Los conjuntos de motivos diversos especifican actividades de unión de ADN no redundantes de miembros de la familia AP-1 en macrófagos

Análisis estadísticos

En la Fig. 1c, las diferencias en la expresión génica se probaron utilizando la prueba T independiente (grado de libertad = 1, de dos colas) en dos experimentos replicados (n = 2). Genes expresados diferencialmente en la Fig. 1b se identificaron utilizando EdgeR55 con parámetros predeterminados, y utilizando los cortes FDR < 0.cambio de 05 y log2 veces ≥2. En la Fig. 2c, las diferencias entre cada grupo (Veh, Compartido y KLA 1 h) se examinaron mediante la prueba T independiente (grado de libertad = 1, de dos colas); el número de loci en cada grupo para cada monómero es el siguiente ATF3 (Veh = 1447, Compartido = 7460, KLA = 6997), Jun (2390, 3751, 3401), JunD (1351, 5976, 6422). Significado para los motivos de la Fig. 4a se calculó utilizando la prueba de razón de verosimilitud (grado de libertad = 1) comparando las predicciones realizadas por el modelo de TBA completo y el modelo de TBA perturbado en todos los loci unidos en macrófagos tratados con Veh para Atf3 (n = 23.160), Jun (n = 15.548) y JunD (n = 19.653). Significado para los motivos en la Fig. 4C se calculó utilizando la prueba de razón de verosimilitud (grado de libertad = 1) comparando las predicciones realizadas por el modelo de TBA completo y el modelo de TBA perturbado en todos los loci unidos por JunD en GM12878 (n = 7451), H1-hESC (n = 12.931), HepG2 (n = 41.318), K562 (n = 47.477) y SK-N-SH (38.960). Significado para los motivos de la Fig. 5b, Suplemento Fig. 5B, y Suplemento Fig. 5C se calculó utilizando la prueba de razón de verosimilitud (grado de libertad = 1) comparando las predicciones realizadas por el modelo de TBA completo y el modelo de TBA perturbado en todos los loci enlazados en macrófagos tratados con KLA para Atf3 (n = 36.745), Jun (n = 17.481), JunD (n = 31.641), Fos (n = 24.365), Fosl2 (n = 10.619) y JunB (n = 13.376). Valores de significación para la Fig. 6f y S6F se calcularon utilizando la prueba F; el número de loci analizados para monómeros en macrófagos tratados con vehículos son ATF3 (n = 4163), Jun (n = 3004) y JunD (n = 4148); el número de loci analizados para monómeros en macrófagos tratados con KLA son: Atf3 (n = 4577), Jun (n = 3232), JunD (n = 4366), Fos (n = 4477) y JunB (n = 3616).

Generando un genoma personalizado para BALB/cJ

Un genoma personalizado para BALB / cJ reemplazando las posiciones invariantes del genoma mm10 con alelos reportados por el Proyecto de Genomas de Ratón (archivo VCF de la versión 3)43. Para C57BL / 6J se utilizó el genoma de referencia mm10 del navegador de genoma de la UCSC. Para permitir comparaciones entre BALB / cJ y C57BL/6J durante el análisis, las coordenadas del genoma personalizado para BALB/cJ se cambiaron para que coincidieran con las posiciones del genoma de referencia mm10 utilizando MARGE34. No analizamos ninguna lectura que estuviera dentro de las eliminaciones en BALB/cJ. Las lecturas superpuestas con una inserción se asignaron a la última posición superpuesta en la deformación de referencia.

El análisis de los picos de CHIP-seq

Las lecturas de secuenciación de los experimentos de ChIP-seq se asignaron al ensamblaje mm10 del genoma de referencia del ratón (o el genoma personalizado de BALBc/J) utilizando la última versión de Bowtie2 con parámetros predeterminados56. Lecturas mapeadas de ChIP-seq para identificar supuestos sitios de unión de TF con el comando HOMER57 findPeaks (con parámetros de tamaño 200-L 0-C 0-fdr 0.9), utilizando el experimento de ChIP de entrada correspondiente a la condición de tratamiento. Para reducir el número de picos falsos positivos, calculamos el IDR en cada pico (utilizando la versión 2.0.3 del programa idr) con la puntuación máxima de HOMER calculada para cada experimento replicado como entrada a IDR y luego filtró todos los picos que tenían IDR ≥ 0.0558. Motivos de novo fueron calculados con el HOMERO findMotifsGenome.pl comando con parámetros predeterminados. El enriquecimiento de motivos de novo se calculó utilizando la findKnownMotifs.pl programa en HOMER con parámetros predeterminados.

