Las escalas de contractilidad de actomiosina con elongación mioblástica y mejora la diferenciación a través de la exportación nuclear de YAP

Los mioblastos adoptan una forma alargada para diferenciar y regular su red de actina al área de propagación

Para evaluar la relación entre la forma celular, la red de actina y las adherencias focales, cultivamos mioblastos C2C12 en una capa homogénea de fibronectina (FN). Después de 24 horas de cultivo, los mioblastos se fijaron y teñieron de actina para determinar sus parámetros morfológicos (Fig. 1A). Los sustratos recubiertos de FN permitieron establecer interacciones específicas entre células y sustratos reclutando integrinas transmembranas específicas. De hecho, varias subunidades de integrinas α que se combinan con la subunidad β1 se expresan durante la miogénesis esquelética, siendo importantes en la migración celular miogénica, la fusión de mioblastos,la maduración de la fibra muscular o el mantenimiento de la integridad muscular32, 33. Experimentos adicionales realizados en sustratos recubiertos de laminina(LAM) indicaron que ambos parámetros morfológicos (índice de forma celular, perímetro celular y área celular, Suplemento Fig. 1A) e interacciones célula-sustrato (número y área de adherencias focales, Suplementarias Fig. 1B) fueron estadísticamente similares en FN y LAM, validando el revestimiento de FN para estudiar in vitro las morfologías de los mioblastos C2C12 durante el proceso de fusión/diferenciación.

Cuantificamos el índice de forma celular (CSI) que caracterizó la morfología de los mioblastos dando información sobre la elongación celular. Las células redondeadas tienen un CSI cercano a 1, mientras que las células alargadas tienen un CSI cercano a 0. Encontramos CSI de 0,1 a 0,8 con un valor medio de 0.37 ± 0,15 (n = 101), lo que sugiere una gran variabilidad en las morfologías celulares (Fig. 1B). Los mioblastos exhibieron un perímetro medio de 259 ± 82 µm (Fig. 1C, n = 101) y una amplia gama de áreas de esparcimiento (de ~1000 a ~4000 µm2), con un valor medio de 2057 ± 618 µm2 (Fig. 1D, n = 101). Estos hallazgos obtenidos en los mioblastos C2C12 se reforzaron mediante la realización de mediciones morfológicas adicionales (ICS, perímetro celular y área celular) en los mioblastos humanos primarios (16UBic, Suplemento Fig. 2A) que provienen de los bíceps de un paciente no afectado por la FSHD (p. ej. que se ha confirmado que carecen de una deleción de 4qA). Como se muestra en la Fig. 2B-D, nuestros resultados demuestran que el CSI de los mioblastos 16úbicos varió de 0,14 a 0,86 con un valor medio de 0,44 ± 0,17 (n = 90), lo que sugiere una gran variabilidad en las morfologías celulares de los mioblastos humanos, como se observó para las células C2C12. En conjunto, nuestros resultados demuestran que la variabilidad de las morfologías celulares no depende del tipo de célula ni de ningún artefacto del cultivo celular.

A continuación estudiamos la distribución de filamentos de actina en una población de mioblastos C2C12 para comprender si las áreas de propagación de la variabilidad pueden modular el citoesqueleto de actina. Nuestros hallazgos mostraron que la intensidad de fluorescencia total de la red de actina F estaba relacionada linealmente con el área celular (Fig. 1E, n = 31, R2 = 0,748), lo que sugiere que cuanto mayor es la extensión de mioblastos, más filamentos de actina se forman. Como se muestra en la Fig. 3, a continuación caracterizamos la distribución de adherencias contenidas en vinculinas para determinar cómo las variaciones de la forma celular afectan las interacciones célula-sustrato en los mioblastos C2C12. Encontramos que el área total de adherencias de sustrato celular por célula aumentó con el área celular (Fig. 1F, n = 31, R2 = 0,783) y con la intensidad de fluorescencia de la actina F (Fig. 1G). Nuestros resultados indican que los mioblastos C2C12 asumen una variedad de formas celulares y áreas de diseminación, pero a su vez adaptan la cantidad de filamentos de actina y adherencias de vinculinas a su diseminación. Para obtener más información sobre el papel de la forma celular en la diferenciación de mioblastos, a continuación consideramos la evolución de la relación de aspecto celular durante las etapas de proliferación (P0 a las 6 horas y P2 a las 48 horas) y diferenciación (D2 a las 96 horas) (Fig. 1H). Como se muestra en la Fig. 1I, J, nuestros hallazgos muestran que los mioblastos aumentaron su relación de aspecto de 0,40 ± 0,16 (P0) a 0,36 ± 0,09 (P2) y 0,24 ± 0,07 (D2), lo que sugiere que los mioblastos se alargan significativamente y adoptan una relación de aspecto de 1:4 para diferenciarse. Además, nuestros resultados indicaron que las fibras de estrés de actina estaban altamente orientadas a D2 (Suplemento Fig. 4A, B), correspondiente también a elongaciones nucleares significativas (Fig. 4C). En conjunto, nuestros hallazgos muestran que la red de actina F está modulada por modificaciones de la morfología de los mioblastos e indican que la diferenciación de los mioblastos requería elongación celular hasta una relación de aspecto de 1:4.

