratorio) y el 91,1% de los sueros de ensayo que muestran reproducibilidad de los títulos en cada repetición del protocolo de seis ensayos (entre el 60% y el 100% por laboratorio). La reproducibilidad entre laboratorios también fue alta, con valores medios de todas las réplicas de los cuatro laboratorios no de referencia dentro de 2 veces el laboratorio de referencia para el 100% de los sueros analizados. Por laboratorio, los títulos de 94,3% y 98%.el 9% de las muestras se cuantificó en una única dilución del laboratorio de referencia y de los títulos de consenso, respectivamente (intervalos, del 85% al 100% y del 95% al 100%). Estos porcentajes cumplen los umbrales de aceptabilidad típicos para la variabilidad de los ensayos de HAI (es decir, al menos el 80% de las muestras se encuentran dentro de 1 dilución de los valores nominales y/o GMT de todos los ensayos ). La especificidad del ensayo de IAH (100%) y la sensibilidad (87,5% a 100%) en todos los laboratorios de PCIRN estuvieron igualmente bien dentro de los criterios de aceptación de estudios previos (p.ej., el 100% de las muestras negativas deben cuantificarse por debajo de los niveles de cuantificación, y al menos el 80% de las muestras positivas deben cuantificarse como positivas ).
Para el componente intralaboratorio de la variabilidad de los ensayos de IAH, la repetibilidad dentro de los laboratorios de PCIRN parece similar a la mostrada en otros estudios (5, 22). Una advertencia de estos estudios previos fue que no se examinaron más de tres repeticiones, a pesar de las prácticas comunes de validación de ensayos inmunitarios de examinar seis o más ensayos repetidos (24-27). Como tal, no está claro si sus datos son directamente comparables a los resultados determinados en seis ensayos de este estudio. Sin embargo, nuestro hallazgo de 0% a 6,7% (mediana, 0%) de ensayos con resultados que difieren en más de 2 veces de los de otras repeticiones de ensayos parece comparable al 4,8% a 7,1% observado anteriormente en un laboratorio (22) y al 0% a 15% (mediana, 2%) en nueve laboratorios (5).
Nuestros hallazgos de alta reproducibilidad de títulos de HAI entre laboratorios de PCIRN geográficamente dispersos contrastan con informes anteriores que muestran una variabilidad sustancial entre los laboratorios internacionales que realizan este ensayo (5, 6, 9-12). Por ejemplo, los datos de un gran estudio colaborativo (11 laboratorios) encontraron VGC por muestra que oscilaban entre 84% y 803% (mediana de VGC por virus de 138%, 155% y 261% ). Otros estudios informaron VGC para muestras de H1N1 y H5N1 que abarcaron de 95 a 345% (11) y de 22 a 582% (6), y los GMT diferieron entre laboratorios hasta 80 veces (11) o 128 veces (9). Si bien los informes anteriores a menudo incluyeron un mayor número de laboratorios participantes que el estudio actual, incluso cuando solo seis laboratorios aportaron datos, la mediana del GCV interlaboratorio fue del 83% para cinco muestras de H1N1, y el 80% de ellas superó una diferencia de 4 veces entre laboratorios (11). Por el contrario, el estudio actual mostró una mediana de VGC por virus de solo 39% y 17%, con un 95% de las muestras dentro de una diferencia de 4 veces entre los laboratorios. Una muestra superó la diferencia de 4 veces; el título no era cuantificable para esta muestra en un laboratorio, por lo que se asignó el valor más bajo en lugar de medirlo. Si esa muestra se omitiera de los análisis, el GCV máximo sería de 75,5%, lo que representaría un valor inferior al GCV mínimo en otros estudios. Aunque esa muestra mostró una mayor variabilidad que otras, este rango de medición bajo parecía en general menos preciso que los rangos más altos. Por ejemplo, el VGC varió de 43,4% a 156,4% en títulos entre 10 y 80 en comparación con 11,1% a 53,1% en títulos más altos (Fig. 3). También se ha descrito anteriormente una mayor variabilidad con muestras con títulos más bajos (23) y probablemente contribuyó a clasificaciones de seroprotección incongruentes en el estudio actual para las tres muestras de H1N1 con títulos más cercanos al umbral de 40 (títulos de consenso de 22, 24 y 43). A pesar de ello, la precisión diagnóstica de la seroprotección en los laboratorios de los NCIRP se mantuvo alta en general (93,6% cuando se utilizaron títulos consensuados para definir la seroprotección y 89,5% en comparación con los valores de laboratorio de referencia).
El alto grado de concordancia de los títulos de IAH interlaboratorios en los laboratorios de NCIRP puede estar relacionado con la cuidadosa armonización de los procedimientos de ensayo de IAH y los reactivos en todo el NCIRP. Los participantes en estudios previos que mostraron una alta variabilidad interlaboratorios generalmente utilizaron métodos de ensayo de IAH que variaron entre laboratorios. Las variables de ensayo que se cree que contribuyen a la variabilidad de los resultados incluyen la cantidad de virus añadido, el sistema de cultivo viral (p. ej., huevos de gallina embrionados frente al cultivo de tejidos), la duración del tratamiento de RDE, la dilución sérica inicial, el tipo y la edad de los glóbulos rojos utilizados y el tiempo permitido para la sedimentación de glóbulos rojos (5, 11, 12). Sorprendentemente, sin embargo, cuando Wood et al. proporcionaron a los participantes en laboratorios comerciales y públicos que participaban en las pruebas de vacunas contra la gripe estacional en Europa un procedimiento operativo estándar detallado a seguir y reactivos/materiales comunes, informaron de que la variación entre laboratorios no mejoró significativamente (10). Los autores especularon que las persistentes «variaciones técnicas locales», así como los diferentes proveedores de glóbulos rojos, podrían haber afectado la reproducibilidad entre laboratorios, pero señalaron que una mayor estandarización estaba más allá de los límites de viabilidad para su estudio. Publicaciones posteriores interpretaron estos hallazgos como una indicación de que la estandarización de los ensayos de HAI entre laboratorios no es, en general, un enfoque viable para armonizar los resultados de HAI entre diferentes laboratorios (8, 12), y al menos un grupo ha tratado de desarrollar un ensayo de HAI modificado y más robusto para generar datos más fiables y reproducibles (22).