La cuantificación de las lecturas de expresión de ARN generadas a partir de experimentos de ARN-seq se alinearon con el genoma de referencia de ratón mm10 (o el genoma personalizado de BALBc/J) utilizando alineador ESTELAR con parámetros predeterminados59. Para cuantificar el nivel de expresión de cada gen, calculamos el RPKM con las lecturas que estaban dentro de un exón. Se utilizaron lecturas de secuenciación no normalizadas para identificar genes expresados diferencialmente con EdgeR55; se consideraron genes con FDR < 0,05 y un cambio en la expresión entre dos condiciones experimentales expresadas diferencialmente dos veces o más. Para cuantificar la expresión de los ARN nacientes, anotamos nuestros picos ChIP-seq con el número de lecturas GRO-seq (normalizadas a 10 millones) que estaban dentro de los 500 bps del centro del pico utilizando el HOMER annotatePeaks.pl comando.

Entrenamiento del modelo TBA

Para cada monómero AP-1 bajo cada condición de tratamiento, entrenamos un modelo para distinguir los sitios de unión para cada monómero de un conjunto de loci genómicos seleccionados aleatoriamente. El conjunto de loci de fondo aleatorios utilizados para entrenar cada modelo se seleccionó de acuerdo con los siguientes criterios: (1) la distribución del contenido de GC de los loci de fondo coincide con el contenido de GC de los sitios de enlace para un monómero dado, (2) no contiene posiciones ambiguas o no aplicables, y (3) el número de secuencias de fondo coincide con el número de sitios de enlace k. Para cada una de las secuencias en el conjunto combinado de los sitios de encuadernación y los loci de fondo, calculamos la puntuación log-odds más alta (también conocida como puntuación de motivo) para cada uno de los n motivos que se incluirán en el model60 Se consideraron coincidencias de motivos en ambas orientaciones. Las puntuaciones Log-odds inferiores a 0 se establecieron en 0. Por procedimientos de preprocesamiento estándar antes de entrenar un modelo lineal, estandarizamos las puntuaciones log-odds para cada motivo, escalando el conjunto de puntuaciones para cada motivo de modo que el valor medio sea 0 y la varianza sea 1. La estandarización escala las puntuaciones de todos los motivos en el mismo rango (los motivos más largos tienen una puntuación máxima mayor) y también ayuda a reducir el efecto de la multicolinealidad en el entrenamiento del modelo. Por lo tanto, las características utilizadas para entrenar nuestro modelo son una matriz n por 2k de puntajes de probabilidades logarítmicas estandarizados en cada fila. Para generar la matriz de etiquetas correspondiente, asignamos a cada sitio de enlace una etiqueta de 1 y a cada loci de fondo una etiqueta de 0. Usando esta matriz de características y matriz de etiquetas, entrenamos pesos para cada motivo utilizando un modelo de regresión logística penalizado L1 implementado por el paquete scikit-learn Python 61. Los pesos de Motif que se muestran en nuestro análisis son los valores medios de cinco rondas de validación cruzada, utilizando el 80% de los datos para el entrenamiento y el 20% para las pruebas en cada ronda. Se entrenaron modelos para CHIP-seqs generados en este estudio, así como datos descargados del Omnibus de Expresión Génica NCBI (número de acceso GSE46494) y el portal de datos de codificación (https://www.encodeproject.org).

Cuantificación de colinealidad múltiple

Para evaluar el alcance de la colinealidad múltiple en las características de la puntuación motif que utilizamos para entrenar a nuestros modelos, tomamos cada matriz de características correspondiente a cada experimento y calculamos el VIF para cada motif38. Para calcular el VIF, en primer lugar determinamos el coeficiente de determinación, R2, para cada motivo mediante la regresión de las puntuaciones log-odds de un motivo frente a las puntuaciones log-odds de los motivos restantes. A continuación, utilizando el coeficiente de determinación, la tolerancia para cada motivo se puede calcular como la diferencia entre 1 y el coeficiente de determinación (1 − R2). El VIF es el recíproco de la tolerancia \(\frac{1}{{1-R^2}}\). Utilizamos el módulo linear_model del paquete sklearn Python para calcular el coeficiente de determinación.

