Las células T humanas expresan CD25 y Foxp3 al activarse y exhiben fenotipos efectores/de memoria sin ninguna función reguladora/supresora

La activación de células T induce la expresión de CD25 y Foxp3 asociada con la diferenciación de fenotipos efectores y de memoria

Los PBMC fueron estimulados con briostatina-1 (5 nM) e ionomicina (1 µM) (B/I) en presencia de 80 U/ml de IL-2 (Peprotech) durante 16 h. La activación B / I imita las señales intracelulares que resultan en la activación de las células T al aumentar la actividad de la proteína quinasa C y el calcio intracelular, respectivamente . Las células se lavaron tres veces y se cultivaron a 106 células/ml en medio completo con 40 U/ml de IL-2 (Peprotech) durante 3 días y se determinó la expresión de Foxp3 mediante análisis de citometría de flujo. La expresión de FoxP3 también se determinó en células T recién aisladas el día 0. Como se muestra en la Fig. 1A (panel superior), la presencia de IL-2 sola durante 3 días no aumentó notablemente la expresión de Foxp3 o CD25 por encima de los niveles basales en el día 0 (Fig. 1C). Sin embargo, la activación B/I indujo la expresión de Foxp3 y CD25 en células T CD4+ y CD8+ (Fig. 1A, panel central). Tras la activación B / I, las células T CD4+CD25+Foxp3 + se incrementaron del 1% al 23% (P = 0,016) y las células T CD8+CD25+Foxp3+ se incrementaron del 0,6% al 9% (P = 0,013). La extensión del cultivo en presencia de IL-2 durante 6 días sin estimulación adicional mantuvo las células T CD4+CD25+Foxp3+ por encima de los niveles basales en células T no activadas (1% vs.7%; P = 0,031), mientras que las células T CD8+CD25+Foxp3+ disminuyeron a los niveles basales (0,6%). Estos resultados sugieren que la expresión inducida por activación de Foxp3 en las células T CD4+CD25+ es más estable que en las células T CD8+CD25+. El número absoluto de células T aumentó 3 y 6 días después de la estimulación y expansión B/I en presencia de IL-2 (Fig. 1B). La activación de las células T por medio de Abs anti-CD3/CD28 durante 3 días produjo resultados similares a los de la activación B / I al aumentar las células T CD4+CD25+FoxP3 + de 0,4% a 8,7% (Fig. 1C). Los análisis de fenotipos de células T revelaron fenotipos de memoria CD44+ y CD44 + CD62L + antes y 6 días después de la activación B/I (Fig. 1D, panel superior). Mientras que las células T efectoras CD4 + y CD8 + se redujeron después de la activación (18% a 9% y 21% a 13%, respectivamente), las células T CD4+ y CD8+ de memoria se incrementaron (82% a 91% y 79% a 87%, respectivamente). Tras la activación B / I, las células T CD4 + mostraron un aumento de 6 veces de la expresión de FoxP3 en fenotipos CD44+, CD62L+ (CD44+: 2,6% a 15%; CD62L+: 2% a 12%). Además, las células T CD4+ y CD8+ mostraron una alta expresión de FoxP3 tras la activación en comparación con la expresión de FoxP3 baja el día 0 (Fig. Paneles 1D, medio e inferior). Todas las células T CD4+Foxp3 + expresaron CD44, de las cuales el 80% también expresaron CD62L (Fig. 1D, panel central, extremo derecho). Estos datos muestran que el 20% de las células T CD4+Foxp3+ son efectoras y el 80% son fenotipos de memoria. Se detectó una tendencia fenotípica similar para las células T CD8 + Foxp3+, mostrando el 100% de las células CD44+, de las cuales el 67% eran células T CD62L+ (Fig. 1D, panel inferior, extremo derecho). Estos resultados muestran que el 33% de las células T CD8+Foxp3+ son efectoras y el 67% son fenotipos de memoria. Datos presentados en las Figs. El 1A-D sugiere que el aumento de la expresión de FoxP3high en los linfocitos T efectores se debió a la diferenciación celular en lugar de a la proliferación celular, porque el porcentaje relativo de linfocitos T efectores CD44+CD62L disminuyó después de la activación B/I. Mecanismo similar puede existir en las células T de memoria debido a la expresión de FoxP3high después de la activación en comparación con FoxP3low en el día 0.