La organización espacial de la red de actinas y el núcleo está dirigida por la morfología de los mioblastos

Controlamos la variabilidad intrínseca de las morfologías de los mioblastos mediante el uso de micropatrones adhesivos para estandarizar sus áreas de expansión y controlar sus formas. Mediante el uso de una técnica de impresión de microcontacto20, creamos micropatterns adhesivos de fibronectina (FN) con un área constante de 1600 µm2 y diferentes geometrías. Hemos utilizado redondeado (CSI = 1), cuadrado (CSI = 0.79), triangular (CSI = 0,60) y diferentes relaciones de aspecto rectangular (CSI = 0.50 y 0,34 para 1:4 y 1:7 relaciones de aspecto, respectivamente) Micropatterns FN a mioblastos individuales de cultivo (Fig. 2A). Estas diferentes geometrías de micropatterns permitieron estandarizar in vitro la forma de mioblasto en un amplio rango y controlar su área de expansión.

Para determinar cuantitativamente el papel de la geometría celular en la organización espacial del citoesqueleto de actina, determinamos la orientación de los filamentos de actina para cada forma celular34,35. Los filamentos de actina teñidos con faloidina se codificaron por colores en función de su orientación con un gradiente de color que oscilaba entre azul claro cuando los filamentos de actina se organizaban paralelos (0°) al eje horizontal y rojo (+90°) o naranja (-90°) para los organizados perpendicularmente al eje horizontal (Fig. 2B). Observamos que los filamentos de actina en células redondeadas se distribuyeron aleatoriamente, con orientaciones que oscilaban entre -90° y + 90°. Las células cuadradas exhibían filamentos de actina organizados en tres dominios angulares principales: 0° a 25°, 50° a 90° y -50° a -90°, mientras que las células triangulares mostraron filamentos de actina organizados principalmente de acuerdo con los tres lados del patrón a 0°, 60° y -60°. Curiosamente, encontramos que los filamentos de actina estaban altamente orientados en paralelo al eje de célula larga (0°) para células rectangulares de relaciones de aspecto de 1:4 (CSI = 0,50) y 1:7 (CSI = 0,34). La cuantificación de adherencias que contienen vinculinas no indicó diferencias estadísticas de áreas de adhesión entre morfologías celulares (Suplemento Fig. 5A-C), mientras que la orientación de las adherencias focales fue modulada por la forma celular (Suplemento Fig. 5D,E), como se observa para los filamentos de actina. Nuestros hallazgos muestran que los mioblastos rectangulares 1:4 y 1: 7 permiten una organización más fuerte del citoesqueleto de actina (Fig. 2C) y adherencias focales, lo que sugiere que la elongación mioblástica conduce a la formación de dipolos contráctiles.