Agrupamiento y fusión de motivos

Anotamos la similitud de todos los pares de motivos de secuencia de ADN calculando la correlación de Pearson de las matrices de probabilidad de posición alineada (PPM) correspondientes a un par dado de motifs62. La correlación de Pearson para un par de motivos a y B de longitud que se calcula mediante la fórmula:

Pmp primero fueron alineadas utilizando el Smith–Waterman alineación algorithm63. Los motivos más cortos están acolchados con valores de frecuencia de fondo antes de la alineación. No se permitieron huecos en el alineamiento y cada posición en el alineamiento fue puntuada con la correlación de Pearson. La correlación de Pearson se calculó utilizando la alineación óptima. A continuación, los conjuntos de motivos que tienen PPM con una correlación de Pearson de 0,9 o mayor se fusionaron alineando iterativamente cada PPM dentro del conjunto, y luego promediando las frecuencias de nucleótidos en cada posición.

La evaluación de la importancia de los motivos para TBA

los valores de p para TBA se calcularon utilizando la prueba de la razón de log verosimilitud. Cada motivo se eliminó del conjunto de características utilizadas para entrenar un modelo TBA perturbado (utilizando validación cruzada de cinco veces). Luego utilizamos el modelo completo (que contiene todos los motivos) y el modelo perturbado para calcular la probabilidad de observar la unión en todos los sitios de unión y secuencias de fondo para un monómero dado y todas las regiones de fondo. La diferencia en las probabilidades calculadas por el modelo completo y el modelo perturbado se utilizó para realizar la prueba de chi cuadrado para cada motivo. La prueba de chi-cuadrado se realizó utilizando el paquete de python scipy64.

Comparación con otros métodos

Bam motif y gkm-SVM se ejecutaron con parámetros predeterminados. Utilizamos la última versión de gkm-SVM a mayor escala, LS-GKM (compilado a partir del código fuente descargado de https://github.com/Dongwon-Lee/lsgkm el 25/8/16) y Bamm motif; v1.0 descargado de https://github.com/soedinglab/BaMMmotif39, 65. Ambos modelos fueron entrenados con validación cruzada de cinco veces. El rendimiento del modelo se calificó utilizando las funciones roc_auc_score y precision_score del módulo metrics de sklearn.

Predicción de cambios en la unión de AP-1 después de un tratamiento de KLA de una hora

Para predecir el cambio en la unión después del tratamiento de KLA, aprovechamos los pesos de los motivos aprendidos para cada uno de los motivos n (wn) por un modelo de TBA entrenado en los datos tratados con el vehículo (Wveh = ) y un modelo de TBA entrenado en los datos tratados con KLA de 1-h (Wkla = ) para cada monómero AP-1. El cambio previsto en la encuadernación para cada secuencia es entonces la diferencia entre el producto escalar de las puntuaciones de motivo estandarizadas calculadas para la secuencia de cada uno de los sitios de encuadernación k (Sk = ) con los pesos de motivo KLA y el producto escalar de las puntuaciones de motivo y los pesos de motivo Veh (Δkla−veh,k = Wkla⋅Sk − Wveh⋅Sk). Se hicieron predicciones para todos los loci genómicos que se cruzaron con un pico para uno de los monómeros AP-1 en el vehículo o en la condición de tratamiento de KLA.

Predicción de la unión específica de la deformación con TBA

Para predecir la unión específica de la deformación, aprovechamos los pesos de los motivos aprendidos para cada uno de los motivos n (wn) mediante un modelo TBA (W = ) para cada monómero AP-1 utilizando los datos de C57BL/6J, y las puntuaciones de los motivos calculadas para cada uno de los sitios de unión k utilizando la secuencia genómica para C57BL/6J y BALBc / J (SC57,k = , SBAL,k = ). A continuación, calculamos la diferencia de las puntuaciones de los motivos para C57BL6/J y BALBc/J (Dn = ) y, a continuación, estandarizamos las diferencias de puntuación para cada motivo en todos los sitios de unión k que tenían una mutación al comparar BALBc/J con C57BL/6J, obteniendo diferencias de puntuación de motivos estandarizadas para cada sitio de unión (Zn = standardize(Dn) = ). Finalmente, hicimos una predicción para la unión específica de deformación calculando el producto escalar de los pesos del motivo y la diferencia estandarizada de las puntuaciones del motivo entre C57BL6/EiJ y BALBc/J para el sitio de unión mutado kth (ΔC57−BAL = W⋅).