En el presente estudio, los laboratorios de PCIRN se adhirieron estrictamente al protocolo estándar de ensayo de IAH de la Organización Mundial de la Salud, disponible públicamente, en el que los puntos sujetos a variaciones técnicas o interpretativas se armonizaron entre los laboratorios antes del inicio del estudio. Los reactivos clave (por ejemplo, RDE, RBC, existencias de virus) se obtuvieron de los mismos proveedores en la medida de lo posible. Además, la restricción de las pruebas a un solo tecnólogo en cada sitio de prueba permitió una mayor estandarización. El posible efecto del uso de personal múltiple en cada laboratorio no se evaluó en este estudio. Si bien el uso de múltiples operadores podría aumentar la variabilidad, el único estudio que examinó esta posibilidad para las pruebas de IAH no mostró ninguna diferencia significativa entre los resultados de dos operadores en el mismo laboratorio (22).
Las posibles variaciones entre laboratorios en las cepas virales cultivadas para su uso en el ensayo se minimizaron entre los laboratorios de PCIRN utilizando existencias de semillas virales de una sola fuente que se cultivaron en la misma línea celular en condiciones similares en todos los laboratorios. Especulamos que la reproducibilidad interlaboratorios podría mejorar aún más si se produjeran existencias de trabajo virales de forma centralizada y se distribuyeran a los laboratorios participantes. La importancia de las variaciones de la cepa viral para los títulos de los criterios de valoración de HAI está bien ilustrada por los títulos de 2 a 3 veces más bajos demostrados en un estudio cuando el ensayo de HAI utilizó una cepa A/Cal pH1N1 en comparación con el reordenador X179A que aún poseía hemaglutininas y neuraminidasas equivalentes (11). Desafortunadamente, las existencias no se secuenciaron como parte de este estudio, por lo que no podemos verificar que todos los laboratorios utilizaran virus con secuencias idénticas de hemaglutinina. Incluso si la propagación local de cepas de virus hubiera introducido pequeñas variaciones de secuencia, la variabilidad entre laboratorios en este estudio fue pequeña, por lo que es difícil imaginar cómo el uso de cepas con secuencias de HA idénticas podría reducir aún más la variabilidad. Aunque las diferencias no superaron el doble en este pequeño conjunto de muestras, las pequeñas variaciones en la secuencia de HA introducidas por la propagación local de cepas virales podrían ser una posible explicación de las tendencias a la subestimación de los títulos H1N1 y la sobreestimación de los títulos H3N2.
Varios estudios han reportado una reducción de la variabilidad interlaboratoria en los títulos de IAH al calibrar los resultados en comparación con las normas internacionales (6, 11-13); sin embargo, tales normas no existen para las cepas actuales del virus de la influenza estacional B y la influenza A H3N2, y la deriva antigénica constante de las cepas estacionales que impulsan la reformulación anual de las vacunas bien puede requerir el desarrollo y validación continuos de nuevas normas. En este estudio, la comparabilidad entre laboratorios parece superior a la lograda mediante el uso incluso de los estándares de calibración más eficaces. Por ejemplo, después de la calibración con IS 09/194, Wood et al. (11) informaron de que las diferencias máximas entre los GMT en diferentes laboratorios disminuyeron de 80 a 64 veces (es decir, un valor todavía considerablemente mayor que el máximo de 11 veces en el estudio actual) y que los rangos de GCV entre laboratorios disminuyeron de 95% a 345% (mediana, 105%) a 34% a 231% (mediana, 109%), es decir, muy por encima del rango de 0% a 156% (mediana, 27%) observado en este estudio. De manera similar, el uso de reemplazo ES 10/202 disminuyó el GCV entre laboratorios de un rango de 108% a 157% a un rango de 24% a 144% en cinco muestras y las diferencias máximas entre laboratorios de 43 a 21 veces (13), y, utilizando el estándar 07/150, Stephenson et al. (6) se redujo la mediana del VGC de 15 muestras del clado 1 NIBRG-14 H5N1 del 125% (rango, 31% a 582%) al 61% (34% a 535%).
Si bien no se puede determinar la(s) razón (s) exacta (s) del alto nivel de acuerdo entre los laboratorios del PCIRN en comparación con estudios anteriores, nuestro éxito se vio facilitado por el incentivo que tuvimos como red nacional para trabajar hacia el objetivo común de establecer procesos reproducibles. La armonización detallada y rigurosa de procesos y reactivos entre sitios es quizás el único aspecto «nuevo» que aportamos a este estudio, en comparación con el cuerpo de literatura de larga data que muestra una pobre reproducibilidad de los IAH entre laboratorios. Sin embargo, nuestros datos sugieren que, con una cuidadosa estandarización, las variaciones interlaboratorios en los títulos de IAH pueden reducirse a niveles similares a los observados en laboratorios individuales. Los próximos pasos posibles para reducir al mínimo las variaciones en los títulos de HAI en los laboratorios de todo el mundo serían la movilización de redes/consorcios, la aplicación de directrices y/o requisitos reglamentarios para el uso de procedimientos y reactivos normalizados, la capacitación normalizada para garantizar la reproducibilidad y la prestación de apoyo y/o incentivos para que los laboratorios adopten el concepto de «normalización».