Considerando el papel del núcleo celular en la diferenciación de mioblastos en miotubos, investigamos a continuación si los cambios en la forma celular y la arquitectura del citoesqueleto pueden modular la forma y la orientación del nucleo36. Encontramos que la relación de aspecto nuclear aumentó significativamente con la reducción del CSI (Fig. 2D). De hecho, las células redondeadas (CSI = 1) en micropatterns circulares mostraron un núcleo redondeado caracterizado por una relación de aspecto promedio de 1,11 ± 0,06, mientras que las células rectangulares con una relación de aspecto de 1:4 (CSI = 0,50) y 1:7 (CSI = 0,34) exhibieron grandes deformaciones nucleares con relaciones de aspecto de 1,39 ± 0,21 y 2,19 ± 0,23, respectivamente. También notamos que la orientación del núcleo estaba modulada por la morfología celular (Fig. 2E). Encontramos que la orientación del núcleo en células redondeadas, cuadradas y triangulares abarcaba una amplia gama de ángulos (de ~15° a ~60°), con una orientación promedio de ~40° (circular, n = 11), ~33° (cuadrado, n = 14) y ~43° (triángulo, n = 10) en relación con el eje horizontal. Para celdas rectangulares, nuestros resultados indicaron que el núcleo estaba orientado paralelo al eje celular con un ángulo promedio de ~14° (1:4, n = 15) y ~2° (1:7, n = 10).

La elongación celular mejora la contractilidad de los mioblastos

La siguiente pregunta que abordamos fue cómo los cambios en la forma celular afectan la contractilidad de los mioblastos. Para responder a esta pregunta, utilizamos microscopía de fuerza de tracción (TFM) para determinar las tensiones de tracción ejercidas por los mioblastos micropatterados. Como se muestra en la Fig. 3A Observamos que las tensiones máximas se ejercían en las extremidades de los mioblastos micropatterados, independientemente de la forma celular. Como se observó previamente en otra celda types37, contráctil estrés acumulado preferentemente en las esquinas (cuadrados y triángulos) o en ambas extremidades (1:4 y 1:7 rectángulos) de micropatterned de mioblastos. Se cuantificó el esfuerzo total ejercido por los mioblastos micropatterados individuales para determinar si la morfología celular modula la contractilidad celular. Como se muestra en la Fig. 3B, las células redondeadas (CSI = 1) ejercieron un esfuerzo total de 170,7 ± 46,4 N/m2, mientras que las células rectangulares (CSI = 0,34, relación de aspecto 1:7) ejercieron una mayor cantidad total de esfuerzo (295,9 ± 156.8 N / m2), lo que sugiere que las formas alargadas de las células conducen a un aumento de las tensiones de tracción. Además, encontramos que las células de forma rectangular (CSI = 0,34, relación de aspecto 1:7) exhibían el mayor valor de esfuerzo máximo (684,3 ± 257,8 Pa, Fig. 3C), mientras que los mioblastos redondeados mostraron el valor de esfuerzo máximo más bajo (351,5 ± 123,6 Pa). Teniendo en cuenta que las tensiones contráctiles se ejercían en la periferia celular y que la reducción de la ICS conduce a un aumento de las tensiones de tracción, trazamos el valor máximo de tensión en función de la distancia desde el centro de masa hasta la extremidad de la célula (Fig. 3D), lo que representa el 22,6 µm (CSI = 1), 28.28 µm (CSI = 0.79), 33.98 µm (CSI = 0.60), 41.23 µm (CSI = 0.50) y 53.45 µm (CSI = 0.34). Como se muestra en la Fig. 3D, encontramos que el estrés contráctil máximo aumentaba linealmente con la distancia desde el centroide hasta la extremidad de la célula (R2 = 0,958, n = 65), lo que sugiere que las morfologías alargadas de los mioblastos ejercen más fuerzas de tracción.

Para determinar la contribución de la red de actomiosina en el establecimiento de fuerzas contráctiles en mioblastos, las células C2C12 se trataron con el fármaco secuestrador de actina G Latrunculina B (LatB) y con el inhibidor de miosina II Blebbistatina (Bleb). Los mioblastos inmunotenidos con faloidina indicaron que las células tratadas con LatB y Bleb exhibían una red difusa de actina (Fig. 3E), demostrando que ambos fármacos afectaron significativamente la organización de la actina-F. Utilizamos TFM en mioblastos micropatterizados tratados con ambos fármacos para determinar el papel de la red de actomiosina en el establecimiento de fuerzas contráctiles en mioblastos de diferentes geometrías. Nuestros hallazgos indican que el tratamiento con LatB indujo una pérdida significativa de contractilidad, que aumentó con la elongación celular. De hecho, las células redondeadas mostraron una pérdida de estrés contráctil de ~62%, mientras que las células rectangulares de 1:4 y 1:7 tratadas con LatB se caracterizaron por una pérdida de estrés contráctil de ~88% y ~86%, respectivamente (Fig. 3F). Además, encontramos que el estrés contráctil de 1:4 células rectangulares tratadas con Bleb se caracterizaron por una pérdida de ~80% de la fuerza contráctil, demostrando que los motores moleculares de la miosina II son actores clave de las fuerzas contráctiles de los mioblastos.