Entrenamiento del modelo TBA-2Strain

Para cada loci genómico que se intersectó con un pico para uno de los monómeros AP-1, en C57BL/6J o BALBc/J, calculamos la puntuación logopeda más alta para cada uno de los motivos n que se incluirán en el modelo, utilizando la secuencia genómica de ambas cepas, obteniendo dos conjuntos de puntuaciones de motivos para cada uno de los sitios de unión k (SC57,k = , SBAL,k = ). Se consideraron coincidencias de motivos en ambas orientaciones. Las puntuaciones Log-odds inferiores a 0 se establecieron en 0. Utilizando las puntuaciones de motivos, calculamos la diferencia estandarizada de las puntuaciones de motivos entre las dos cepas, como se describe en la sección anterior (Zn =). Por lo tanto, las características utilizadas para entrenar nuestro modelo son una matriz de n por k de puntajes de probabilidades logarítmicas estandarizados en cada fila. A continuación, calculamos la relación de plegado log2 del número de lecturas de CHIP-seq en C57BL/6J en comparación con BALBc/J para representar el grado de unión específica a la deformación. Usando esta matriz de características, y estableciendo la relación de plegado log2 de unión entre las dos cepas como variable dependiente, entrenamos los pesos para cada motivo utilizando la regresión lineal implementada por el paquete scikit-learn Python. Los pesos de Motif que se muestran en nuestro análisis son los valores medios de cinco rondas de validación cruzada, utilizando el 80% de los datos para el entrenamiento y el 20% para las pruebas en cada ronda. Las predicciones para la unión específica de la deformación se pueden hacer utilizando los pesos calculados siguiendo el procedimiento de la sección anterior.

Protocolo de chip

La proteína A y G Dynabeads 50/50 mix de Invitrogen se demandan para ChIP (10001D, 10003D). La mezcla IP consta de 20 µL de perlas / 2 µg de anticuerpos por cada chip de 2 millones de células. Se eligieron anticuerpos contra miembros de la familia AP-1 para atacar regiones no conservadas a fin de minimizar el potencial de unión inespecífica. Los anticuerpos se enumeran en la Tabla suplementaria 3. Para la preparación, las perlas se lavaron con 2× 0,5% BSA–PBS, luego se incubaron los anticuerpos de las perlas con 0,5% BSA-PBS durante al menos 1 h en el rotador (4 °C). Lavar 2× con 0.5% de SC–PBS, luego resuspendido en tampón de dilución (Tritón al 1%, EDTA de 2 mM, NaCl de 150 mM, Tris–HCl de 20 mM (pH 7,4), 1 × Inhibidores de la proteasa). Doble reticulación para ChIP: El medio se decantó de las celdas en placas de 10 cm, se lavó una vez brevemente con PBS (RT). Se utilizó glutarato de disuccinimidilo (Pierce Cat # 20593) (diluido en DMSO a 200 mm)/PBS (RT) durante 10 min. Luego se añadió formaldehído a una concentración final del 1% durante 10 minutos adicionales. La reacción se apagó con 1: 10 1 M Tris pH 7,4 en hielo. Las células se recolectaron y lavaron dos veces con PBS frío, girando a 1000 × g durante 5 min. Aislamiento de núcleos y sonicación: Resuspender pellets de células en 1 ml de tampón de aislamiento de núcleos (50 mM Tris–pH 8.0, 60 mM KCl, 0.5% NP40) + PI e incubar en hielo durante 10 min. Centrifugar 2000 × g durante 3 min a 4 ° C. Resuspender los núcleos en 200 µL de tampón de lisis fresco (0,5% SDS, EDTA de 10 mM, EGTA de 0,5 mM, Tris–HCl de 50 mM (pH 8)) + PI. Sonicación: Los núcleos se sonicaron (10 millones de células) durante 25 minutos en un Biorupter (configuración = 30 s = Encendido, 30 s = Apagado, Medio) utilizando tubos de pared delgada (Diagenode Cat# C30010010). Después de la sonicación, velocidad máxima de giro durante 10 minutos a 4 ° C. Configuración del chip: El ADN sonicado se diluyó 5× con tampón de dilución 800 (Tritón al 1%, EDTA de 2 mM, NaCl de 150 mM, Tris–HCl de 20 mM (pH 7,4), inhibidores de proteasa de 1×). Se elimina una alícuota para las muestras de entrada (5%). Muestras a 4 °C durante la rotación. Lavado: Las virutas se lavan 1× con TSE I (20 mm Tris–HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA), 2× con TSE III (10 mM Tris–HCl pH 7,4, 250 mM LiCl, 1% IGEPAL, 1% desoxicolato, 1 mM EDTA), 1× con TE + 0,1% Triton X-100, transfiera a un tubo nuevo y luego lave otro tiempo con TE + 0,1% Triton X-100. Elución: Elute con tampón de elución de 200 µL (1% SDS, 10 mM Tris pH 7,5) durante 20 min en RT, agitando en el vórtice o en un nutador o rotador. Des-reticulación: Añadir 10 µL de NaCl de 5 M e incubar a 65 ° C (o al menos 8 h). Limpie las muestras con el limpiador y Concentrador de ADN de CHIP Zymo. Elute en 100 µL. Tome 40 µL y proceda al protocolo de preparación de la biblioteca.