La expresión de FoxP3 inducida por activación en células T CD4+ no logra transmitir la función reguladora in vitro

Las células T se marcaron con CFSE y se estimularon con Abs anti-CD3 (1 ug/ml) y anti-CD28 (1 ug/ml) en presencia o ausencia del CD4+CD25 activado por B / I+FoxP3+ células T (proporciones de respuesta:supresor 2:1 y 20:1) durante 3 días. El análisis de citometría de flujo mostró tasas similares de proliferación de células T CD8+ activadas en ausencia o presencia de células T FoxP3+ inducibles (Fig. 2A, 60% vs. 61% y 65%). La activación de CD3/CD28 también indujo la expresión de FoxP3 en células T CD4+ respondedoras. Las células T CD4+FpxP3 + cerradas también mostraron una proliferación del 70-75% tras la activación (Fig. 2A). El análisis de la apoptosis de células T reveló tasas similares de apoptosis en células T respondedoras en ausencia o presencia de células T CD4 + FoxP3 +(Fig. 2B, 57% vs 57 y 59%). Se encontró que la mayoría de las células T CD4+FoxP3+ activadas por B/I (74-76%) eran apoptóticas durante la activación anti-CD3/CD28 en cultivos conjuntos con células T respondedoras.

La activación alogénica de células T durante MLR induce la expresión de Foxp3 en células T CD4+CD25+ asociadas con fenotipo efector/memoria

Realizamos una MLR alogénica de 8 días para determinar si la inducción de la expresión de Foxp3 en células T fue estable durante MLR y si dicha expresión inducida de Foxp3+ podría inhibir Proliferación de células T. Se obtuvieron células respondedoras y estimuladoras de diferentes donantes sanos. Se irradiaron células estimuladoras (5000 rad) y se cultivaron con células respondedoras durante 8 días en presencia de 10 µM de BrdU (BD Pharmingen). Las células fueron teñidas con Abs relevantes y sometidas a análisis de citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 3A (panel superior) El 86% de las células T CD4+CD25+ y el 93% de las células T CD8+CD25+ mostraron incorporación de BrdU como resultado de la proliferación celular. No se detectó proliferación en las células respondedoras o estimuladoras solas (datos no mostrados). Dicha proliferación alogénica tuvo lugar en presencia de una expresión de Foxp3 inducida por activación en células T CD4+, de modo que el 8% de las células T CD4+ eran CD25+Foxp3+ (Fig. 3A, panel inferior). Las células T CD8+CD25+, por otro lado, no mostraron una expresión estable de Foxp3. Estos resultados son consistentes con nuestra observación en la Fig. 1 muestra que la expresión de Foxp3 en las células T CD4+ es más estable que la de las células T CD8+ 6-8 días después de la activación de las células T. En informes anteriores, se realizaron ensayos supresores in vitro en presencia de altas proporciones de células T CD4+CD25 + (Tregs) a células respondedoras, para determinar la función supresora en la activación y proliferación de células T. Tales aumentos artificiales en la proporción de células T CD4+CD25+ con respecto a las células respondedoras reducirían la validez in vivo de la observación. La frecuencia de células T CD4+CD25+Foxp3+ inducidas durante la MLR fue del 8%, lo que se considera dentro del rango fisiológicamente relevante según lo informado por otros grupos . La frecuencia de Tregs naturales en ratones también está alrededor de este rango, pero tiene efectos reguladores para la inhibición de la autoinmunidad. Si Foxp3 expresaba células T CD4+ y tenía alguna función reguladora, debería haber inhibido la proliferación celular durante el cultivo in vitro. De forma similar a la activación de células T inducida por B/I, los fenotipos de células T en una RML incluyeron células T de memoria CD44+ (16%) y CD44+CD62L+ (84%) (Fig. 3B). De nuevo, todas las células T CD4+Foxp3+ expresaron CD44, de las cuales el 90% también expresaron CD62L (Fig. 2B). Estos datos muestran que el 10% de las células T CD4+Foxp3+ son efectoras y el 90% son fenotipos de memoria. Se detectó una tendencia fenotípica similar para las células T CD8 + Foxp3+, mostrando el 100% de las células CD44+, de las cuales el 76% eran células T CD62L+. Estos resultados muestran que el 24% de las células T CD8+Foxp3+ son efectoras y el 76% son fenotipos de memoria. La falta de función reguladora en estas células T de Foxp3+ puede deberse a su fenotipo efector/memoria, ya que se ha informado de que la expresión de Foxp3 en las células T de memoria humana resultó en una disminución de la actividad supresora . Además, las células Treg tipo 1 (Tr1) confieren función supresora en ausencia de expresión de FoxP3 . Dado el papel de Foxp3 como regulador maestro del compromiso y mantenimiento del linaje Treg en ratones , no parece tener tal función reguladora de buena fe para el compromiso del linaje Treg en células T humanas.