Tomados en conjunto, estos resultados indican que la contractilidad de la red de actomiosina se mejora en los mioblastos alargados mediante el establecimiento de una red densa de fibras de actomiosina paralelas.

La contractilidad de los pares celulares aumentó después de su fusión y se elevó en micropatterns alargados

Para comprender cómo la morfología de los mioblastos puede afectar las propiedades contráctiles de los miotubos, consideramos un modelo mínimo de dos mioblastos. En primer lugar, determinamos las fuerzas de tracción ejercidas por los dobletes de células en P1 (24 h en medios de proliferación) chapados en micropatterns de formas variables (Fig. 6A). No hubo diferencias estadísticas de estrés contráctil entre el amplio rango de ICS (Suplemento Fig. 6B), a pesar de una orientación bien definida de la red de actinas (Suplemento Fig. 6C)y los núcleos (Suplemento Fig. 6D, E) en micropatterns rectangulares de 1:4 y 1:7. A partir de esta observación, se cuantificó el esfuerzo contráctil ejercido por los dobletes celulares cultivados en micropatterns FN circulares (CSI = 1) y rectangulares (CSI = 0,50, relación de aspecto 1:7) durante cinco días adicionales (D5, Fig. 1H) en medio de diferenciación. Utilizamos CMXRos rojos de MitoTracker (ThermoFisher Scientific), una tinción mitocondrial viva, para asegurar que los dobletes de mioblastos estuvieran fusionados (Fig. 4A) 38. Como se muestra en la Fig. 4B, C, encontramos que el esfuerzo contráctil total aumentó ligeramente en dobletes de células fusionadas cultivados en micropatterns circulares (267 ± 64 Pa) en comparación con dobletes de células circulares sin fusionar (157 ± 37 Pa), mientras que los dobletes alargados fusionados fueron más de dos veces más contráctiles (543 ± 193 Pa) que los dobletes alargados sin fusionar (211 ± 73 Pa). Estos resultados indican que la contractilidad celular aumentó después de la fusión celular y se mejoró significativamente para morfologías alargadas.

La contractilidad de la actomiosina promueve la diferenciación de los miotubos

Luego preguntamos si la contractilidad de la actomiosina de los mioblastos podría influir en la diferenciación de los miotubos. Los mioblastos de C2C12 se cultivaron en sustratos recubiertos de FN en medios de proliferación durante 2 días (P2, Fig. 1H) para llegar a la confluencia celular. Luego, se agregaron LatB o Bleb durante 30 minutos y el medio de proliferación se reemplazó por un medio de cultivo de diferenciación. Después de 4 días en medio de diferenciación (D4, Fig. 1H), las células C2C12 se fijaron y teñieron para ADN y troponinta, un marcador de diferenciación (Fig. 5). Se evaluó el efecto de los tratamientos con LatB y Bleb mediante tinción de alfa actinina sobre los miotubos de control (CTRL) y los miotubos tratados con Latrunculina B (+LatB) y blebistatina (+Bleb). Como se observa en la Fig. 7, los miotubos de control presentan patrones típicos de banda Z estriada, mientras que los tratamientos LatB y Bleb alteran los patrones de estriación en los miotubos. Los miotubos de control (CTRL) se caracterizaron por una relación de aspecto media de 7,99 ± 3,38 (Fig. 5A) y un área de troponina T positiva de 51,7 ± 5,6% (Fig. 5B). Nuestros hallazgos indican que los tratamientos LatB y Bleb disminuyeron la fracción del área de Troponina T a 44,9 ± 5,2% y 44,4 ± 5,1%, respectivamente. Además, encontramos que el índice de fusión fue estadísticamente más bajo para las células LatB (27 ± 3%) y tratadas con Blebb (29 ± 3%) que para las células control (38 ± 5%), lo que refuerza el papel de la contractilidad de la actomiosina en la diferenciación mioblástica (Fig. 5C). En conjunto, estos resultados indicaron que la contractilidad de la actomiosina de los mioblastos promueve la diferenciación de los miotubos.