Aislamiento y fragmentación de ARN de PolyA

Aislamiento de ARN: El ARN se aisló utilizando reactivo TRIZOL (Ambion cat# 15596018) y mini kit de preparación de ARN ZOL DIRECTO (cat# 11-330MB). Aislamiento de ARN Poli-A: Use 0.2 ARN total como material de partida para una eficiencia de mapeo ideal y una clonalidad mínima. Recoger 10 µL de granos de oligo (dT) (NEB cat# S1419S) por muestra de ARN. Las perlas se lavaron dos veces con 1 × DTBB (20 mM Tris–HCl pH 7,5, 1 M LiCl, 2 mM EDTA, 1% LDS, 0,1% Triton X-100). Las perlas se resuspendieron en 50 µL de 2 × DTBB. Se mezclaron 50 µL de perlas con 50 µL de ARN y se calentaron a 65 °C durante 2 min. Las perlas de ARN se incubaron durante 10 minutos en RT mientras giraban. Las perlas de ARN se recogieron en un imán y se lavaron 1× cada una con ARN WB1 (10 mM Tris–HCl pH 7,5, 0,12 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% LDS, 0.Tritón X-100 al 1%) y WB3 (Tris–HCl de 10 mM pH 7,5, 0,5 M LiCl, EDTA de 1 mM). Añadir 50 µL de Tris-HCl pH 7,5 y calentar a 80 ° C durante 2 minutos para eluir. Recoja ARN y realice una segunda recolección de cuentas Oligodt. Después de lavar la segunda colección, en lugar de elutar fue de 1× con 1× tampón de primera hebra; 250 mM Tris-HCl (pH 8,3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2 (kit de Termofisher SSIII Cat# 18080093). Fragmentación: A continuación, añadir 10 µL de tampón de primera hebra de 2× más TDT de 10 mM y fragmento de ADN a 94 °C durante 9 min. Recoja perlas en el imán y transfiera eluido que contiene ARNm fragmentado a una nueva tira de PCR. Debe recuperar 10 µL de ARN fragmentado. Síntesis de primera hebra: Mezclamos ARN fragmentado con imprimación aleatoria de 0,5 µL (3 µg/µL) Life Tech #48190-011, oligodt de 0,5 µL (50 µM del kit SSIII), dNTPs de 1 µL (Life Tech de 10 mM, cat 18427088) y SUPERasa de 0,5 µL (ThermoFisher Cat#AM2696) y calentamos 50 °C durante 1 min. Colóquelo inmediatamente en hielo. Luego agregamos 5,8 µL ddH2O, 0,1 µL de actinomicina (2 µg/µL Sigma cat#A1410), 1 µL de TDT (100 mM Life Tech cat# P2325), 0,2 µL de Interpolación al 1% y 0,5 µL de Superíndice III e incubamos a 25 °C durante 10 min, luego a 50 °C durante 50 min. Limpieza de cuentas: Agregamos 36 µL de RNAClean XP (Ampure XP) y mezclamos, incubando durante 15 min en hielo. Las perlas se recogieron en un imán y se lavaron 2× con etanol al 75%. Las perlas se secaron al aire durante 10 minutos y se elutaron con 10 µL de síntesis de H2O libre de nucleasas. Se mezclaron 10 µL de ADNc/ARN con 1,5 µL de Tampón azul de 10× (Enzimática cat# B0110L), 1 µL de mezcla dUTP/dNTP (10 mM de Affymetrix cat# 77330), 0,1 µL de dUTP (100 mM de Affymetrix cat# 77206), 0,2 µL de RNasa H (5 U/µL de Enzimática cat# Y9220L), 1 µL de ADN polimerasa I (Enzimática de 10 U/µL cat#P7050L), 0,15 µL 1% de interpolación-20 y 1.05 µL de agua libre de nucleasas. La reacción se incubó a 16 °C durante 2,5 h. Limpieza del cordón: El ADN se purificó añadiendo 1 µL de Seradyn 3 SpeedBeads EDAC (Termo 6515-2105-050250) por reacción en 28 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (concentración final del 13%) e incubando en RT durante 10 min. Las perlas se recogieron en un imán y se lavaron 2× con etanol al 80%. Las perlas se secaron al aire durante 10 minutos y se eluyeron en 40 µL de agua libre de nucleasas. El ADN está listo para la biblioteca.

Protocolo de preparación de biblioteca

Reparación final de dsDNA: Mezclamos 40 µL de ADN de protocolos de ChIP o ARN con 2,9 µL de H2O, 0.5 µL 1% de interpolación-20, 5 µL tampón de ligasa 10× T4 (Enzimática cat# L6030-HC-L), 1 µL de mezcla dNTP (10 mM Affymetrix 77119), 0,3 µL de POL de ADN T4 (Enzimática P7080L), 0,3 µL de PNK T4 (Enzimática Y9040L), 0,06 µL de Klenow (Enzimática P7060L) e incubado durante 30 min a 20 °C. Se añadió 1 µL de cabezales Seradyn 3 EDAC (Thermo 6515-2105-050250) en 93 µL de PEG8000 al 20%/2,5 M NaCl (13% final) y se incubó durante 10 min. Limpieza de cuentas: Las cuentas se recogieron en un imán y se lavaron 2× con etanol al 80%. Las perlas se secaron al aire durante 10 minutos y luego se eluyeron en 15 µL ddH2O. El ADN se mezcló con 10.8 µL ddH2O, 0,3 µL 1% Tween-20, 3 µL Tampón Azul (Enzimática cat# B0110L), 0,6 µL dATP (10 mM Tech 10216-018), 0,3 µL Klenow 3-5 Exo (Enzimática P7010-LC-L) e incubado durante 30 min a 37 °C. 55,8 µL 20% PEG8000/2,5 M NaCl (13% final) se añadió una incubada durante 10 min. Luego se hizo la limpieza de cuentas. Las perlas se eluyeron en 14 µL. Ligadura de adaptador en forma de Y. La muestra se mezcló con 0,5 µL de un adaptador de código de barras BIOO (BIOO Scientific cat # 514104), 15 µL de Tampón de Ligadura Rápida (Enzimática cat@ L603-LC-L), 0,33 µL de Interpolación al 1%-20 y 0.5 µL de ligasa de ADN T4 HC (Enzimática L6030-HC-L) e incubada durante 15 min en RT. Se añadieron 7 µL de PEG8000/2,5 M NaCl al 20% y se incubaron durante 10 min en RT. Se realizó limpieza de los cordones y se eluyeron los cordones en 21 µL. Se utilizaron 10 µL para amplificación de PCR (14 ciclos) con cebadores IGA e IGB (AATGATACGCGACCACGA, CAAGCAGAAGACGGCATACGA).