La elongación de mioblastos desencadena la exportación nuclear de YAP, que es esencial para la diferenciación de mioblastos en miotubos

Para obtener más información sobre los mecanismos intracelulares que controlan la diferenciación de miotubos, consideramos el papel de YAP al determinar su localización en el citoplasma o en el núcleo de mioblastos, donde se une a y activa los factores de transcripción de TEAD39. Para ello, se cuantificó la relación citoplasmática / YAP nuclear en mioblastos micropatterados (Fig. 6A y Suplemento Fig. 8). Alargamiento de celda en 1:los micropatterns rectangulares 4 y 1:7 aumentaron la relación citosólica/YAP nuclear (Fig. 6B), lo que sugiere que la elongación celular desencadena la exportación nuclear de YAP a través de fuerzas de compresión nucleares ejercidas por la red de actomiosina 40. Para verificar si la localización de YAP en el citoplasma o en el núcleo está relacionada con etapas específicas del proceso de diferenciación, teñimos YAP en células C2C12 después de 24 h (P1) y 48 h (P2) del paso de proliferación y a las 96 h (D2) y 264 h (D9) del paso de diferenciación (Fig. 6C y Suplemento Fig. 9). Curiosamente, nuestros resultados indicaron que la relación citoplasmática/nuclear YAP aumentó de 0,37 ± 0,07 en P1 a 0,68 ± 0,06 en P2 y 0,67 ± 0,06 en D2 y luego disminuyó a 0,42 ± 0,10 en D9 (Fig. 6D). Curiosamente, se encontró que la relación citoplasmática / YAP nuclear en D9 no era estadísticamente diferente de los valores de P1, lo que sugiere que la relación citoplasmática/YAP nuclear en miotubos diferenciados es similar a la de los mioblastos. Para verificar estos resultados, recolectamos mioblastos en la etapa de proliferación P1 (24 h) y en la etapa de diferenciación D2 (96 h) y aislamos sus materiales citoplásmicos y nucleares. Se realizó un ensayo de proteína de ácido biciconínico (BCA) y se analizaron por electroforesis las proteínas contenidas en extracciones citoplasmáticas y nucleares (Fig. 6E). Nuestros hallazgos de Western blot indicaron que la relación citoplasmática/YAP nuclear aumentó de 0,62 ± 0,08 en P1 a 0,87 ± 0,24 en D2 (Fig. 6F). Esta cuantificación bioquímica de YAP demostró una exportación nuclear significativa de YAP en la diferenciación de células C2C12 y fortaleció nuestros hallazgos.

Con base en estos resultados, evaluamos el papel de YAP mediante el uso de leptomicina B para bloquear la exportación activa desde el núcleo mediante la unión directa a exportin141. De hecho, Alberto Elosegui-Artola y sus compañeros de trabajo han demostrado recientemente que la leptomicina B (LMB) se puede usar de manera eficiente para estudiar cómo las fuerzas contráctiles ejercidas por el citoesqueleto impulsan la traslocación nuclear de YAP39. Al tratar los mioblastos C2C12 en P2 (48 h) con MBL, encontramos que la relación citoplasmática a YAP nuclear era significativamente menor en las células tratadas con MBL en D2 (96 h, Fig. 6G), lo que sugiere que el YAP se concentra principalmente dentro del núcleo cuando se inhibe la exportación nuclear. Además, nuestros hallazgos indicaron que el índice de fusión en D4 de las células tratadas con LMB (Fig. 6H) fue muy baja (3,8 ± 1.5%) en comparación con las células de control (42,4 ± 9,1%), lo que demuestra que se requiere una exportación nuclear activa para la diferenciación de C2C12.