GRO-seq

La transcripción naciente fue capturada por la secuenciación nuclear de ejecución global (GRO-seq). Se aislaron núcleos de TGEM utilizando lisis hipotónica (10 mM Tris–HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 3 mM CaCl2; 0.1% de IGEPAL CA-630) y congelado en fase instantánea en tampón GRO-congelación (50 mm Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl2, 40% de glicerol). Corran. Núcleos BMDM de 3-5 × 106 se ejecutaron con NTPs marcados con BrUTP con tampón NRO de 3× (Tris-Cl de 15 mM (pH 8,0), MgCl2 de 7,5 mM, TDT de 1,5 mM, KCl de 450 mM, 0,3 U/µL de SUPERasa In, Sarkosil de 1,5%, ATP de 366 µM, GTP (Roche), Br-UTP (Sigma 40 Aldrich) y CTP de 1,2 µM (Roche, para limitar el rodaje longitud de ~40 nucleótidos)). Las reacciones se detuvieron después de 5 minutos mediante la adición de 500 µL de reactivo Trizol LS (Invitrogen), en vórtice durante 5 minutos y se extrajo y precipitó ARN según lo descrito por el fabricante. Los gránulos de ARN se resuspendieron en 18 µL ddH2O + 0,05% de interpolación (dH2O + T) y 2 µL de mezcla de fragmentación (100 mMZnCL2, 10 mM Tris–HCl (pH 7,5)), luego se incubaron a 70 °C durante 15 min. La fragmentación se detuvo mediante la adición de 2,5 µL de EDTA de 100 mm. Enriquecimiento de BrdU. El enriquecimiento de BrdU se realizó utilizando anticuerpos BrdU (IIB5) y perlas de CA (Santa Cruz, sc-32323 AC, lote #A0215 y #C1716). Las perlas se lavaron una vez con tampón de unión GRO (tampón salino-fosfato de sodio-EDTA (SSPE), interpolación de 0,05% (vol/vol), NaCl de 37,5 mM, EDTA de 1 mM) + NaCl de 300 mM, seguido de tres lavados en tampón de unión GRO y resuspendido como lechada de 25% (vol/vol) con SUPERasa de 0,1 U/µL. Para fragmentar el ARN, se agregaron 50 µL de tampón de unión GRO frío y 40 µL de perlas de anticuerpos BrdU equilibrados y las muestras giraron lentamente a 4 °C durante 80 min. Las perlas se hilaron posteriormente a 1000 × g durante 15 s, se eliminó el sobrenadante y las perlas se transfirieron a una columna MC ultrafree Millipora (UFC30HVNB; Miliporo) en tampón de unión GRO de 2 × 200 µL. La reacción IP se lavó dos veces con tampón de unión GRO de 400 µL antes de que el ARN se eluyera mediante incubación en 200 µL de Trizol LS (termofisher) bajo agitación suave durante 3 min. La elución se repitió por segunda vez, se añadieron 120 µL de dH2O + T para aumentar el sobrenadante y se extrajeron según lo descrito por el fabricante. Reparación y decapado de los extremos: Para la reparación y el decapado de los extremos, los gránulos de ARN se disolvieron en 8 µL TET (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20) mediante un vórtice vigoroso, se calentaron a 70 °C durante 2 min y se colocaron en hielo. Después de un giro rápido, se añadió una mezcla maestra de reparación de 22 µL (tampón de 3 µL 10× PNK, 15,5 µL dH2O + T, 0,5 µL de Inhibidor de superasa en RNasa (10 U), 2 µL PNK (20U), 1 µL RppH (5U)), se mezcló y se incubó a 37 °C durante 1 h. Para fosforilar el 5’end, se añadió posteriormente 0,5 µL de ATP de 100 mM y las reacciones se incubaron durante otros 45 min a 37 °C (la alta concentración de ATP apaga la actividad RppH). Tras la reparación final, se añadieron 2,5 µL de EDTA de 50 mM, se mezclaron las reacciones y se calentaron a 70 ° C durante 2 minutos antes de colocarse en hielo. Se realizó un segundo enriquecimiento de BrdU, como se ha detallado anteriormente. Los gránulos de ARN se disolvieron en 2,75 µL TET + 0,25 µL de adaptador Illumina TruSeq 3 ‘ (10 µM), se calentaron a 70 °C durante 2 minutos y se colocaron en hielo. se añadió 7 de 3 ‘ master mix (4,75 µL 50% PEG8000, 1 µL tampón de ARN ligasa 10× T4, 0,25 µL de SUPERasa, 1 µL de ARN Ligasa T4 2 truncado (200U; NEB)), se mezcló bien y las reacciones se incubaron a 20 °C durante 1 h. Las reacciones se diluyeron mediante la adición de 10 µL de TET + 2 µL de EDTA de 50 mm, se calentaron a 70 °C durante 2 min, se colocaron en hielo y una tercera ronda de Se realizó enriquecimiento BrUTP. Los gránulos de ARN se transfirieron a tiras de PCR durante el lavado y secado con etanol al 75%. Las muestras se disolvieron en 4 µL de TET (10 mM de Tris–HCl (pH 7,5), 0,1 mM de EDTA, 0,05% de interpolación 20) + 1 µL de imprimación de transcripción inversa (RT) de 10 µM. Para el recocido del prímero RT, la mezcla se incubó a 75 ° C durante 5 min, 37 °C durante 15 min y 25 °C durante 10 min. Para ligar el adaptador Illumina TruSeq de 5’, 10 µL de mezcla de 5 ‘ master (1,5 µL dH2O + 0,2% Tween 20, 0,25 µL adaptador de 5’TruSeq desnaturalizado (10 µM), 1,5 µL tampón de ARN ligasa 10× T4, 0,25 µL de SUPERasa In, 0,2 µL de ATP de 10 mM, 5,8 µL de PEG8000 al 50%, 0,5 µL de ARN ligasa 1 T4 (5U; NEB)) y las reacciones se incubaron a 25 °C durante 1 h. La transcripción inversa se realizó utilizando Protoscript II (NEB) (4 µL 5× NEB tampón de primera marca (NEB; E7421AA), 0,25 µL de entrada de superasa, 0,75 µL de Protoscript II (150U; NEB)) a 50 °C durante 1 h. Después de la adición de 30 µL de mezcla maestra de PCR (25 µL 2× LongAmp Taq 2× Mezcla Maestra (NEB), 0,2 µL de imprimación delantera de 100 µM, 2,8 µL de betaína de 5 M y imprimación individual de código de barras de 2 µL de 10 µM), las mezclas se amplificaron (95 °C durante 3 min, (95 °C durante 60 s, 62 °C durante 30 s, 72 °C durante 15 s) x13, 72 °C durante 3 min). Las reacciones de PCR se limpiaron utilizando 1,5 volúmenes de SpeedBeads (GE Healthcare) en 2,5 M NaCl/20% PEG8000. El tamaño de las bibliotecas se seleccionó en geles de PÁGINA/TBE a 160-225 pares de bases. Las rebanadas de gel se trituraron girando a través de un tubo de PCR perforado de 0,5 mL colocado encima de un tubo de 1,5 mL. Se añadieron 150 µL de Gel EB (0,1% LDS, 1 M LiCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,8)) y la lechada se incubó bajo agitación durante la noche. Para purificar el ADN eluido, se añadió un tampón de unión de ADN de CHIP de Zimógeno de 700 µL en el tubo de 1,5 mL que contenía la rebanada de gel triturada y el Gel EB, mezclado mediante pipeteo y la suspensión transferida a una columna de ZymoMiniElute. Las muestras se hilaron primero a 1000 × g durante 3 minutos, luego a 10.000×g durante 30 segundos. Se eliminó el flujo y se lavaron las muestras con un lavabos Zymo de 200 µl (con EtOH). Los restos de gel se retiraron mediante movimiento y las columnas se lavaron mediante la adición de otro lavabos Zymo de 200 µL (con EtOH). Se eliminó el flujo, se secaron las columnas por centrifugación a 14.000 × g durante 1 minuto y se eluyó el ADN mediante la adición de 20 µL de secuenciación precalentada TET (10 mm Tris–HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20). Las bibliotecas fueron secuenciadas.

Las células de Western blotting

se lisaron con tampón de lisis Igepal (50 mm Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0.5% de Igepal) y las concentraciones de proteínas se determinaron con reactivo de ensayo de proteínas BioRad utilizando ASC como estándar. Las proteínas se separaron en geles gradientes Bis-Tris de 4-12% NuPage (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham). Las membranas se bloquearon en TBS con 0,1% de interpolación – 20 y 5% de ASC. Las membranas se secaron con el primario indicado durante la noche a 4 ° C. Se detectaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante utilizando el sistema de detección de transferencia de sangre occidental (Amersham) y ECL más.

Animales y cultivo celular

Los TGEM se recolectaron 3 días después de la inyección de ratones macho de 8 semanas C57Bl/6J o BALB / cJ, y se platearon a 20 × 106 células por placa de Petri de 15 cm en DMEM más FBS al 10% y 1× penicilina-estreptomicina. Un día después del recubrimiento, las células se suplementaron con medios frescos y se trataron con PBS (Veh) o KLA de 100 ng/ml durante 1 h, y luego se utilizaron directamente para análisis posteriores. La DMBI se produce por infección de DMBI con un retrovirus que contiene myc y Braf V600E66. Las células inmortalizadas crecen a lo largo de varias semanas. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los estándares éticos establecidos por el Comité Institucional Anual de Cuidado y Uso (IUCAC) de la Universidad de California, San Diego.

Producción de lentivirus

pLentiguide se modificó para contener un andamio U6-bsmbi-spgRNA y un promotor de CMV que impulsa tagBFP2. Se insertaron 2 guías CRISPR para cada objetivo mediante amplificación de PCR con el promotor H1 (sitio bsmbi/guía 1/andamio/promotor H1/guía 2/sitio bsmb1) para un total de 2 guías por virus (impulsadas por U6 y H1) (Tabla suplementaria 4). El virus se fabricó con el sistema pVSVg / ppAX2. Dos días después de la transfección, se recogió el medio y se centrifugó a 4 °C durante 2 horas a 20.000 × g. La pelotilla celular se reconstituyó durante la noche a 4 °C en OPTI-MEM y se almacenó a -80 °C.

La producción de CRISPR KO iBMDMs

KO iBMDMs se produjo utilizando infección lentiviral. iBMDM-CAS9-IRES-EGFP se infectaron con MOI 100, medido en células 293T, con Lentiblasto (OZ biosciences) (5 µL cada reactivo) en OPTI-MEM. Luego se centrifugó a 1300 g durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se retiraron medios y se suplementaron células en medios de médula ósea (30% de células L, 20% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina en DMEM) durante 2 días. Las células se clasificaron para la infección por expresión de un transgén en la secuencia viral (tagBFP2).

Resumen de informes

Más información sobre el diseño experimental está disponible en el Resumen de Informes de Nature Research vinculado a este artículo.

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